翟弋焱，陳美琳，黃佳奇，時 銳，伍 超，張景媛，張繁芹，王 偉，程國良，李 冰，譚影影，黃志鴻，巫志姍，吳嘉瑞#

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029; 2.魯南制藥集團股份有限公司醫(yī)學(xué)部，山東 臨沂 276005)

痔瘡為臨床常見的疾病，而且發(fā)病因素較為復(fù)雜，受到自身生理因素與外界環(huán)境因素的共同影響，同時該病復(fù)發(fā)率高，難以完全治愈[1]。國內(nèi)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，痔瘡的發(fā)病率占肛腸類疾病的87.25%[2]。中醫(yī)治療痔瘡的歷史非常悠久。張仲景在《金匱要略》中已經(jīng)記載，“先血后便，此近血也，赤小豆當(dāng)歸散主之”，提出了鑒別痔瘡出血的方法以及對應(yīng)的治療方藥。孫思邈的《千金要方》中記載了多首內(nèi)治方藥，如槐子丸、刺皮丸和內(nèi)補散等，沿用至今也有明顯療效[3]。中醫(yī)認(rèn)為，痔瘡主要是由久坐、久蹲、便秘、瀉痢、情志失調(diào)和氣血虛等因素影響臟腑功能，再加上風(fēng)、濕、熱等邪氣下迫大腸阻滯于肛門從而產(chǎn)生[4]。中醫(yī)對于痔瘡的治療主要為內(nèi)治法與外治法。內(nèi)治法以湯劑和中成藥為主，多使用清熱解毒、清熱涼血、活血化瘀和清熱燥濕類藥物；外治法以散、膏、栓等劑型為主，直達(dá)病位進(jìn)行治療[5]。脈絡(luò)舒通丸由黃芪、金銀花、黃柏、蒼術(shù)、薏苡仁、玄參、當(dāng)歸、白芍、甘草、水蛭、全蝎和蜈蚣12味藥組成，諸藥配伍，共奏清熱解毒、利濕消腫、化瘀通絡(luò)之功，在臨床常被用于治療濕熱瘀阻脈絡(luò)之靜脈血管血栓性疾病，但其治療痔瘡的具體作用機制尚不明確，值得深入研究。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，結(jié)合分子對接技術(shù)，探討脈絡(luò)舒通丸治療痔瘡的作用機制。

1 資料與方法

1.1 脈絡(luò)舒通丸活性成分的篩選與靶點預(yù)測

使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP，http: //tcmspw.com/)，以“黃芪”“金銀花”“黃柏”“蒼術(shù)”“薏苡仁”“玄參”“當(dāng)歸”“白芍”“甘草”“水蛭”“蜈蚣”和“全蝎”為關(guān)鍵詞檢索脈絡(luò)舒通丸中的化學(xué)成分。進(jìn)行相關(guān)參數(shù)的設(shè)置：口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18。同時檢索中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫、PubMed等數(shù)據(jù)庫中關(guān)于脈絡(luò)舒通丸化學(xué)成分研究的文獻(xiàn)，對脈絡(luò)舒通丸的化合物進(jìn)行補充。以上述操作篩選后的成分作為活性成分，使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)查詢靶點蛋白對應(yīng)的基因名稱。

1.2 痔瘡相關(guān)靶點的篩選

使用DisGeNET(https://www.Disgenet.org/search/)和GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫，檢索關(guān)鍵詞為“hemorrhoids”，獲得疾病基因，合并2個數(shù)據(jù)庫的結(jié)果，去除重復(fù)項后得到痔瘡的相關(guān)靶點。

1.3 脈絡(luò)舒通丸化學(xué)成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

使用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建脈絡(luò)舒通丸化學(xué)成分與相關(guān)靶點的成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。根據(jù)度值、緊密度和介數(shù)等相關(guān)參數(shù)進(jìn)行篩選得到關(guān)鍵的靶點。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建與模塊分析

對脈絡(luò)舒通丸靶點與痔瘡的靶點取交集，經(jīng)過STRING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)分析得到PPI網(wǎng)絡(luò)，將其導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行分析，利用MCODE插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊分析。

1.5 基因本體(GO)功能富集分析與京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

使用R軟件對模塊分析后獲得的脈絡(luò)舒通丸治療痔瘡的關(guān)鍵基因進(jìn)行GO與KEGG分析，再利用R軟件對其結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.6 分子對接

對PPI網(wǎng)絡(luò)中的介數(shù)、緊密度和度值3個參數(shù)進(jìn)行篩選得到8個關(guān)鍵靶點，對這些靶點與其相對應(yīng)的化合物進(jìn)行分子對接。從PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲得這些化合物的SDF格式文件，使用Chem 3D 19.0軟件將其轉(zhuǎn)變?yōu)閜db格式文件。利用軟件設(shè)置可旋轉(zhuǎn)鍵與活動鍵時需要移動的最少的原子數(shù)目，將其保存為PDBQT格式。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)通過RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)篩選獲得，同時刪除所獲得蛋白質(zhì)中的水分子、原小分子配體等。利用Autodock Tools 1.5.6軟件對蛋白質(zhì)進(jìn)行加電荷、加氫等操作，然后設(shè)置Grid Box坐標(biāo)與盒子大小。最后，使用Autodock Vina 1.1.2進(jìn)行運算對接。整理分析對接結(jié)果，根據(jù)結(jié)合能進(jìn)行排序，選擇結(jié)合能最低的對接結(jié)果使用PyMol 2.3.2軟件進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖包括525個節(jié)點，3 121條邊，其中215個化合物和310個靶點關(guān)聯(lián)，見圖1。

菱形代表化合物的靶點；倒三角形代表藥物；圓形代表藥物相對應(yīng)的化學(xué)成分；正六邊形代表藥物的共有成分

2.2 潛在靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

對化合物的靶點與疾病的靶點取交集得到148個交集靶點，制作韋恩圖，見圖2。將交集靶點通過STRING網(wǎng)站進(jìn)行分析，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件制作PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。圖3中，每個節(jié)點的大小代表了其度值，顏色由淺到深代表了緊密中心由大到??；圖中有143個節(jié)點，1 835條邊。使用MCODE插件進(jìn)行模塊分析，進(jìn)行模塊可視化，見圖4。聚類得分高的模塊意味著其中的靶點關(guān)系更密切，共同參與某種生物途徑。

圖2 脈絡(luò)舒通丸與痔瘡的交集靶點圖

圖3 脈絡(luò)舒通丸相關(guān)靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

A.模塊1(聚類得分為34.682分)；B.模塊2(聚類得分為3.75分)

2.3 GO功能富集與KEGG通路富集分析

對PPI網(wǎng)絡(luò)與模塊都進(jìn)行GO功能富集與KEGG通路富集分析。對PPI網(wǎng)絡(luò)的分析共得到161條KEGG通路，3 041條GO功能條目。GO功能條目中，包括2 706條生物過程(BP)相關(guān)條目，140條細(xì)胞成分(CC)相關(guān)條目，195條分子功能(MF)相關(guān)條目，P值最低的10個生物過程相關(guān)條目為對化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)、對有機物的反應(yīng)、對生物質(zhì)量調(diào)控、細(xì)胞對化學(xué)刺激的反應(yīng)、多細(xì)胞生物過程的調(diào)控、細(xì)胞對有機物質(zhì)的反應(yīng)、對外部刺激的反應(yīng)、對含氧化合物的響應(yīng)、細(xì)胞群體增殖和對分子功能的正向調(diào)節(jié)；KEGG通路富集分析中，P值最低的前20條通路為癌癥通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號通路、蛋白多糖與癌癥、絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號通路、乙型肝炎、化學(xué)致癌-受體激活、前列腺癌、晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)-AGE受體(RAGE)信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用、丙型肝炎、甲型流感、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、細(xì)胞凋亡、流體切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、癌癥的中樞碳代謝、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌及膀胱癌，見圖5—6。

圖5 脈絡(luò)舒通丸治療痔瘡PPI網(wǎng)絡(luò)模塊GO和KEGG富集分析結(jié)果

2.4 藥物-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖

對模塊網(wǎng)絡(luò)中的度值、緊密度和介數(shù)3個參數(shù)進(jìn)行篩選得到8個核心基因，分別為蛋白激酶B(Akt)1、腫瘤蛋白p53(TP53)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、表皮生長因子受體(EGFR)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、雌激素受體1(ESR1)、缺氧誘導(dǎo)因子1A(HIF1A)和腫瘤壞死因子(TNF)。對其進(jìn)行分析，選擇其中的部分通路進(jìn)行了可視化，見圖7；將分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制藥物-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，見圖8。

2.5 分子對接

使用AutoDockTools 1.5.6軟件對8個關(guān)鍵靶點及其相對應(yīng)的化合物進(jìn)行分子對接。選擇部分對接結(jié)果進(jìn)行可視化處理，見圖9。一般來說，結(jié)合能越小，對接效果越好。

圖6 脈絡(luò)舒通丸治療痔瘡PPI網(wǎng)絡(luò)GO和KEGG富集分析結(jié)果

五角星表示脈絡(luò)舒通丸作用的靶點

圓形代表藥物，菱形代表關(guān)鍵化合物，正八邊形代表關(guān)鍵靶點，矩形代表通路；hsa05200為癌癥通路，hsa05205為癌癥中的蛋白多糖，hsa05163為人類巨細(xì)胞病毒感染，hsa05165為人乳頭瘤病毒感染，hsa05167為卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染，hsa04151為PI3K-Akt信號通路，hsa01521為EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性，hsa04010為MAPK信號通路，hsa05224為乳腺癌

A.槲皮素與VEGFA(結(jié)合能：-38.074 4 kJ/mol)；B.槲皮素與EGFR(結(jié)合能：-33.890 4 kJ/mol)；C.小檗堿與ESR1(結(jié)合能：-40.584 8 kJ/mol)；D.木犀草素與IL-6(結(jié)合能：-35.145 6 kJ/mol)；E.槲皮素與IL-6(結(jié)合能：-33.890 4 kJ/mol)；F.槲皮素與TNF(結(jié)合能：-29.706 4 kJ/mol)；G.木犀草素與TNF(結(jié)合能：-30.124 8 kJ/mol)；H.木犀草素與TP53(結(jié)合能：-29.288 0 kJ/mol)

3 討論

痔瘡是肛管皮膚下靜脈叢擴張、屈曲形成的柔軟靜脈團，其主要特征為肛門疼痛、有墜脹感、瘙癢和肛周濕疹等。該病是常見的肛腸類疾病，可發(fā)生于任意年齡。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，痔瘡在20～40歲人群中較多見，且隨著年齡的增長而加重[6]。部分患者由于患有痔瘡，恐懼排便，久之導(dǎo)致便秘，反而加重原有痔瘡的病情。余文美等[7]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脈絡(luò)舒通丸對于痔瘡過程中的紅腫熱痛以及術(shù)后的創(chuàng)面恢復(fù)具有顯著療效，能有效抑制炎癥反應(yīng)。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接的方法預(yù)測了脈絡(luò)舒通丸治療痔瘡的作用機制。通過數(shù)據(jù)庫與文獻(xiàn)檢索得到脈絡(luò)舒通丸中的215個化合物與310個靶點，通過關(guān)鍵靶點的篩選以及分子對接的驗證發(fā)現(xiàn)了脈絡(luò)舒通丸發(fā)揮作用可能的關(guān)鍵化學(xué)成分。如芒柄花素是黃芪和甘草中的化學(xué)成分，為異黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、提高免疫功能、抗腫瘤及雌激素樣作用等功效[8]。張彥平等[9]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，芒柄花素可以提升小鼠胸腺及脾臟的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)小鼠免疫相關(guān)細(xì)胞因子、淋巴細(xì)胞增殖，進(jìn)一步提高機體細(xì)胞免疫和體液免疫的功能。槲皮素是黃芪、黃柏、金銀花和甘草的共有化學(xué)成分，為黃酮類化合物，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤及調(diào)節(jié)免疫等功效[10]。司麗君等[11]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有良好的抗炎活性，能減少炎癥細(xì)胞活性氧和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的釋放，可以選擇性抑制環(huán)氧合酶2(COX-2)，還能促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖。任改艷等[12]通過實驗證實了槲皮素對脂多糖誘導(dǎo)小鼠RAW264.7細(xì)胞炎癥具有抑制作用，具體的機制可能是槲皮素參與調(diào)控Toll樣受體4/核因子κB(NF-κB)通路，從而抑制COX-2和細(xì)胞炎癥因子IL-6、TNF-α及白細(xì)胞介素1β的表達(dá)。木犀草素是金銀花的活性成分，為黃酮類化合物，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化和抗病毒等多種功效[13]。研究結(jié)果表明，木犀草素具有顯著的抗炎作用，主要通過降低多種促炎細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-6和白細(xì)胞介素8等)、趨化因子(如MCP-1)的表達(dá)而發(fā)揮作用[14]。木犀草素的抗炎活性還與其調(diào)控促炎基因相關(guān)。NF-κB是促炎基因表達(dá)調(diào)節(jié)的因子之一，正常情況下NF-κB與其抑制蛋白互相結(jié)合存在于細(xì)胞質(zhì)中不表達(dá)活性，一旦受到刺激，抑制蛋白被降解，NF-κB被釋放，從而誘導(dǎo)多種靶基因轉(zhuǎn)錄，加劇炎癥反應(yīng)[15-16]。Kim等[17]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，木犀草素可以通過干擾P300與TNF-α啟動子區(qū)間結(jié)合，減少乙?；?HAT)與NF-κB和TNF-α乙?；南嗷プ饔茫M(jìn)而抑制NF-κB下游促炎因子轉(zhuǎn)錄，減輕炎癥反應(yīng)。漢黃芩素是蒼術(shù)的活性成分，為黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗病毒和神經(jīng)保護等功效。有研究結(jié)果表明，漢黃芩素能抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)一氧化氮和前列腺素E2的產(chǎn)生，同時對COX-2有直接的抑制作用[18]。Tang等[19]發(fā)現(xiàn)，漢黃芩素能夠提高自然殺傷細(xì)胞的殺傷作用和巨噬細(xì)胞的吞噬作用，劑量依賴性地增加細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1α、TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平，抑制NF-κB的下游表達(dá)，表明漢黃芩素有良好的抗炎活性。

對成分-靶點網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，同時查閱相關(guān)文獻(xiàn)，最終發(fā)現(xiàn)Akt1、TP53、IL-6、EGFR、VEGFA、ESR1、HIF1A和TNF可能是藥物發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶點。脈絡(luò)舒通丸可能通過抑制炎癥反應(yīng)、提高免疫和促進(jìn)細(xì)胞增殖等多個分子機制來發(fā)揮治療痔瘡的作用。在痔瘡的發(fā)生發(fā)展以及愈合的過程中會引發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)[20]。IL-6、TNF-α是重要的促炎因子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用[21-23]。IL-6、TNF-α等炎癥因子所誘導(dǎo)的免疫機制在抗菌抗感染的同時，也會不可避免的對感染部位造成一定的炎癥病理性損害[24-25]。林巧娟等[26]對大鼠痔瘡術(shù)后的創(chuàng)面愈合階段中血清炎癥因子的表達(dá)量進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)使用肛愈散治療后IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)量均顯著降低。分子對接結(jié)果表明，脈絡(luò)舒通丸中槲皮素、木犀草素等化合物與IL-6、TNF-α有較強的結(jié)合能力，并且能抑制TNF-α、IL-6的產(chǎn)生[27]。EGFR是廣泛分布于人體各組織細(xì)胞膜上的糖蛋白，具有酪氨酸激酶的活性，EGFR及其配體是細(xì)胞信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的一部分，研究結(jié)果表明，EGFR的信號傳導(dǎo)關(guān)乎細(xì)胞的凋亡、增殖、分化、遷移和細(xì)胞周期循環(huán)[28]。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGFR可以加速創(chuàng)面細(xì)胞分裂，促進(jìn)細(xì)胞增殖，改變細(xì)胞的趨化性，增加細(xì)胞的遷移從而加速創(chuàng)面愈合[29]。VEGFA是作用較強的一種促血管生長因子，是新生血管形成中心調(diào)控因子的有絲分裂原，其表達(dá)對血管內(nèi)皮細(xì)胞的異常增殖具有重要作用[30]。胡春華等[31]通過對臨床患者組織微血管的觀測，認(rèn)為VEGFA參與了痔瘡的形成過程，抑制VEGFA的表達(dá)有利于痔瘡的恢復(fù)。槲皮素是脈絡(luò)舒通丸的一種有效成分，分子對接結(jié)果顯示，其與VEGFR和EGFR有較強的結(jié)合能力。王曉慶等[32]通過血管增生模型觀測槲皮素對于血管生成的影響，發(fā)現(xiàn)槲皮素能抑制VEGF和堿性成纖維生長因子所誘導(dǎo)的血管生成，同時對內(nèi)皮細(xì)胞增殖具有抑制作用[33]。脈絡(luò)舒通丸可能是通過調(diào)節(jié)上述靶點來發(fā)揮治療痔瘡的作用。

GO與KEGG富集分析結(jié)果顯示，脈絡(luò)舒通丸有效成分調(diào)控的靶點集中在多種BP、CC和MF上，如細(xì)胞對化學(xué)刺激的反應(yīng)、多細(xì)胞生物過程的調(diào)控、細(xì)胞對有機物質(zhì)的反應(yīng)、對外部刺激的反應(yīng)、對含氧化合物的響應(yīng)、細(xì)胞增殖及對分子功能的正向調(diào)節(jié)等。脈絡(luò)舒通丸治療痔瘡可能是作用于PI3K-Akt信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、MAPK信號通路、癌癥通路、癌癥中的蛋白多糖、人類巨細(xì)胞病毒感染、人乳頭瘤病毒感染、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染及乳腺癌等信號通路。這些通路與痔瘡的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。MAPK信號通路主要調(diào)控炎癥相關(guān)基因的表達(dá)、細(xì)胞能量代謝、細(xì)胞增殖和凋亡等，該通路的激活途徑相對保守[34-35]。

綜上所述，脈絡(luò)舒通丸可以通過調(diào)控炎癥反應(yīng)來治療痔瘡以及痔瘡術(shù)后創(chuàng)面的愈合。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探索了脈絡(luò)舒通丸治療痔瘡的作用機制并通過分子對接驗證。在系統(tǒng)層面揭示了脈絡(luò)舒通丸可能是通過抑制炎癥反應(yīng)、提高免疫、促進(jìn)細(xì)胞增殖等多個分子機制來發(fā)揮治療痔瘡的作用。然而，本研究主要基于數(shù)據(jù)分析開展研究，因此需要進(jìn)一步的體內(nèi)、體外實驗來驗證研究結(jié)果。