[摘" "要]" "目的:研究三色旋花種子的化學成分及單體化合物的抗炎活性。方法:采用硅膠、十八烷基硅烷鍵合硅膠填料(Octadecylsilyl, ODS)反相色譜和制備型HPLC等方法分離純化,并利用核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)、質譜(mass spectrometry, MS)等波譜學方法鑒定化合物的結構。利用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導的RAW264.7細胞模型及分子對接技術,初步探索所分離化合物的抗炎作用。結果:從三色旋花種子的二氯甲烷部位中分離得到11個化合物,分別是α-亞油酸(1)、1-亞油酸甘油酯(2)、N-亞油酸乙醇胺(3)、咖啡酸乙酯(4)、5-hydroxy-3, 4-dimethy-5-pentyl-2(5H)-furanone(5)、東莨菪素(6)、3-吲哚甲醛(7)、methyl dioxindole-3-acetate(8)、ethyl dioxindole-3-acetate(9)、coixspirolactam B(10)、coixspirolactam C(11)?;钚匝芯堪l(fā)現(xiàn),化合物4能夠顯著抑制LPS誘導的一氧化氮生成,而且能顯著抑制炎癥因子誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)和環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)的表達,并能與iNOS和COX-2蛋白結合,進而發(fā)揮抗炎作用。結論:化合物2~5和7~11為首次從旋花屬植物中分離得到,化合物1為首次從植物三色旋花中分離得到。其中,化合物4具有顯著的抗炎活性,具有進一步研究開發(fā)的價值。
[關鍵詞]" "三色旋花;化學成分;抗炎活性;分子對接
[中圖分類號]" "Q946" " " " " " " "[文獻標志碼]" "A" " " " " " " "[文章編號]" "1674-7887(2024)02-0111-06
Chemical constituents from Convolvulus tricolor L. and their anti-inflammatory activities*
LI Yuxin1**#, ZHU Dongrong2**#, ZHANG Xihan1, QI Tianzi1, GU Jinping1, LIN Bin3, LU Tianqi4, WANG Wenli1***, FAN Boyi1***" " " " (1School of Pharmacy, Nantong University, Jiangsu 226019; 2School of Chemistry and Chemical Engineering, Tianjin University of Technology; 3Wuya College of Innovation, Shenyang Pharmaceutical University; 4Jiangsu Haofeng Bio-technology Co.)
[Abstract]" "Objective: To study the chemical constituents from Convolvulus tricolor L.(C. tricolor) and their anti-inflammatory activities. Methods: The chemical constituents were separated and purified by silica gel, Octadecylsilyl(ODS) reverse phase chromatography and preparative HPLC, and were identified by nuclear magnetic resonance(NMR) and mass spectrometry(MS) spectroscopic techniques. The lipopolysaccharide(LPS)-induced RAW264.7 cell model and molecular docking technology were used to evaluate the anti-inflammatory activities. Results: Eleven compounds were isolated from dichloromethane extract of C. tricolor seeds, and were identified as α-linoleic acid(1), 1-monolinolein(2), N-linoleoylethanolamine(3), ethyl caffeate(4), 5-hydroxy-3, 4-dimethy-5-pentyl-2(5H)-furanone(5), scopoletin(6), 3-indole formaldehyde(7), methyl dioxindole-3-acetate(8), ethyl dioxindole-3-acetate(9), coixspirolactam B(10), coixspirolactam C(11). The activity research found that compound 4 could significantly reduce LPS-induced nitric oxide generation, which can also significantly inhibit the expression of inducible nitric oxide synthase(iNOS) and cyclooxygenase-2(COX-2), and bind to iNOS and COX-2 proteins, thereby exerting anti-inflammatory effects. Conclusions: Compounds 2-5 and 7-11 were firstly isolated from genus Convolvulus, while compound 1 was isolated C. tricolor for the first time. Among them, compound 4 exhibited potent anti-inflammatory activity, and had value for further research and development.
[Key words]" "Convolvulus tricolor L.; chemical constituents; anti-inflammatory activity; molecular docking
旋花屬(Convolvulus)為旋花科一年生或多年生植物。全球約250種,廣布于兩半球溫帶及亞熱帶,極少數(shù)在熱帶[1]。旋花屬包含多種藥用植物,如田旋花(C.arvensis)、藥旋花(C.scammonia)、C.pluricaulis等,在世界各地作為傳統(tǒng)藥物廣泛使用[2-3]。截至目前,從旋花屬植物中分離得到多種活性成分,如揮發(fā)油、萜類、黃酮、甾體、香豆素、花青素、生物堿和樹脂糖苷類等。現(xiàn)代藥理研究[2-5]表明,旋花屬植物及其活性成分具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗阿爾茨海默病、鎮(zhèn)靜及神經保護等藥理作用,具有廣泛的開發(fā)前景和價值。
三色旋花(Convolvulus tricolor L., C. tricolor)是旋花科旋花屬草本植物[6]。三色旋花原產于地中海沿岸、北非等地區(qū),由于其花色豐富,具有較高的觀賞價值,因此在我國各地均有栽培。不過目前對該植物的化學成分及生物活性研究較少,僅從花朵及種子中分離得到少量生物堿、香豆素、黃酮和半乳甘露聚糖等類型化合物[7-9]。因此,為了進一步研究三色旋花植物的開發(fā)價值,本文對三色旋花種子二氯甲烷部位的化學成分進行提取、分離、純化和結構鑒定,并對這些化合物進行抗炎活性測定,以期發(fā)展和豐富該植物的化學成分,并開發(fā)具有一定藥用價值的活性化合物。
1" "材料與方法
1.1" "儀器與材料
1.1.1" "儀器" "LC-2030C 3D高效液相色譜儀(日本島津 SHIMADZU);RID-10A示差型高效液相色譜(日本島津SHIMADZU);LC-10AD制備型高效液相色譜儀(日本島津 SHIMADZU);Bruker 600 AV NEO核磁共振波譜儀(瑞士布魯克公司);AVANCE III HD 400核磁共振波譜儀(瑞士布魯克公司);EU-K1-10TY實驗室級超純水器(河南森空儀器設備有限公司);MLT35HA數(shù)控超聲波清洗器(江蘇米力特科學儀器有限公司);SHX-2旋轉蒸發(fā)儀(滎陽市科鑫儀器廠);DWX-5/20 ℃低溫冷卻液循環(huán)泵(上海冉富儀器有限公司);YR-3M多功能粉碎機(河北本辰科技有限公司);MS204S分析天平(上海甄明科學儀器有限公司);JY5002電子天平(上海舜宇科學儀器有限公司)。
1.1.2" "材料" "硅膠(中國青島海洋化工有限公司);ODS C18填料(日本富士株式會社);Sephadex LH-20(Pharmacia公司);預制硅膠薄層G板(10~40 μm青島海洋化工廠);制備型YMC-Pack ODS-A 色譜柱(12.0 mm×250 mm, 5 μm, YMC);顯色劑:10%濃硫酸-乙醇。所用水為超純水,所用試劑均為分析純或色譜純。
實驗用藥材于2022年5月購買自江蘇省宿遷市沭陽縣佳康園林綠化苗木場,經南通大學藥學院楊敏副教授鑒定為旋花科旋花屬植物三色旋花C. tricolor的干燥種子,標本存放于南通大學天然藥物化學教研室內,標本編號為No.202205。
1.2" "實驗方法
1.2.1" "提取分離" "采用95%乙醇對三色旋花種子粉末(5 kg)進行熱回流提取,合并提取液減壓濃縮??偨嘤盟貞?,依次用二氯甲烷、正丁醇試劑進行萃取。二氯甲烷部位濃縮后得到173 g浸膏,以二氯甲烷-甲醇(1∶0~1∶1, v/v)為洗脫劑,用硅膠柱層析進行分離,得到3個餾分Frs.A~C。將Fr.C(39.8 g)用ODS柱層析,以甲醇-水(30∶70~100∶0, v/v)洗脫,得到6個餾分(Frs.CA~CF)。
將組分Fr.CD(6.8 g)以二氯甲烷-甲醇(10∶1~1∶1, v/v)為洗脫劑,用硅膠柱層析得到9個餾分(Frs.CDA~CDI)。組分Fr.CDC以82%甲醇-水溶液為流動相,經制備型HPLC制備得到化合物3(tR=31 min, 2.6 mg)和化合物2(tR=36 min, 3.5 mg)。組分Fr.CDE以77%甲醇-水溶液為流動相,經制備型HPLC制備得到化合物1(tR=60 min, 3.8 mg)。
將組分Fr.CC(2.6 g)以二氯甲烷-甲醇(15∶1~1∶1, v/v)為洗脫劑,用硅膠柱層析得到12個餾分(Frs.CCA~CCL)。組分Fr.CCB以50%甲醇-水溶液為流動相,經制備型HPLC制備得到化合物4(tR=28 min, 3.0 mg)和5(tR=63 min, 7.0 mg)。
將組分Fr.CB(1.7 g)以二氯甲烷-甲醇(15∶1~1∶1, v/v)為洗脫劑,用硅膠柱層析得到14個餾分(Frs.CBA~CBN)。組分Fr.CBB以30%甲醇-水溶液為流動相,經制備型HPLC制備化合物6(tR=42 min, 1.4 mg)和7(tR=61 min, 1.2 mg)。組分Fr.CBD以25%甲醇-水溶液為流動相,經制備型HPLC制備化合物8(tR=30 min, 0.8 mg)、10(tR=50 min, 6.0 mg)、9(tR=59 min, 5.0 mg)和11(tR=93 min, 4.5 mg)。
1.2.2" "抗炎活性" "研究取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞,胰酶消化為單細胞懸液后,經細胞計數(shù)后,接種于96孔板,每孔細胞密度為1×106/100 μL,置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h后,進行分組、給藥。實驗分為空白組、模型組和樣品組??瞻捉M中只加入DMEM培養(yǎng)基,模型組中加入1 μg/mL脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),樣品組中除加入LPS外,分別加入不同濃度(0.5~8 μmol/L)的測試樣品。給藥16 h后,吸取上清液,用一氧化氮(nitric oxide, NO)檢測試劑盒測定培養(yǎng)基中NO的含量。利用MTT法檢測化合物對RAW264.7細胞存活率的影響。利用Western Blot分析化合物4(0.5~2 μmol/L)對RAW264.7細胞中誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)和環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)蛋白含量的變化。
1.2.3" "分子對接" "利用Schro?觟dinger suite 2021-2和PyMOL軟件[10],以及iNOS(PDB ID: 4NOS)和COX-2(PDB ID:5IKT)的蛋白結構,對化合物4進行分子對接。首先,在Glide中使用XP模式,COX-2和iNOS作為受體,設置默認對接網(wǎng)格為20 ?魡,將共晶配體放置在口袋中心。最后,基于驗證的參數(shù),將化合物4與iNOS和COX-2分別進行對接。
2" "結" " " 果
2.1" "化合物分離結果" "化合物1:淡黃色油狀物;ESI-MS: m/z 281[M+H]+,分子式C18H32O2。1H NMR(600 MHz, CDCl3) δ: 5.29~5.40(4H, m, H-9, 10, 12, 13), 2.76(2H, t, J=7.2 Hz, H-11), 2.35(2H, m, H-2), 2.04(4H, m, H-8, 14), 1.59(2H, m, H-3), 1.25~1.38(14H, m, H-4~7, 15~17), 0.87(3H, t, J=6.6 Hz, H-18); 13C NMR(150 MHz, CDCl3) δ: 178.2(C-1), 34.2(C-2), 25.0(C-3), 29.4~29.9(C-4~7, 15), 27.3(C-8), 130.1(C-9), 128.2(C-10), 25.8(C-11), 128.0(C-12), 130.4(C-13), 27.4(C-14), 31.7(C-16), 22.7(C-17), 14.2(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]報道基本一致,故鑒定化合物1為α-亞油酸。
化合物2:無色粉末;ESI-MS: m/z 355[M+H]+,分子式C21H38O4。1H NMR(600 MHz, CDCl3) δ: 5.43~5.29(4H, m, H-9, 10, 12, 13), 4.21(1H, dd, J=11.4, 4.8 Hz, H-1a′), 4.15(1H, dd, J=11.4, 6.0 Hz, H-1b′), 3.93(1H, m, H-2′), 3.70(1H, dd, J=12.0, 4.2 Hz, H-3a′), 3.60(1H, dd, J=12.0, 5.4 Hz, H-3b′), 2.77(2H, t, J=7.2 Hz, H-11), 2.36(1H, t, J=7.2 Hz, H-2), 2.05(4H, m, H-8, 14), 1.63(2H, m, H-3), 1.37~1.28(14H, m, H-4~7, 15~17), 0.89(3H, t, J= 6.6 Hz, H-18); 13C NMR(150 MHz, CDCl3) δ: 174.5(C-1), 34.3(C-2), 25.0(C-3), 29.2~29.7(C-4~7, 15), 27.3(C-8), 130.1(C-9), 128.2(C-10), 25.8(C-11), 128.1(C-12), 130.4(C-13), 27.4(C-14), 31.7(C-16), 22.7(C-17), 14.2(C-18), 65.3(C-1′), 70.4(C-2′), 63.5(C-3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道基本一致,故鑒定化合物2為1-亞油酸甘油酯。
化合物3:黃色油狀物;ESI-MS: m/z 324 [M+H]+,分子式C20H37NO2。1H NMR(600 MHz, CDCl3) δ:5.97 (1H, brs, NH), 5.40~5.30(4H, m, H-9, 10, 12, 13), 3.72(2H, t, J=4.8 Hz, H-2′), 3.42(2H, q, J=4.8 Hz, H-1′), 3.24(1H, brs, OH), 2.76(2H, t, J=7.2 Hz, H-11), 2.20 (2H, t, J=7.8 Hz, H-2), 2.04(4H, m, H-8, 14), 1.61~1.64(2H, m, H-3), 1.38~1.25(14H, m, H-4~7, 15~17), 0.88(3H, t, J=6.6 Hz, -CH3); 13C NMR(150 MHz, CDCl3) δ: 174.7(C-1), 36.8(C-2), 25.8(C-3), 29.3~29.7(C-4~7, 15), 27.3(C-8, 14), 130.2(C-9), 128.2(C-10), 25.8(C-11), 128.0(C-12), 130.4(C-13), 31.7(C-16), 22.6(C-17), 14.1(C-18), 42.6(C-1′), 62.8(C-2′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道基本一致,故鑒定化合物3為N-亞油酸乙醇胺。
化合物4:黃色結晶;ESI-MS: m/z 209[M+H]+,分子式C11H12O4。1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ: 7.56 (1H, d, J=16.0 Hz, H-3), 7.08(1H, brs, H-5), 6.98(1H, d, J=8.0 Hz, H-9), 6.86(1H, d, J=8.0 Hz, H-8), 6.25(1H, d, J=16.0 Hz, H-2), 4.25(2H, q, J=7.2 Hz, -OCH2-), 1.33(3H, t, J=7.2 Hz, -CH3); 13C NMR(100 MHz, CDCl3) δ: 167.9(C-1), 114.4(C-2), 144.2(C-3), 127.6(C-4), 115.6(C-5), 145.0(C-6), 146.6(C-7), 115.7(C-8), 122.5(C-9), 60.7(C-10), 14.5(C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道基本一致,故鑒定化合物4為咖啡酸乙酯。
化合物5:無色油狀物;ESI-MS: m/z 199[M+H]+,分子式C11H18O3。1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ: 1.98(1H, m, H-6a), 1.75(1H, m, H-6b), 1.28(5H, m, H-7a, 8, 9), 1.15(1H, m, H-7b), 0.87(3H, t, J=6.0 Hz, H-10), 1.93(3H, brs, H-11), 1.81(3H, brs, H-12); 13C NMR(100 MHz, CDCl3) δ: 172.4(C-1), 125.4(C-2), 158.0(C-3), 107.2(C-4), 36.1(C-5), 31.7(C-6), 22.7(C-7), 22.6(C-8), 14.1(C-9), 10.9(C-10), 8.6(C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道基本一致,故鑒定化合物5為5-hydroxy-3, 4-dimethy-5- pentyl-2(5H)-furanone。
化合物6:黃色結晶;ESI-MS: m/z 193[M+H]+,分子式C10H8O4。1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ: 7.60(1H, d, J=9.2 Hz, H-4), 6.92(1H, s, H-8), 6.85(1H, s, H-5), 6.27(1H, d, J=9.2 Hz, H-3), 4.00(3H, s, -OCH3); 13C NMR(100 MHz, CDCl3) δ: 161.6(C-2), 113.6(C-3), 143.5(C-4), 107.6(C-5), 150.4(C-6), 144.1(C-7), 103.3(C-8), 149.8(C-9), 111.6(C-10), 56.5(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道基本一致,故鑒定化合物6為東莨菪素。
化合物7:黃色結晶;ESI-MS: m/z 146[M+H]+,分子式C9H7NO。1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ: 10.08(1H, s, CHO), 8.78(1H, brs, NH), 8.33(1H, m, H-4), 7.86(1H, d, J=3.2 Hz, H-2), 7.45(1H, m, H-7), 7.33(2H, m, H-5, 6); 13C NMR(100 MHz, CDCl3) δ: 185.3(CHO), 135.1(C-2), 122.2(C-4), 124.6(C-5), 123.2(C-6), 111.6(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道基本一致,故鑒定化合物7為3-吲哚甲醛。
化合物8:黃色油狀物;ESI-MS: m/z 222[M+H]+,分子式C11H11NO4。1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ: 8.27(1H, brs, NH), 7.38(1H, d, J=7.2 Hz, H-4), 7.27(1H, t, J=7.2 Hz, H-6), 7.06(1H, t, J =7.2 Hz, H-5), 6.89(1H, d, J=7.2 Hz, H-7), 3.68(3H, s, -OCH3), 2.96(2H, s, H-8); 13C NMR(100 MHz, CDCl3) δ: 178.4(C-2), 73.9(C-3), 130.4(C-3a), 129.7(C-4), 123.4(C-5), 124.4(C-6), 110.7(C-7), 140.7(C-7a), 41.0(C-8), 171.1(C-9), 52.3(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道基本一致,故鑒定化合物8為methyl dioxindole-3-acetate。
化合物9:黃色油狀物;ESI-MS: m/z 236[M+H]+,分子式C12H13NO4。1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ: 7.38(1H, brs, H-4), 7.26(1H, s, H-6), 7.05(1H, m, H-5), 6.87(1H, brs, H-7), 2.95(2H, s, H-8), 4.12(2H, t, J=6.8 Hz, H-10), 1.17(3H, t, J=6.8 Hz, H-11); 13C NMR(100 MHz, CDCl3) δ: 178.8(C-2), 74.1(C-3), 130.3(C-3a), 129.7(C-4), 123.4(C-5), 124.4(C-6), 110.7(C-7), 140.7(C-7a), 41.3(C-8), 170.6(C-9), 61.4(C-10), 14.0(C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道基本一致,故鑒定化合物9為ethyl dioxindole-3-acetate。
化合物10:黃色油狀物;ESI-MS: m/z 218[M+H]+,分子式C12H11NO3。1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ: 8.65(1H, brs, NH), 7.31(1H, d, J=7.6 Hz, H-4), 7.27(1H, t, J=7.6Hz, H-5), 7.12(1H, t, J=7.6 Hz, H-6), 6.97(1H, d, J=7.6 Hz, H-7), 2.98(2H, s, H-8), 4.75(1H, q, J=6.4 Hz, H-10), 1.35(3H, d, J=6.4 Hz, -CH3); 13C NMR(100 MHz, CDCl3) δ: 173.9(C-2), 54.7(C-3), 141.1(C-3a), 110.7(C-4), 123.5(C-5), 129.8(C-6), 123.0(C-7), 127.5(C-7a), 38.8(C-8), 178.2(C-9), 82.3(C-10), 15.0(C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道基本一致,故鑒定化合物10為coixspirolactam B。
化合物11:黃色油狀物;ESI-MS: m/z 218[M+H]+,分子式C12H11NO3。1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ: 8.33(1H, brs, NH), 7.32(1H, d, J=7.6 Hz, H-4), 7.11(1H, t, J=7.6 Hz, H-5), 7.22(1H, t, J=7.6 Hz, H-6), 6.98(1H, d, J=7.6 Hz, H-7), 3.33(1H, d, J=17.2 Hz, H-8a), 2.70(1H, d, J=17.2 Hz, H-8b), 4.88(1H, q, J=6.4 Hz, H-10), 1.11(3H, d, J=6.4 Hz, -CH3); 13C NMR(100 MHz, CDCl3) δ: 174.1(C-2), 56.0(C-3), 140.0(C-3a), 110.8(C-4), 124.4(C-5), 129.6(C-6), 123.5(C-7), 128.3(C-7a), 40.3(C-8), 176.7(C-9), 81.7(C-10), 15.6(C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道基本一致,故鑒定化合物11為coixspirolactam C。
化合物1~11的化學結構見圖1。
2.2" "活性研究" "利用LPS誘導的RAW264.7細胞模型,檢測化合物1~11的抗炎活性。結果表明,化合物4在0.5~8 μmol/L的濃度下,能夠不影響細胞存活率,并劑量依賴性地顯著抑制NO的生成,IC50為(2.32±0.18) μmol/L(圖2A~B)。進一步研究發(fā)現(xiàn),化合物4在0.5~2 μmol/L的濃度下,能夠劑量依賴性地顯著抑制炎癥因子iNOS和COX-2的表達,從而抑制細胞的炎癥反應(圖2C)[20]。
2.3" "分子對接" "利用分子對接技術研究發(fā)現(xiàn),化合物4能夠與iNOS蛋白中疏水口袋的氨基酸殘基,如PRO 467,進行結合,并能與ARG 381殘基形成穩(wěn)定氫鍵(圖3A);同時,化合物4能夠與COX-2蛋白的TYR 385和ARG 120殘基形成穩(wěn)定氫鍵(圖3B)。
3" "討" " " 論
運用現(xiàn)代技術對旋花科植物三色旋花種子的二氯甲烷部位進行提取分離,得到單體化合物11個?;衔?~5和7~11為首次從該屬植物中分離得到,化合物1為首次從植物三色旋花中分離得到。利用LPS誘導的RAW264.7細胞模型,對化合物1~11進行初步的抗炎活性研究。結果顯示,化合物4能夠顯著抑制LPS誘導的NO生成,并能顯著抑制炎癥因子iNOS和COX-2的蛋白表達。利用分子對接技術研究發(fā)現(xiàn),化合物4能與iNOS和COX-2蛋白結合,進而發(fā)揮抗炎作用。
綜上所述,本文通過對三色旋花種子單體成分的分離提取及抗炎活性研究,豐富了該植物的化學成分種類,并為后續(xù)學者開發(fā)抗炎藥物提供了先導化合物。
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[收稿日期] 2023-12-05