馬崇敬++徐丹丹++趙曉龍++殷博++單佳玉++原韜

摘 要：天然木質(zhì)纖維原料在世界范圍擁有極高的產(chǎn)量，是轉(zhuǎn)化生產(chǎn)天然綠色能源物質(zhì)的理想底物。但木質(zhì)纖維降解后成分復(fù)雜，特別是其中富含的五碳糖成分，很難被生物轉(zhuǎn)化菌種充分利用，定向轉(zhuǎn)化為某種單一產(chǎn)物。該文綜述了五碳糖的來(lái)源、含量以及在生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中的利用價(jià)值，概述了能夠利用五碳糖轉(zhuǎn)化乙醇的微生物種類，歸納了五碳糖轉(zhuǎn)化的生物學(xué)途徑和改造方法，并簡(jiǎn)要介紹了由木質(zhì)纖維原料降解產(chǎn)生五碳糖和高效利用五碳糖及五、六碳糖混合物進(jìn)行轉(zhuǎn)化研究方面的科技進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：天然木質(zhì)纖維 五碳糖 生物轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào)：TS262.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-098X（2014）06（c）-0044-01

目前，發(fā)酵法生產(chǎn)的燃料乙醇是公認(rèn)的較為理想的清潔新能源轉(zhuǎn)化方式。巴西、美國(guó)、歐盟等國(guó)家紛紛提高乙醇在燃油中的添加量，提高新的能源在燃料中的組成比例。我國(guó)同樣面臨能源緊缺和能源安全問(wèn)題，在眾多糧食作物的副產(chǎn)品及眾多非糧作物中，富含大量的木質(zhì)纖維產(chǎn)物，而這些木質(zhì)纖維又是由五、六碳糖構(gòu)成，因此，如何高效利用農(nóng)副產(chǎn)品廢料、和天然木質(zhì)纖維原料降解轉(zhuǎn)化生產(chǎn)清潔能源就成了科研工作面對(duì)的巨大挑戰(zhàn)。

1 木質(zhì)纖維和五碳糖

木質(zhì)纖維是大量存在于自然界中的碳水化合物，在木質(zhì)纖維作物中，纖維素的存在方式是晶體束形式，由半纖維素及木質(zhì)素復(fù)形成的外殼包裹，這種外殼能夠保護(hù)植物細(xì)胞[1]。目前能夠人工純培養(yǎng)的微生物多數(shù)能夠轉(zhuǎn)化產(chǎn)出乙醇的微生物可以高效利用六碳糖，其中葡萄糖是最容易被利用的碳源，葡萄糖首先由糖酵解途徑或ED途徑轉(zhuǎn)化為丙酮酸，丙酮酸通過(guò)丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶轉(zhuǎn)化成為乙醇。

木質(zhì)纖維中的五碳糖的轉(zhuǎn)化以木糖轉(zhuǎn)化為主，野生型釀酒酵母無(wú)法利用木糖轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醇，因?yàn)槠潴w內(nèi)因缺少能夠?qū)⒛咎寝D(zhuǎn)化為乙醇合成關(guān)鍵中間產(chǎn)物木酮糖的酶系。因此，木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖步驟是實(shí)現(xiàn)木糖轉(zhuǎn)化乙醇的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。真菌中木糖能夠在木糖還原酶和木糖醇脫氫酶的催化下轉(zhuǎn)化為木酮糖，細(xì)菌中木糖能夠在木糖異構(gòu)酶的催化下轉(zhuǎn)化為木酮糖[2]。當(dāng)木糖在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)化為木酮糖后，木酮糖激酶將木酮糖磷酸化為5-磷酸木酮糖，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)醛醇酶及轉(zhuǎn)酮醇酶的共同作用，5-磷酸木酮糖將進(jìn)而被轉(zhuǎn)化為甘油醛-3-磷酸及葡萄糖-6-磷酸，然后轉(zhuǎn)入磷酸戊糖途徑經(jīng)丙酮酸脫羧轉(zhuǎn)化為乙醇[3]。

對(duì)現(xiàn)有菌種的改造，目前的研究主要通過(guò)兩種方法實(shí)現(xiàn)：一種是向酵母等高效利用六碳糖的菌種中導(dǎo)入五碳糖代謝途徑；第二種是向混合糖利用能力強(qiáng)，但目的產(chǎn)物產(chǎn)量低的菌種中導(dǎo)入增強(qiáng)代謝通路轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因。

2 五碳糖菌株改造方法

在這里介紹幾種目前改造菌株較為常用的技術(shù)。在五碳糖轉(zhuǎn)化的研究中，通常使用能夠高效生產(chǎn)乙醇的微生物作為菌株改造的目標(biāo)，包括酵母菌、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌這樣的菌株，都能以六碳糖作為底物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醇，但無(wú)法高效利用五碳糖，因此需要導(dǎo)入五碳糖轉(zhuǎn)化通路，構(gòu)建工程菌株[4]。對(duì)于能夠轉(zhuǎn)化混合糖的菌株，如大腸桿菌，由于缺少丙酮酸脫羧酶，且乙醇脫氫酶Ⅱ活性低，因此它們轉(zhuǎn)化產(chǎn)出乙醇效率則相對(duì)較低。這就需要向菌株中導(dǎo)入增大乙醇產(chǎn)出代謝通路的關(guān)鍵酶。目前，多數(shù)以大腸桿菌為研究目標(biāo)的基因工程改造工作都是以質(zhì)粒作為基因載體，但質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性較差，在保藏過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)丟失等問(wèn)題，不易于獲得乙醇高產(chǎn)菌株。另外一種常用技術(shù)是原生質(zhì)體融合技術(shù)，該技術(shù)通過(guò)將兩個(gè)遺傳性狀不同的細(xì)胞融合重組產(chǎn)生一個(gè)新細(xì)胞，使兩親本株基因融合并產(chǎn)生基因重組并獲得新的性狀的一種技術(shù)[5]。原生質(zhì)體融合技術(shù)可在不同種屬間開(kāi)展，通過(guò)不同的生物體細(xì)胞融合，達(dá)到改造細(xì)胞遺傳性狀的目的，并賦予酵母菌代謝五碳糖的能力。

3 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中的數(shù)據(jù)獲得方法

培養(yǎng)基中葡萄糖含量的測(cè)定方法較多，當(dāng)以葡萄糖作為單一碳源時(shí)，發(fā)酵液中葡萄糖含量測(cè)定方法通常采用3，5-二硝基水楊酸比色法。在堿性條件下，當(dāng)葡萄糖與3，5-二硝基水楊酸共熱時(shí)，葡萄糖被氧化成產(chǎn)生糖酸等化合物，3，5-二硝基水楊酸發(fā)生還原反應(yīng)，產(chǎn)物3-氨基-5-硝基水楊酸呈棕紅色。葡萄糖的含量與產(chǎn)物中棕紅色物質(zhì)成比例關(guān)系，這時(shí)，可在520 nm波長(zhǎng)下測(cè)棕紅色物質(zhì)吸光值，再根據(jù)吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中葡萄糖含量。

測(cè)定發(fā)酵液中木糖含量時(shí)，同樣利用3，5-二硝基水楊酸比色法。當(dāng)培養(yǎng)基為葡萄糖與混合糖按比例配置時(shí)，可利用葡萄糖試劑盒檢測(cè)混合糖發(fā)酵液中葡萄糖的含量，在采用比色法測(cè)定總還原糖吸光度值，繪制比色法的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，之后對(duì)發(fā)酵液中葡萄糖含量加以換算，用總還原糖吸光值減去葡萄糖的部分，就可以獲得混合糖中的木糖吸光值，然后繪制的木糖的標(biāo)線，計(jì)算出木糖的含量。

發(fā)酵液中目的產(chǎn)物含量可以通過(guò)多種方法獲得，以乙醇為例，乙醇含量可以通過(guò)重鉻酸鉀比色法獲得，也可以利用高效液相色譜和氣相色譜法獲得，同時(shí)，目前市場(chǎng)上也有多種試劑盒用來(lái)測(cè)定發(fā)酵液中的乙醇含量[6]。其中，高效液相色譜被廣大科研工作者廣泛認(rèn)可。

4 結(jié)語(yǔ)

目前很多研究工作的重點(diǎn)為通過(guò)對(duì)五碳糖菌株的改造，以期望得到具有高效轉(zhuǎn)化五碳糖途徑的工程菌株。在這些研究過(guò)程中，人們往往只是通過(guò)定向基因?qū)?，替代或敲除等技術(shù)單純的改變細(xì)胞的某一代謝途徑，而無(wú)法做到從整體上來(lái)調(diào)控細(xì)胞的代謝平衡。因此，對(duì)于目前的研究現(xiàn)狀，還有很多工作等待著科研工作者去完成。

參考文獻(xiàn)

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