關鍵詞

分析化學 涼茶 高效液相色譜-串聯(lián)質譜法 α-受體阻斷劑

0引言

涼茶是以中草藥為基礎研制浸提出來的具有清熱解毒、生津止渴等功效的一類植物源性飲料[1]。涼茶產業(yè)發(fā)展迅猛，不僅在傳統(tǒng)的涼茶市場（廣東、廣西地區(qū)）發(fā)展勁頭十足，甚至在全國也開始掀起涼茶風潮[2]。行業(yè)快速發(fā)展的同時，激烈的市場競爭也帶來不少問題[3]，一些不法廠商由于利益驅使，在涼茶中違規(guī)加入如酚妥拉明、妥拉唑林、哌唑嗪、特拉唑嗪和育亨賓等具有降血壓功效的α-受體阻斷劑[4，5]藥物，該類藥物可競爭性阻斷神經遞質或α受體激動劑與α受體的結合，從而產生抑制α受體激動的作用，降壓療效確切，起效快。消費者在不知情的情況下長期服用該類“降壓茶”后，會引起血壓波動及穩(wěn)定性差異變大、產生強依賴性或停藥效應、甚至影響肝臟生物轉化能力及腎臟代謝能力等危害[6]。

目前，針對酚妥拉明、妥拉唑林、哌唑嗪、特拉唑嗪和育亨賓等5種α-受體阻斷劑的檢測，常見的方法主要為薄層色法[7]該方法局限于定性快篩；其次，還有紫外分光光度法[8]、熒光法[9，10]，但這兩種檢測手段無法同時測定多種成分，且檢出限及定量限較高，難以實現(xiàn)痕量檢測；作為常用檢測手段的高效液相色譜法[11-13]，高效液相色譜-串聯(lián)質譜法[14-16]，已有的研究主要以保健食品及藥品為基質，或是圍繞涼茶中防感冒、抗炎、止咳等功效的違法添加藥物開展研究[17]，目前暫時沒有針對涼茶中這類α-受體阻斷劑藥物建立相應的強制性標準，或者無法解決樣品基質導致回收率偏低的問題。因此建立一種簡便、靈敏、快捷的可同時檢測“降壓茶”中5種α-受體阻斷劑的檢測方法，對于規(guī)范我省涼茶產業(yè)生產經營，引導廣東涼茶行業(yè)陽光發(fā)展，具有重要的現(xiàn)實意義。

本研究以涼茶為基質，樣品經凈化后，外標法定量，建立一種可同時分離檢測涼茶中5種α-受體阻斷劑的測定方法，可填補現(xiàn)階段的涼茶及其制品檢測監(jiān)控手段空白。

1材料與方法

1.1材料與試劑

甲醇（分析純，天津致遠化學試劑有限公司）。甲醇、甲酸、乙腈（色譜純，F(xiàn)ishChemical）。鹽酸酚妥拉明（純度98.0%，批號：S70897，質量濃度100.1μg/mL）、鹽酸哌唑嗪（純度99.9%，批號E0029403）、鹽酸特拉唑嗪（純度97%，批號S098201，質量濃度100.0μg/mL）、鹽酸育亨賓（純度98.8%，批號2250583）、鹽酸妥拉唑林（純度95.3%，批號E0027187）。樣品：隨機選取市售的30批次涼茶。

1.2儀器與設備

超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀、IKAMS3渦旋混合器、高速冷凍離心機、JJ500Y電子天平、Milli-Q超純水純化系統(tǒng)。

1.3方法

1.3.1標準溶液的配制

1.3.1.1儲備液配制

鹽酸酚妥拉明（純度98.0%）：100.1μg/mL，經純度及鹽量修正，酚妥拉明質量濃度為86.7μg/mL；鹽酸哌唑嗪（純度99.9%）：稱取鹽酸哌唑嗪0.00810g于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，經純度及鹽量修正，配制成質量濃度為739μg/mL的哌唑嗪儲備液；鹽酸特拉唑嗪（純度97.0%）：100μg/mL，經純度及鹽量修正，特拉唑嗪質量濃度為88.7μg/mL；鹽酸育亨賓（純度98.8%）：稱取鹽酸育亨賓0.00950g于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，經純度及鹽量修正，配制成質量濃度為851μg/mL的育亨賓儲備液；鹽酸妥拉唑林（純度95.3%）：稱取鹽酸妥拉唑林0.00950g于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，經純度及鹽量修正，配制成質量濃度為737μg/mL的妥拉唑林儲備液。

1.3.1.2中間液配制

酚妥拉明中間液：準確移取116μL酚妥拉明儲備液于1.5mL進樣瓶中，加入884μL甲醇，配制成質量濃度為10μg/mL的酚妥拉明中間液；哌唑嗪中間液：準確移取136μL哌唑嗪儲備液10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成質量濃度為10μg/mL的哌唑嗪中間液；特拉唑嗪中間液：準確移取113μL特拉唑嗪儲備液1.5mL進樣瓶中，加入887μL甲醇，配制成質量濃度為10μg/mL的特拉唑嗪中間液；育亨賓中間液：準確移取118μL育亨賓儲備液10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成質量濃度為10μg/mL的育亨賓中間液；妥拉唑林中間液：準確移取136μL妥拉唑林儲備液10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成質量濃度為10μg/mL的妥拉唑林中間液。

1.3.1.3混合標準溶液的配制

準確移取200μL質量濃度為10μg/mL的酚妥拉明、哌唑嗪中間液、100μL質量濃度為10μg/mL的特拉唑嗪、育亨賓中間液、800μL質量濃度為10μg/mL的妥拉唑林中間液于10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成質量濃度為200ng/mL的酚妥拉明、哌唑嗪；100ng/mL的特拉唑嗪、育亨賓；800ng/mL的妥拉唑林混合標準工作液。準確移取上述混合標準工作液于各容量瓶中，用甲醇稀釋配制成以下質量質量濃度，酚妥拉明、哌唑嗪的標準工作曲線范圍為：0.5ng/mL～50ng/mL；特拉唑嗪、育亨賓的標準工作曲線范圍為：0.25ng/mL～25ng/mL；妥拉唑林的標準工作曲線范圍為2ng/mL～200ng/mL，標準品、儲備液、中間液、工作液于-20℃冷凍保存。

1.3.2其余溶劑的配制

0.1mol/LHCl：準確移取9mL鹽酸溶液于1000mL容量中，用水定容至刻度；鹽酸甲醇（20∶80）：準確移取20mL0.1mol/LHCl于100mL容量中，用甲醇定容至刻度；5%氨水甲醇溶液：準確移取5mL氨水溶液于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

1.3.3樣品前處理

準確稱取約1g（準確至0.01g）試樣于15mL離心管中，加入10mL鹽酸甲醇，渦旋混勻5min，待下一步凈化，取MCX固相萃取柱（60mg/3mL，在填料相同規(guī)格的條件下，可用相近柱管替代），先用6mL甲醇及6mL水活化，上樣后先后用2mL水、1mL甲醇淋洗，最后用5mL氨水甲醇洗脫，洗脫液于40℃下氮吹干，甲醇定容至10mL容量瓶中，過0.45μm有機濾膜，待測。

1.3.4儀器條件

色譜柱：ACQUITYBEHC181.7μm2.1×100mm；柱溫：40℃；進樣量：5μL；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；流速：0.25mL/min；梯度洗脫；實驗過程中流動相梯度見表1。

質譜條件：離子源：電噴霧離子源（ESI）；檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）；掃描方式：正離子模式；噴霧電壓：5500V；氣簾氣：35Psi；加熱溫度：550℃；噴霧氣：50Psi；輔助加熱氣：50Psi；監(jiān)測離子對等信息詳見表2。

2結果與分析

2.1色譜及質譜條件優(yōu)化

試驗參考BJS201808[18]流動相體系進行優(yōu)化，以優(yōu)化分析時長，兼顧批量檢測為目的，嘗試以乙腈0.1%甲酸水、0.1%甲酸乙腈0.1%甲酸水為流動相體系。通過試驗證明，以乙腈0.1%甲酸水為流動相，初始乙腈比例為20%，分析時長為5.5min，妥拉唑林、特拉唑嗪、哌唑嗪、育亨賓、酚妥拉明5種待測物可依次出峰，但妥拉唑林出現(xiàn)雙峰情況，需進一步優(yōu)化液相條件，降低初始流動相乙腈比例為10%，分析時間調整為6min，5種化合物出峰順序不變，且可解決妥拉唑林出峰不正常情況；保持原有梯度不變，有機相改為0.1%甲酸乙腈，5種成分出峰時間略有提前，但無明顯差異，因此，最終選擇乙腈0.1%甲酸水作為流動相。

5種目標檢測成分的質譜參數(shù)經優(yōu)化后，見表2。

2.2前處理條件優(yōu)化

為定量準確，結合5種待測成分的的化學特質，試驗以甲醇作為提取溶劑，以料液比為1：10進行提取，監(jiān)測加標回收率，但涼茶中成分復雜[19]，含有多種有機酸和黃酮苷類等成分，直接提取后檢測受基質影響大，容易導致回收率偏低，且涼茶種類多，難以選擇合適的空白基質作基質曲線。因此試驗向陰性樣品中添加1倍定量限、2倍定量限，10倍定量限3個濃度水平的混合標準溶液，完成加標、提取步驟后，分別用HLB、MCX、MAX固相萃取柱對提取液進行凈化，以加標回收率綜合評價提取及凈化效果，結果如表3所示。

根據(jù)GB27404—2008《實驗室質量控制規(guī)范食品理化檢測》附錄F的要求，當添加量＜0.1mg/kg時，回收率范圍為60%～120%，直接提取試驗中，回收率為56.3%～88.8%，相對標準偏差RSD為0.78%～3.95%，受基質背景影響，5個待測成分中，哌唑嗪的回收率出現(xiàn)低于60%的情況，而經過常用的針對中等極性的酸性中性堿性的HLB固相萃取柱凈化后，除妥拉唑林外，其余4種化合物回收率均大于60%；針對哌唑嗪及妥拉唑林回收率不高的情況，借鑒受體阻斷劑常用的MCX、MAX固相萃取柱進行凈化后，MAX固相萃取柱對各化合物的保留不強甚至出現(xiàn)不保留現(xiàn)象，回收率大部分＜60%，而經過具有反向及陽離子交換雙重保留性能的MCX柱后，回收率在70.9%～96.3%，該表現(xiàn)優(yōu)于直接提取及HLB柱凈化，應用該固相萃取柱凈化后，準確度及精密度均符合定量要求，可用于日常涼茶中5種α-受體阻斷劑的檢測。

2.3方法的線性范圍、檢出限及定量限

按照2.3.1方法配制混合標準工作溶液，按1.3.4中確定的色譜和質譜條件進樣，以峰面積為縱坐標Y，質量濃度為橫坐標X，外標法作線性回歸方程。以3倍信噪比（S/N=3）確定方法的檢出限，10倍信噪比（S/N=10）為方法的定量限。結果表明，5種α-受體阻斷劑在各自的濃度范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系，線性相關系數(shù)均大于0.994。5種α-受體阻斷劑的線性方程、相關系數(shù)、檢出限及定量限見表4。

2.4實際樣品測定

采用本研究建立的方法對廣東省市售的30批次涼茶進行檢測，均未發(fā)現(xiàn)上述5種α-受體阻斷劑的非法添加情況，但由于涼茶種類眾多，且非法添加情況可能集中在自制自售的涼茶作坊，因此，建立5種α-受體阻斷劑的高效檢測方法，進行持續(xù)跟蹤具有一定的現(xiàn)實意義。

3結論

本研究建立了一種同時測定涼茶中5種α-受體阻斷劑的高效液相色譜-串聯(lián)質譜檢測方法，對色譜條件及前處理條件進行了優(yōu)化，采用WatersACQUITYUPLC（BEHC181.7μm）色譜柱分離，以甲酸水（0.1%）和乙腈為流動相進行梯度洗脫，采用多反應監(jiān)測正離子模式（ESI+），6min內可完成所有組分檢測，可有效縮短分析時間，經過MCX柱凈化可降低多種基質效應，結合LOD、LOQ、回收率等方法學考察。該方法簡便、高效，能為涼茶中α-受體阻斷劑的的檢測提供科學基礎。