摘 要：力學(xué)刺激下活細(xì)胞行為變化對(duì)于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)具有重要意義，而常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)裝置難以同時(shí)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞應(yīng)力加載下的實(shí)時(shí)觀測(cè)。該文提出將基于負(fù)壓控制的細(xì)胞應(yīng)力加載與細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)態(tài)觀測(cè)進(jìn)行原位集成，設(shè)計(jì)制造集成化載物臺(tái)培養(yǎng)器，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果表明，該裝置能夠通過設(shè)定細(xì)胞基底應(yīng)變量，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在特定應(yīng)力加載下的持續(xù)培養(yǎng)與實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。該文為集成化載物臺(tái)細(xì)胞培養(yǎng)裝置的設(shè)計(jì)制造提供有效技術(shù)方法。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞培養(yǎng)；細(xì)胞應(yīng)力加載；Arduino程序開發(fā)；自動(dòng)化設(shè)計(jì)；有限元仿真

中圖分類號(hào)：Q274 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-2945（2024）31-0012-05

Abstract： Changes in the behavior of living cells under mechanical stimulation are of great significance to biology and medicine， but it is difficult for conventional cell culture devices to simultaneously realize real-time observation of cells under stress loading. This paper proposes to integrate cell stress loading based on negative pressure control with cell culture and dynamic observation in situ. An integrated stage incubator is designed and manufactured， and experimental verification is carried out. The results show that the device can achieve continuous cultivation and real-time monitoring of cells under specific stress loading by setting the strain on the cell substrate. This papeBb9C2t6sEZhNXWDsDlUCww==r provides an effective technical method for the design and manufacture of integrated stage cell culture devices.

Keywords： cell culture; cell stress loading; Arduino program development; automated design; finite element simulation

對(duì)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)和實(shí)時(shí)顯微觀察具有重要意義[1-2]。目前在國(guó)內(nèi)外各類細(xì)胞培養(yǎng)箱裝置中，衍生出了一種可以在培養(yǎng)細(xì)胞的同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)顯微圖像采集的產(chǎn)品，即活細(xì)胞工作站[3-4]。該裝置基于倒置顯微鏡和相機(jī)，構(gòu)建配套的小型細(xì)胞培養(yǎng)箱，可動(dòng)態(tài)觀察活細(xì)胞行為。生物體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡和遷移等生物學(xué)過程都會(huì)受到力學(xué)因素影響[5-8]。作為生物力學(xué)中的前沿領(lǐng)域[9]，細(xì)胞力學(xué)的其中一項(xiàng)研究目的是通過對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境施加各種力學(xué)因素[10]，觀察細(xì)胞對(duì)力學(xué)刺激的響應(yīng)[11-13]。然而，此類活細(xì)胞工作站產(chǎn)品成本較高，且不利于直接集成對(duì)細(xì)胞的應(yīng)力加載裝置，限制了在大量常規(guī)實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。

牽張應(yīng)力是生物體內(nèi)最常見應(yīng)力，研究其作用下細(xì)胞的生理變化對(duì)生物學(xué)和醫(yī)學(xué)具有重要意義，是近年研究的熱點(diǎn)[10，14]。負(fù)壓加載技術(shù)將彈性薄膜基底下方的封閉空間抽氣產(chǎn)生負(fù)壓，使薄膜上方和下方產(chǎn)生壓力差，從而發(fā)生形變實(shí)現(xiàn)牽張應(yīng)力加載。目前的負(fù)壓加載裝置能夠控制基底應(yīng)變量[15]，但未實(shí)現(xiàn)與培養(yǎng)裝置的集成。本文提出將基于負(fù)壓加載的細(xì)胞應(yīng)力加載與細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)態(tài)觀測(cè)功能進(jìn)行原位集成，能夠同時(shí)滿足體外培養(yǎng)、顯微觀察拍照、應(yīng)力加載等需求，并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1 載物臺(tái)式微型細(xì)胞培養(yǎng)器的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

載物臺(tái)式微型細(xì)胞培養(yǎng)器腔室的三維設(shè)計(jì)如圖1（a）所示，其三維模型俯視圖如圖1（b）所示?？?安裝傳感器及其套筒；孔2為CO2進(jìn)氣孔；孔3—孔6為發(fā)熱片和微型風(fēng)扇導(dǎo)線孔；孔7為溫度傳感器導(dǎo)線孔；孔8為M5螺紋孔，分布于4角，用于密封連接。箱體底面設(shè)有一凹槽用來安裝培養(yǎng)板支架，并通過7個(gè)M3的螺紋孔（孔9）固定；培養(yǎng)器內(nèi)部底面設(shè)有凹槽10—凹槽12，用于與3塊夾層板配合。

2 細(xì)胞應(yīng)力加載模塊設(shè)計(jì)

2.1 應(yīng)力加載裝置設(shè)計(jì)

本設(shè)計(jì)采用負(fù)壓加載法來對(duì)細(xì)胞施加牽張應(yīng)力，加載系統(tǒng)如圖2（a）所示。真空泵和電磁閥打開時(shí)（N1和N2連通），真空泵抽氣使封閉空間內(nèi)形成負(fù)壓，使彈性基底產(chǎn)生形變，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞應(yīng)力加載。

負(fù)壓加載裝置實(shí)物圖和三維模型剖面結(jié)構(gòu)圖如圖2（b）所示：去除多孔培養(yǎng)板內(nèi)某個(gè)培養(yǎng)孔的底面，將彈性基底薄膜貼固在培養(yǎng)孔中空的下底面上，使用法蘭裝置與螺栓和螺母配合將彈性基底薄膜壓緊。細(xì)胞接種在薄膜上方，其在上表面貼壁生長(zhǎng)。使用波紋軟管將法蘭與顯微鏡鏡頭連通并密封，軟管側(cè)壁上出氣孔與氣壓傳感器艙室的進(jìn)氣孔相連。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)之后，使用真空泵抽氣，封閉空間內(nèi)的氣壓低于彈性基底薄膜上方的標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，在氣壓差作用下彈性基底薄膜發(fā)生形變，其上方貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞也相應(yīng)地發(fā)生形變，產(chǎn)生牽張應(yīng)力。細(xì)胞應(yīng)力加載模塊的控制流程如圖3所示。

2.2 彈性基底選取及參數(shù)計(jì)算

本文使用聚二甲基硅氧烷材料（PDMS）作為彈性基底[16-17]。不同混合比制成的PDMS具有不同的力學(xué)性質(zhì)，PDMS基液與其固化劑以10∶1的質(zhì)量比混合時(shí)，其彈性模量E為2.25 MPa，泊松比μ為0.49，本文使用的 PDMS薄膜厚度為0.2 mm。使用圓形基底拉伸法[18]進(jìn)行牽張應(yīng)力加載時(shí)，圓形基底在外部氣壓作用下會(huì)凹陷為球冠狀，如圖4（a）所示，其中，圓形PDMS薄膜的總半徑R0為15 mm，厚度h為0.2 mm，除去被壓緊的部分，可進(jìn)行應(yīng)力加載的圓形部分的半徑R1為10.4 mm，其圓心位置在垂直方向的位移為t，球冠半徑為R2，α為球冠張角的1/2，Pa為培養(yǎng)器內(nèi)PDMS薄膜上方的氣壓，Pb為PDMS薄膜下方封閉空間的氣壓。

根據(jù)圓形薄膜應(yīng)變的計(jì)算方式[19]，計(jì)算出PDMS薄膜的拉伸應(yīng)變

式中：S1和S2分別為薄膜加載前、后的有效表面積。根據(jù)PDMS薄膜及力加載孔結(jié)構(gòu)的幾何特征，可計(jì)算得出

加載后PDMS薄膜應(yīng)力即近似為貼壁細(xì)胞受到的應(yīng)力σ。由圖4（a）可知，PDMS薄膜在豎直方向受到的合力F3等于細(xì)胞及其培養(yǎng)基的壓力F1和薄膜上方和下方的氣壓差施加的壓力F2之和，即

F3=F1+F2 。 （3）

其中，PDMS薄膜上方的氣壓為Pa，薄膜下方的氣壓為Pb，所以

式中：R1=1.04×10-2 m，F(xiàn)1=9.898×10-3 N，E=2.25×106 Pa，μ=0.49，Pa=101 325 Pa，h=2×10-4 m，π=3.14。

將以上參數(shù)值代入式 （8） 中可以得到

σ=72 860.329 59R2+2 500×R2（101 325-Pb）。 （11）

將參數(shù)值和式（11）代入式（9）中得到

ε=1.651 50×10-2R2+5.666 67×10-4R2（101 325-Pb）。（12）

將參數(shù)代入式（10）中可以得到

t2=1.786 26×10-6R2+6.129 07×10-8R2（101 325-Pb）。（13）

至此，求出了σ、ε、t與Pb、R2的關(guān)系。

將細(xì)胞所受的拉伸應(yīng)變?chǔ)湃?%代入式（2）可得到PDMS薄膜中心點(diǎn)在垂直方向的位移t，然后結(jié)合式（11）—式（13），得出t=2.326×10-3 m，R2=2.441×10-2 m；Pb=97 739 Pa，F(xiàn)3=1.227 78 N。

2.3 PDMS薄膜的有限元分析

本文使用有限元分析軟件ANSYS（試用版）對(duì)PDMS薄膜加載形變之后的位移和應(yīng)力情況進(jìn)行研究。本文建模仿真了5%應(yīng)變狀態(tài)下PDMS薄膜的位移和應(yīng)力分布圖（圖4）。位移量從PDMS薄膜四周至中心遞增，在中心位置達(dá)到最大。四周和中心應(yīng)力最大，從四周到中心應(yīng)力先減小后增大（圖4（b）和圖4（c））。

2.4 系統(tǒng)硬件配置與程序設(shè)計(jì)

為了測(cè)量和控制氣壓值Pb，本文選擇STM8L051F3氣壓傳感器，其以一定的頻率輸出氣壓值（例如0.5 s 或者1 s）。選取上?？瑺柫黧w科技有限公司的KVP04微型真空泵進(jìn)行抽氣，選擇CDG1-1DD固態(tài)繼電器控制氣路三通電磁閥（型號(hào)FA0520F，圖中省略了電磁閥），如圖5所示。固態(tài)繼電器B為擴(kuò)展部件，用于控制其他氣體管路的電磁閥。Arduino控制板從氣壓傳感器中讀出數(shù)據(jù)，同時(shí)通過控制真空泵轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)氣壓Pb，從而控制薄膜的形變。

3 試驗(yàn)

3.1 細(xì)胞體外培養(yǎng)試驗(yàn)

本文使用P5代小鼠成肌細(xì)胞（C2C12細(xì)胞）進(jìn)行試驗(yàn)。將傳代后的細(xì)胞在ICW190培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h后，移入到微型培養(yǎng)器腔室內(nèi)（圖6（a））。圖6（b）為12孔培養(yǎng)板示意圖。圖6（c）為細(xì)胞原位培養(yǎng)器裝置整體圖。通過72 h細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)試，發(fā)現(xiàn)B2、B3和B4孔的細(xì)胞貼壁黏附率和生長(zhǎng)速率達(dá)到最佳狀態(tài)。因此，之后使用B3孔進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

3.2 細(xì)胞應(yīng)力加載試驗(yàn)

應(yīng)力加載試驗(yàn)使用12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的B3孔進(jìn)行，將傳代后的細(xì)胞植入載物臺(tái)式微型細(xì)胞培養(yǎng)器中培養(yǎng)12 h，待其充分貼壁，以使得力學(xué)刺激可以通過彈性基底傳導(dǎo)至細(xì)胞，之后開始進(jìn)行應(yīng)力加載，使用5%的薄膜應(yīng)變量進(jìn)行加載，即在ArduinoIDE中設(shè)定目標(biāo)氣壓值為97 739 Pa，加載周期為每15 min加載5 min，連續(xù)加載10 h，并每隔1 h進(jìn)行顯微拍照。應(yīng)力加載結(jié)果照片如圖7所示。為了進(jìn)行對(duì)比，本文還進(jìn)行了無應(yīng)力加載的對(duì)照組實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組實(shí)驗(yàn)同樣使用12孔培養(yǎng)板的B3孔進(jìn)行，將傳代后的C2C12細(xì)胞放入常規(guī)ICW190培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后移入本裝置培養(yǎng)10 h，細(xì)胞生長(zhǎng)情況如圖7所示。

對(duì)比圖7中有/無應(yīng)力加載情況下的結(jié)果照片，經(jīng)過PDMS薄膜形變加載10 h的細(xì)胞相對(duì)更細(xì)長(zhǎng)，存在更多成球形的細(xì)胞，也出現(xiàn)了相對(duì)多的碎片，而無應(yīng)力加載（對(duì)照組）細(xì)胞較為飽滿，單個(gè)細(xì)胞的黏附面積更大?？勺C明5%薄膜應(yīng)變狀態(tài)下的應(yīng)力加載對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了一定的刺激。試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了載物臺(tái)培養(yǎng)器內(nèi)集成化細(xì)胞應(yīng)力加載模塊的功能。

4 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)并制作了一種小型化載物臺(tái)細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)同時(shí)集成了微型細(xì)胞培養(yǎng)器模塊、細(xì)胞應(yīng)力加載模塊及細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)圖像自動(dòng)采集模塊，進(jìn)行了相應(yīng)的應(yīng)變應(yīng)力分布的模擬，并使用小鼠成肌細(xì)胞進(jìn)行了應(yīng)力加載試驗(yàn)，驗(yàn)證了本系統(tǒng)內(nèi)各項(xiàng)功能的可行性。

參考文獻(xiàn)：

[1] MERTEN A L， SCH？魻LER U， LESKO C， et al. A novel modular opto-biomechatronics bioreactor for simultaneous isotropic mechanical stretch application and fluorescence microscopy under cell and tissue culture conditions[J]. Biosensors and Bioelectronics： X， 2024（16）： 100437.

[2] TSENG S J， CHENG C H， LEE T M， et al. Studies of osteoblast-like MG-63 cellular proliferation and differentiation with cyclic stretching cell culture system on biomimetic hydrophilic layers modified polydimethylsiloxane substrate[J]. Biochemical Engineering Journal， 2021（168）： 107946.

[3] 槐玉英，宋瑞龍.活細(xì)胞工作站的使用及常見問題分析[J].科技視界，2020（16）：210-212.

[4] 丁君義.培養(yǎng)箱內(nèi)置式細(xì)胞動(dòng)態(tài)三維顯微成像系統(tǒng)設(shè)計(jì)與開發(fā)[D].南京：南京理工大學(xué)，2019.

[5] 葉重陽(yáng).細(xì)胞流體力學(xué)加載裝置設(shè)計(jì)及細(xì)胞力學(xué)理論模型[D].北京：北京理工大學(xué)，2017.

[6] MASUDA T， TAKAHASHI I， ANADA T， et al. Development of a cell culture system loading cyclic mechanical strain to chondrogenic cells[J]. Journal of Biotechnology， 2008， 133（2）： 231-238.

[7] ZHANG W， KONG C W， TONG M H， et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes （hESC-CMs） in 3D collagen matrix： Effects of niche cell supplementation and mechanical stimulation[J]. Acta Biomaterialia， 2017（49）： 204-217.

[8] CUI W， BRYANT M R， SWEET P M， et al. Changes in gene expression in response to mechanical strain in human scleral fibroblasts[J]. Exp Eye Res， 2004，78（2）： 275-284.

[9] 徐志玲，呂永鋼，楊力，等.應(yīng)力加載系統(tǒng)在細(xì)胞力學(xué)研究與教學(xué)中的應(yīng)用[J].實(shí)驗(yàn)室科學(xué)，2018，21（6）：119-124.

[10] TAN H Y， WU Y F， WANG C Y， et al. The cellular responses of corneal fibroblasts to cyclic stretching loads[J]. Experimental Eye Research， 2023，237： 109696.

[11] 馬信龍，李爽，付鑫，等.硅橡膠膜細(xì)胞載體的應(yīng)力分析及生物相容性[J].醫(yī)用生物力學(xué)，2011，26（5）：426-431.

[12] 朱磊.牽張應(yīng)力刺激下Erk1/2在人牙周膜細(xì)胞成骨化的作用分析[J].中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志，2019，47（5）：512-516，519.

[13] ZENG Z， JING D， ZHANG X， et al. Cyclic mechanical stretch promotes energy metabolism in osteoblast-like cells through an mTOR signaling-associated mechanism[J]. Int J Mol Med， 2015，36（4）： 947-956.

[14] YI B， XU Q， LIU W. An overview of substrate stiffness guided cellular response and its applications in tissue regeneration[J]. Bioactive Materials，2022（15）：82-102.

[15] 張振宇，馬家辰，孫玉德.基于C8051f410的細(xì)胞應(yīng)力加載裝置設(shè)計(jì)[J].微處理機(jī)，2009，30（6）：92-94.

[16] EL-MOHRI H， WU Y， MOHANTY S， et al. Impact of matrix stiffness on fibroblast function[J]. Materials Science & Engineering C， 2017：74.

[17] MAPARU A K， SINGH P， RAI B， et al. PDMS nanoparticles-decorated PDMS substrate promotes adhesion， proliferation and differentiation of skin cells[J]. Journal of Colloid and Interface Science， 2024（659）： 629-638.

[18] 仲維廣，胥春，米紅林，等.細(xì)胞應(yīng)變裝置中硅橡膠膜的應(yīng)力分析[J].醫(yī)用生物力學(xué)，2007（2）：121-126，132.

[19] 米紅林，瞿志豪.生物膜材料張力形變干涉相移法的分析[J]. 南京師大學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，32（3）：42-46.