摘 要：食品安全事故頻發(fā)使得食品微生物檢測(cè)受到廣泛關(guān)注，本文全面回顧了食品微生物檢驗(yàn)的核心步驟與操作關(guān)鍵點(diǎn)，分析了樣品的采集、轉(zhuǎn)運(yùn)及初步處理這幾個(gè)階段，詳盡描述了培養(yǎng)基的選取、制備及其存儲(chǔ)方法，探討了微生物的隔離、培養(yǎng)和計(jì)數(shù)方法，指出了針對(duì)特定病原體、指示菌株及食品腐敗菌的識(shí)別技術(shù)，討論了記錄、分析和處理檢驗(yàn)結(jié)果的方法，旨在為食品微生物檢驗(yàn)的規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化提供理論參考。

關(guān)鍵詞：食品微生物檢驗(yàn)；樣品處理技術(shù)；培養(yǎng)基管理；微生物隔離

Key Procedures and Operational Points for Food Microbiological Testing

LUAN Jun， WANG Yu， XIE Jintong

（Animal， Plant and Food Testing Center of Nanjing Customs， Nanjing 210019， China）

Abstract： The frequent occurrence of food safety accidents has attracted widespread attention to food microbiological testing. This article comprehensively reviews the core steps and key operational points of food microbiological testing， analyzes the stages of sample collection， transportation， and preliminary processing， describes in detail the selection， preparation， and storage methods of culture media， explores the isolation， cultivation， and counting methods of microorganisms， points out the identification techniques for specific pathogens， indicator strains， and food spoilage bacteria， and discusses the methods of recording， analyzing， and processing test results， aiming to provide theoretical reference for the standardization and normalization of food microbiological testing.

Keywords： food microbiological testing; sample processing technology; cultivation medium management; microbial isolation

隨著食品產(chǎn)業(yè)的快速擴(kuò)展和消費(fèi)者對(duì)安全標(biāo)準(zhǔn)的不斷提高，傳統(tǒng)的食品微生物檢測(cè)方法已無(wú)法滿(mǎn)足現(xiàn)代需求。實(shí)施精確的微生物檢測(cè)，能夠有效地管理并預(yù)防食品介導(dǎo)的疾病傳播，降低發(fā)生食品安全事故的風(fēng)險(xiǎn)。面對(duì)日益嚴(yán)格的法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)，食品生產(chǎn)企業(yè)迫切需要更高效的檢測(cè)技術(shù)，促使產(chǎn)品始終符合安全規(guī)范。探索與總結(jié)食品微生物檢驗(yàn)的主要程序及其操作要點(diǎn)，對(duì)于增強(qiáng)行業(yè)的檢驗(yàn)?zāi)芰痛_保食品安全有著重要的現(xiàn)實(shí)價(jià)值。

1 采集與處理檢驗(yàn)樣品

1.1 采集檢驗(yàn)樣品

采集檢驗(yàn)樣品是食品微生物分析的初始步驟，其品質(zhì)決定了分析結(jié)果的可靠度與精確性。在進(jìn)行樣品采集過(guò)程中，需要維持無(wú)菌狀態(tài)，樣本不能受到外界微生物干擾。采樣器具及容器需進(jìn)行徹底消毒，并在使用前驗(yàn)證其無(wú)菌狀態(tài)。選取采樣地點(diǎn)時(shí)應(yīng)全面考慮樣品的代表性，保證采集的樣本能準(zhǔn)確反映出整個(gè)批次或生產(chǎn)過(guò)程的微生物條件[1]。采樣過(guò)程中要翔實(shí)記錄采樣的日期、時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件、采樣數(shù)量及任何可能影響檢測(cè)結(jié)果的異常情況，為后續(xù)的樣品分析和結(jié)果解讀提供數(shù)據(jù)信息支持。

1.2 樣品的運(yùn)輸與保存

樣本從采集地到實(shí)驗(yàn)室的運(yùn)輸及保存環(huán)節(jié)對(duì)微生物活性具有重大影響，尤其需注意在運(yùn)輸和保存過(guò)程中控制環(huán)境條件，如溫度和濕度。樣品通常需要在低溫環(huán)境下運(yùn)輸，并應(yīng)盡快進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。對(duì)于長(zhǎng)時(shí)間保存的樣品，應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)姆栏瘎⒋娣庞趯?zhuān)用的低溫設(shè)備中。不同類(lèi)型的食品樣品，如固體和液體，各有不同的保存條件要求。對(duì)易腐敗的食品樣品，在運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)使用冰袋或干冰來(lái)維持低溫，避免微生物的過(guò)度增長(zhǎng)而導(dǎo)致樣品性質(zhì)變化。當(dāng)樣品送達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，必須立即進(jìn)行登記，并根據(jù)既定程序進(jìn)行分類(lèi)存儲(chǔ)，保證每批樣品得到合理保存。

1.3 樣品前處理

樣品前處理是將取得的原始樣品轉(zhuǎn)換為適合進(jìn)行后續(xù)微生物分析的形態(tài)的重要過(guò)程，包括樣品的清洗、切割、稀釋和均質(zhì)化等多個(gè)步驟。在清洗環(huán)節(jié)中，應(yīng)使用無(wú)菌水或指定的清潔劑去除樣品表面的雜質(zhì)和外源微生物，清洗后的樣品需要用無(wú)菌紙巾或布輕輕擦干。處理需切割的樣品時(shí)，事先必須嚴(yán)格消毒所用的刀具和切割板。進(jìn)行樣品稀釋時(shí)，應(yīng)根據(jù)目標(biāo)微生物的生長(zhǎng)要求調(diào)整稀釋液的pH值和滲透壓。在均質(zhì)化階段，應(yīng)將樣品放入無(wú)菌的均質(zhì)袋中，并在均質(zhì)機(jī)中處理，此操作有助于打破樣品結(jié)構(gòu)，使微生物在液體中分布更均勻。

2 微生物培養(yǎng)基的制備

2.1 選擇合適的培養(yǎng)基

適宜的培養(yǎng)基可以顯著提升微生物的生長(zhǎng)和檢出速度，支持多樣微生物種類(lèi)生長(zhǎng)。在選擇培養(yǎng)基時(shí)，需要考量目標(biāo)微生物的特定生長(zhǎng)要求，選用富含必需營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基優(yōu)化生長(zhǎng)環(huán)境。選擇性培養(yǎng)基含有特定的抑制因子，用以抑制非目標(biāo)微生物，促進(jìn)目標(biāo)微生物的生長(zhǎng)和分離，這類(lèi)培養(yǎng)基常被用于病原體篩選[2]。差異培養(yǎng)基中添加的指示劑使得不同微生物在培養(yǎng)過(guò)程中顯示出獨(dú)特的顏色或形態(tài)變化，便于區(qū)分和識(shí)別。每個(gè)培養(yǎng)基的配方及其pH值都應(yīng)根據(jù)檢測(cè)目的和目標(biāo)微生物的特性進(jìn)行精細(xì)調(diào)整，提高培養(yǎng)的有效性。

2.2 培養(yǎng)基的滅菌與儲(chǔ)存

常見(jiàn)的滅菌技術(shù)包括高壓蒸汽滅菌、干熱滅菌和過(guò)濾滅菌等。高壓蒸汽滅菌是最常用的滅菌方法，適用于大多數(shù)水溶性培養(yǎng)基及其添加物，在一定壓力和溫度下處理，達(dá)到無(wú)菌的效果。對(duì)于熱敏感物質(zhì)，如血清或抗生素等，采用過(guò)濾滅菌方法，避免高溫可能引起的活性成分損害。滅菌完成的培養(yǎng)基應(yīng)存放在干燥、避光且清潔的環(huán)境中，避免環(huán)境因素對(duì)其質(zhì)量造成不利影響。固體培養(yǎng)基制備后還需在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行凝固處理，并檢查是否出現(xiàn)氣泡或裂縫。在儲(chǔ)存過(guò)程中，應(yīng)定期檢查培養(yǎng)基的狀態(tài)，觀察是否有水分丟失或污染現(xiàn)象，促使其在實(shí)際使用時(shí)保持最佳的培養(yǎng)條件。

3 微生物分離與培養(yǎng)

3.1 接種技術(shù)與無(wú)菌操作

在接種微生物時(shí)，操作人員需穿戴合適的防護(hù)服，如無(wú)菌手套、口罩和防護(hù)帽，并在無(wú)菌的操作臺(tái)上進(jìn)行。接種所用的工具，比如接種環(huán)或接種針，每次使用前都應(yīng)利用火焰或高壓蒸汽進(jìn)行徹底滅菌處理。在接種過(guò)程中，應(yīng)盡量避免接觸到非無(wú)菌物體的表面，并且操作時(shí)要輕柔，減少可能擾動(dòng)空氣中的微生物。接種完畢后，應(yīng)立刻將培養(yǎng)基移至適宜的培養(yǎng)條件中，盡量縮短暴露于空氣中的時(shí)間，防止空氣中各種微生物的侵入。

3.2 培養(yǎng)條件與時(shí)間控制

根據(jù)微生物的不同營(yíng)養(yǎng)需求，必須精確設(shè)定培養(yǎng)的溫度、濕度、pH值及氧氣供應(yīng)。大部分細(xì)菌的理想生長(zhǎng)溫度通常在35～37 ℃，而酵母和霉菌的適宜生長(zhǎng)溫度較低。培養(yǎng)基的pH值應(yīng)調(diào)整至最適合目標(biāo)微生物生長(zhǎng)的范圍，氧氣水平的調(diào)整也根據(jù)微生物是需氧還是厭氧的情況決定。

4 微生物計(jì)數(shù)

4.1 平板計(jì)數(shù)法

平板計(jì)數(shù)法是微生物定量分析中經(jīng)典的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于確定食品樣本中活性細(xì)菌的數(shù)目。將經(jīng)稀釋的微生物懸浮液均勻分布在固體培養(yǎng)基表面，待菌落在一定的孵化期后形成可見(jiàn)單體菌落[3]。每一個(gè)菌落均源于單一細(xì)胞，計(jì)算這些菌落可以估計(jì)原樣品中的微生物密度。在操作時(shí)，應(yīng)注意懸浮液在培養(yǎng)板上的均勻分布，防止菌落相互重疊，影響計(jì)數(shù)的精確性。為提升數(shù)據(jù)的精確性，一般需要制備多個(gè)稀釋級(jí)別的樣品，并選擇菌落數(shù)在30～300的培養(yǎng)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，增強(qiáng)數(shù)據(jù)的可信度。

4.2 濾膜法

濾膜法是一種檢測(cè)水樣及其他液體中微生物總數(shù)的常用技術(shù)，特別適用于微生物含量較低的樣品。具體方法為使用特定孔徑的濾膜過(guò)濾大量液體，攔截其中的微生物，并將濾膜轉(zhuǎn)移至富含營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基上，允許攔截的微生物在適宜條件下生長(zhǎng)并形成菌落。該方法中，選擇合適孔徑的濾膜至關(guān)重要[4]。在操作過(guò)程中，還應(yīng)注意控制濾膜的濕度，避免其過(guò)度干燥或潮濕，否則會(huì)影響微生物的復(fù)蘇與生長(zhǎng)。濾膜法的優(yōu)勢(shì)在于能夠處理大體積的樣品，提升低濃度微生物的檢出效率，且過(guò)程簡(jiǎn)潔、快速。但該方法可能需要特殊設(shè)備進(jìn)行濾膜的過(guò)濾與轉(zhuǎn)移，且對(duì)于黏稠或懸浮物含量高的樣品可能處理效果不佳。

4.3 其他計(jì)數(shù)方法

顯微鏡計(jì)數(shù)法指直接在顯微鏡下觀察和計(jì)算樣品中的微生物細(xì)胞數(shù)量，這種方法可以直接提供關(guān)于細(xì)胞形態(tài)和活性狀態(tài)的信息，但對(duì)操作者的技術(shù)要求較高，且可能受樣本制備質(zhì)量和微生物活性狀態(tài)的影響。流式細(xì)胞儀技術(shù)利用流體力學(xué)原理，將單個(gè)細(xì)胞限定在極小的體積中，利用激光照射并收集散射光及熒光信號(hào)精確測(cè)定細(xì)胞數(shù)量和分析細(xì)胞特性。

5 識(shí)別特定微生物

5.1 分析菌落形態(tài)學(xué)特征

在微生物檢驗(yàn)中，菌落的形態(tài)學(xué)特征是判斷微生物種類(lèi)的重要依據(jù)。菌落的大小、形狀、顏色、邊緣、質(zhì)地、表面光澤等，都是常用的判斷標(biāo)準(zhǔn)。菌落的大小通常與培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基的組成及微生物的生長(zhǎng)速率密切相關(guān)。常見(jiàn)的細(xì)菌菌落可能呈圓形、邊緣光滑或不規(guī)則，而霉菌和酵母的菌落較為松散或呈現(xiàn)多孔結(jié)構(gòu)。

菌落的顏色也是判定的重要依據(jù)，某些微生物，如金黃色葡萄球菌，常在固體培養(yǎng)基上形成黃色至金黃色的菌落，而大腸桿菌的菌落則多為白色或灰白色。菌落的氣味也可以作為輔助判斷的依據(jù)，尤其是在培養(yǎng)霉菌和酵母時(shí)，菌落可能會(huì)散發(fā)出特定的腐敗氣味或酒精氣味[5]。

5.2 生物化學(xué)測(cè)試

生物化學(xué)測(cè)試是指檢測(cè)微生物的代謝特征，進(jìn)一步識(shí)別特定微生物的一種方法。進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)可以觀察某些細(xì)菌是否能發(fā)酵特定糖類(lèi)，生成酸性產(chǎn)物或氣體，從而判斷其種類(lèi)。另一個(gè)常見(jiàn)的生物化學(xué)測(cè)試是氧化還原反應(yīng)試驗(yàn)，一些微生物能夠在無(wú)氧環(huán)境下進(jìn)行發(fā)酵反應(yīng)，而另一些需要氧氣。細(xì)菌的酶活性也是識(shí)別的重要依據(jù)，如催化酶、脲酶、淀粉酶等。利用這些生物化學(xué)反應(yīng)，結(jié)合培養(yǎng)基的顏色變化、氣體產(chǎn)生等現(xiàn)象，可以進(jìn)一步確認(rèn)或排除某些微生物。

5.3 分子生物學(xué)方法

分子生物學(xué)方法，尤其是聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)，是目前識(shí)別特定微生物中最為高效和準(zhǔn)確的手段之一。PCR技術(shù)應(yīng)用特異性引物擴(kuò)增目標(biāo)微生物的DNA片段，能夠在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物種類(lèi)的快速、準(zhǔn)確識(shí)別。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)結(jié)合熒光探針，能夠在擴(kuò)增過(guò)程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)微生物的數(shù)量變化，進(jìn)一步提高了檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度。此外，基因芯片技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)也為微生物的識(shí)別提供了強(qiáng)有力的工具，能夠同時(shí)檢測(cè)多種微生物的存在并進(jìn)行精確的分類(lèi)。

6 分析檢驗(yàn)結(jié)果

在食品微生物檢驗(yàn)中，應(yīng)詳細(xì)記錄所有相關(guān)信息，如樣品的編號(hào)、檢驗(yàn)日期、負(fù)責(zé)人員、采用的檢測(cè)方法、實(shí)驗(yàn)條件以及詳細(xì)的檢驗(yàn)結(jié)果和相關(guān)解釋?zhuān)瑯?gòu)建一個(gè)完整的檢驗(yàn)歷史檔案。在結(jié)果分析階段，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)的一致性和可信度，將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)值或預(yù)期結(jié)果進(jìn)行比較，判斷產(chǎn)品是否達(dá)到了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。在處理檢驗(yàn)數(shù)據(jù)時(shí)，應(yīng)特別注意異常數(shù)據(jù)的處理，可能涉及對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程或樣品處理方法的重新評(píng)估。在食品微生物檢驗(yàn)中，當(dāng)出現(xiàn)檢驗(yàn)結(jié)果的偏差時(shí)，必須仔細(xì)進(jìn)行復(fù)核和分析。需要復(fù)查原始數(shù)據(jù)和操作記錄，驗(yàn)證所有操作是否符合標(biāo)準(zhǔn)操作程序。如果操作確認(rèn)無(wú)誤，可能需要再次檢查和校正試劑和儀器，保證它們的性能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求。

7 結(jié)語(yǔ)

食品微生物檢驗(yàn)是保障食品安全和預(yù)防食源性疾病的核心環(huán)節(jié)，精細(xì)完成樣品處理、應(yīng)用培養(yǎng)技術(shù)、嚴(yán)格遵守操作流程和使用準(zhǔn)確的檢測(cè)手段，可以有效評(píng)價(jià)和控制食品中的微生物安全隱患。從事此領(lǐng)域工作的專(zhuān)業(yè)人員應(yīng)持續(xù)關(guān)注行業(yè)內(nèi)的科技發(fā)展，引入新技術(shù)和新方法，提升檢測(cè)的效率和精度。未來(lái)，隨著分子生物學(xué)、生物信息學(xué)及自動(dòng)化技術(shù)的持續(xù)進(jìn)步，食品微生物檢驗(yàn)技術(shù)將變得更加迅速、敏感和智能化，進(jìn)一步提升食品安全監(jiān)控的即時(shí)性和預(yù)見(jiàn)性，更好地保障消費(fèi)者的健康。

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基金項(xiàng)目：海關(guān)總署科研項(xiàng)目“蜂蜜中需氧芽胞桿菌檢測(cè)技術(shù)研究及應(yīng)用”（2024HK009）。