摘要：為研究H47Q突變對(duì)促炎蛋白hGIIA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響，分別對(duì)天然型和突變型（H47Q）的hGIIA進(jìn)行多次重復(fù)模擬，然后對(duì)串聯(lián)軌跡進(jìn)行了幾何性質(zhì)比較、基本動(dòng)力學(xué)分析并構(gòu)建了自由能圖譜。結(jié)果顯示，與天然型hGIIA相比，突變型hGIIA擁有更多的原子間非鍵相互作用，更小的回旋半徑，更低的整體構(gòu)象柔性和全局自由能最小化區(qū)域。與天然型hGIIA相比，突變型hGIIA結(jié)構(gòu)可能采取了更加緊湊包裝，導(dǎo)致hGIIA整體構(gòu)象柔性的下降，局限在更小的構(gòu)象空間，不利于hGIIA與底物和整合素的結(jié)合。

關(guān)鍵詞：IIA分泌型磷脂酶A2;hGIIA;分子動(dòng)力學(xué);本質(zhì)動(dòng)力學(xué);自由能圖譜hGIIA（human group IIA sPLA2，人類IIA分泌型磷脂酶A2）屬于磷脂酶A2（secretory phospholipase A2，sPLA2）家族的酶，該酶由PLA2G2A基因編碼。在細(xì)胞外液中，hGIIA通過水解甘油酯中sn2位酯鍵，促使白三烯（前列腺素的前體）、血小板激活因子等炎性介質(zhì)的產(chǎn)生從而發(fā)揮促炎作用。hGIIA的促炎作用不僅與肺癌的形成與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［1］，而且在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎［2］、動(dòng)脈粥樣硬化［3］中也異常表達(dá)或活性增強(qiáng)，因此hGIIA被認(rèn)為是治療炎癥失控癥狀的潛在靶點(diǎn)。遺憾的是，針對(duì)hGIIA開發(fā)的選擇性抑制劑varespladib和darapladib在Ⅲ期臨床實(shí)驗(yàn)中均未達(dá)到預(yù)期效果，這表明把hGIIA作為炎癥調(diào)節(jié)獨(dú)立的藥物靶點(diǎn)可能并不合理。hGIIA與細(xì)胞上的整合素αvβ3＼＼α4β1＼＼α5β1相互作用，同時(shí)誘發(fā)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖，這一事實(shí)就是一個(gè)很好的證明［4］。hGIIA第47位組氨酸突變?yōu)楣劝滨０罚℉47Q突變），顯著降低了hGIIA的活性，為hGIIA與整合素作用機(jī)制研究提供了新的切入點(diǎn)。

hGIIA全長(zhǎng)包括124個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量約為1.4 kDa。hGIIA晶體結(jié)構(gòu)由一個(gè)較小的C端和N端、6個(gè)α螺旋、2個(gè)β折疊、1個(gè)保守的Ca2+結(jié)合環(huán)和保守的催化二聯(lián)體His/Asp（圖1A）。其酶結(jié)構(gòu)只有一個(gè)域，底物結(jié)合口袋入口主要由α1、α2、Ca2+結(jié)合環(huán)構(gòu)成，α3、α4位于結(jié)合口袋的底部，與整合素的結(jié)合涉及5個(gè)肽段（圖1B）。

1材料與方法

1.1模擬體系構(gòu)建

從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取完整的天然型hGIIA（NThGIIA）結(jié)構(gòu)PDB ID：3U8D和H47Q突變型（MThGIIA）結(jié)構(gòu)PDB ID：1N28。使用PyMOL分解晶體結(jié)構(gòu)均以A鏈作為模板， MThGIIA使用PyMOL的PySwissSidechain插件進(jìn)行了A1N突變建模，確保了天然型和突變型結(jié)構(gòu)的可比性。

1.2分子動(dòng)力學(xué)模擬（Molecular dynamics，MD）

分子動(dòng)力學(xué)模擬使用GROMACS5.1.2和AMBER99SBLIDN全原子立場(chǎng)，水分子模型為TIP3P，體系溶劑化遵循邊界原子向外延伸1.0 nm的原則，構(gòu)建十二面體水盒子。使用最陡下降法對(duì)2個(gè)體系進(jìn)行能量?jī)?yōu)化。然后對(duì)模擬體系進(jìn)行NVT和NPT各10 ns平衡模擬，對(duì)每個(gè)模擬體系分別進(jìn)行3個(gè)獨(dú)立100 ns生產(chǎn)動(dòng)力學(xué)模擬。

1.3分析方法

通過計(jì)算模擬過程中溶質(zhì)結(jié)構(gòu)相對(duì)于初始結(jié)構(gòu)的骨架RMSD（Root Mean Square Deviation），評(píng)價(jià)了軌跡的平衡性，然后比較了2個(gè)模擬的幾何性質(zhì)。最后進(jìn)行了本質(zhì)動(dòng)力學(xué)分析（Principal Component Analysis，PCA），并構(gòu)建了蛋白質(zhì)溶劑體系的自由能圖譜（Free Energy Landscape，F(xiàn)EL）。

2結(jié)果

2.1軌跡平衡及收斂性

NThGIIA的3個(gè)模擬副本，大約5 ns可以達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定的RMSD值，而MThGIIA的3個(gè)副本僅需要3 ns便達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定的RMSD波動(dòng)，表明MThGIIA比NThGIIA更容易達(dá)到平衡波動(dòng)。對(duì)于每個(gè)系統(tǒng)，分別將3個(gè)軌跡中的平衡軌跡部分（5～100 ns）串聯(lián)成一個(gè)285 ns的組合軌跡。

依據(jù)表1動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)性質(zhì)的定量分析可以得出：在模擬過程中，與NThGIIA 結(jié)構(gòu)相比，MThGIIA結(jié)構(gòu)模型更加緊湊。

a氫鍵的數(shù)量。如果供體氫受體原子的角度大于120°且供體與受體原子的距離小于3.5 ，則表明供體與受體之間存在氫鍵。

b溶劑可及表面積。

c范德華接觸數(shù)量。如果2個(gè)原子之間的距離小于6 ，則表明這2個(gè)原子之間存在近距離接觸。

d回旋半徑。

e相應(yīng)二級(jí)結(jié)構(gòu)單元中的殘基數(shù)量。

f使用Amber99sbildn力場(chǎng)以及PME靜電處理方式計(jì)算的勢(shì)能。

2.2構(gòu)象柔性比較

除了數(shù)量有限的區(qū)域之外，NThGIIA在整體上比MThGIIA具有更高的柔性。在模擬過程中，除了Ca2+結(jié)合環(huán)，α1、α2、α3、α4都具有相對(duì)于其初始結(jié)構(gòu)更低的構(gòu)象偏差值，這正是底物結(jié)合口袋具有高構(gòu)象柔性的原因。此外，在兩個(gè)模型中， Res1115、Res3557、Res97112肽段均具有較低的RMSD值（lt;0.3 nm），表現(xiàn)出較高的剛性;而Res7174和Res118124肽段均具有較高的RMSD值，表現(xiàn)出較高的柔性。

2.3本質(zhì)動(dòng)力學(xué)分析

本質(zhì)動(dòng)力學(xué)分析表明，2個(gè)hGIIA的模擬軌跡均只有少數(shù)本征向量具有顯著的本征值。對(duì)角線化處理NThGIIA和MThGIIA的Ca原子協(xié)方差矩陣后，得到總均方波動(dòng)值分別為7.67 nm2和5.15 nm2，表明NThGIIA在模擬中經(jīng)歷了更大的構(gòu)象波動(dòng)。NThGIIA和MThGIIA的前10個(gè)和前30個(gè)本征向量的均方波動(dòng)之和占總均方根波動(dòng)的比例分別為87.4%、95.2%、85.2%和94.2%。

2.4自由能圖譜分析

圖2以前2個(gè)本征向量投射為坐標(biāo)系，分別構(gòu)建NThGIIA和MThGIIA的二維FEL。NThGIIA的FEL中PC1和PC2所跨越的范圍分別為3.3 nm、5.6 nm，而MThGIIA的FEL中PC1和PC2所跨越的范圍分別為2.8 nm、4.1 nm，表明前者較后者具有更大的自由能表面積。2個(gè)模型都有2個(gè)主要的自由能井， MThGIIA全局自由能最小化區(qū)域（-8.7 kcal/mol）比NThGIIA全局自由能最小化區(qū)域（-8.5 kcal/mol）更低，說明前者具有更高的熱穩(wěn)定性。

3討論

（1） H47Q突變顯著降低了hGIIA的活性，但是并不影響hGIIA與整合素的結(jié)合。這表明H47Q突變并不是影響hGIIA與整合素相互作用的關(guān)鍵因素，因此探究hGIIA的H47Q突變體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有助于理解hGIIA與整合素的作用機(jī)制。

（2） NThGIIA具有更大的全局構(gòu)象柔性和局部構(gòu)象柔性，這意味著NThGIIA比MThGIIA具有更多的構(gòu)象子狀態(tài)、更豐富的構(gòu)象多樣性以及更加復(fù)雜的動(dòng)力學(xué)行為。NThGIIA自由能表面更為粗糙、復(fù)雜。越粗糙的自由能表面所導(dǎo)致的多構(gòu)象狀態(tài)決定了hGIIA的功能多樣性。MThGIIA比NThGIIA具有更多的范德華接觸，這是導(dǎo)致其具有更低自由能的原因。

（3） MThGIIA底物結(jié)合口袋被限制在更少的構(gòu)象空間，不利于蛋白與底物結(jié)合。根據(jù)誘導(dǎo)契合學(xué)，底物結(jié)合口袋構(gòu)象變化受限導(dǎo)致底物結(jié)合能力下降，可能是導(dǎo)致MThGIIA失活的另一個(gè)重要原因［5］。hGIIA與整合素結(jié)合的Res1115、Res3553、Res97112的3個(gè)肽段均表現(xiàn)出較低的柔性，這些肽段可能是整合素能夠有效識(shí)別hGIIA的關(guān)鍵位點(diǎn)。針對(duì)hGIIA底物結(jié)合口袋聯(lián)合整合素結(jié)合位點(diǎn)的藥物開發(fā)可能是一個(gè)更優(yōu)的選擇。

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基金項(xiàng)目：2022年度云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目“H47Q突變對(duì)人類sPLA2IIA酶動(dòng)力學(xué)的影響研究”（2022J1681）;2021年度昭通市“十四五”教育研究規(guī)劃課題“昭通衛(wèi)生職業(yè)教育實(shí)驗(yàn)教學(xué)效益研究”（202136）

作者簡(jiǎn)介：張忠弘，女，四川渠縣人，副教授，本科，研究方向：分子生物學(xué)。

通信作者：李智，男，四川蒼溪人，副教授，在職研究生，研究方向：分子生物學(xué)。