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        一種檢測牛奶中喹諾酮類藥物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法

        2024-10-31 00:00:00韓銀濤龐李艷廖柳媚陳粉娜孫潔唐濤張秋韻羅國強次仁玉珍吳凱
        國外畜牧學(xué)·豬與禽 2024年5期

        摘 要:本文基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了一種高精密度檢測牛奶中喹諾酮類藥物的方法,并對所建立的方法進(jìn)行了方法學(xué)的考察與驗證。本研究參考已有的標(biāo)準(zhǔn),對標(biāo)準(zhǔn)的前處理步驟進(jìn)行優(yōu)化,最后采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析。20種喹諾酮類藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.995 59~0.999 91,方法檢出限為0.051 4~0.928 μg/kg,回收率為73.6%~110.0%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.33%~7.69%。該方法前處理簡便、高效,所得結(jié)果檢出限低,回收率較好,精準(zhǔn)度高,重復(fù)性好,可以為檢驗牛奶中喹諾酮類藥物提供有力的方法支撐。

        關(guān)鍵詞:喹諾酮類藥物;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;高精密度;高回收率

        中圖分類號:TS252.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號:1001-0769(2024)05-0081-08

        喹諾酮類藥物是一種具有抗菌譜廣、抗菌力強、價格低廉等特點的人工合成抗菌藥,其作用機制是抑制DNA回旋酶發(fā)揮作用,導(dǎo)致mRNA與蛋白質(zhì)合成失控從而達(dá)到殺死細(xì)菌的目的[1]。常見的喹諾酮類藥物有諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星等,常用于預(yù)防和治療畜禽細(xì)菌性疾病[2]。但這也不可避免地導(dǎo)致藥物在動物體內(nèi)殘留,繼而經(jīng)口攝入進(jìn)入人體,對人類健康產(chǎn)生不良影響[3]。喹諾酮類藥物可對人體造成多系統(tǒng)的不良反應(yīng),包括胃腸道不適、中樞神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)、肌腱炎及反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、影響軟骨發(fā)育以及肝臟損傷等[1,4]。

        牛奶是日常生活中十分常見的飲品,含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪等,具有很高的營養(yǎng)價值。牛奶在生產(chǎn)、運輸、包裝到銷售的過程中均存在被污染的可能,從而對人體健康產(chǎn)生不良影響。其中抗菌藥濫用導(dǎo)致的藥物殘留是不容忽視的問題,而牛奶中喹諾酮類藥物的殘留現(xiàn)象較為普遍,已成為一個嚴(yán)重的食品安全問題[5]。因此,建立準(zhǔn)確測定牛奶中喹諾酮類藥物殘留的方法至關(guān)重要,對保障牛奶等乳產(chǎn)品的食品質(zhì)量安全和降低健康風(fēng)險具有重要意義。目前,牛奶中喹諾酮類藥物的檢測方法主要有免疫學(xué)方法、高效液相色譜法、超高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)等[6-8]。其中高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對復(fù)雜樣本的分離能力和定性效果好,可同時檢測多種藥物殘留,具有選擇性和靈敏度高的特點,應(yīng)用廣泛[9]。

        現(xiàn)存大多數(shù)研究檢測的喹諾酮類藥物種類較少,不夠全面;現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)GB 29692—2013《牛奶中喹諾酮類藥物殘留量的測定 高效液相色譜法》也只規(guī)定了11種喹諾酮類藥物的測定方法[10]。因此,有必要開發(fā)一個包括更多種類藥物的測定方法。本研究以牛奶為樣本,在國家標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化,建立簡便、快速、可重復(fù)性高的前處理方法,采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對樣本中的依諾沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、麻保沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星、西諾沙星、奧比沙星、萘啶酸、噁喹酸、氟甲喹、吡哌酸、氟羅沙星、加替沙星、司帕沙星、諾氟沙星、洛美沙星、培氟沙星以及氧氟沙星這20種喹諾酮類藥物進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量檢測,以期為喹諾酮類藥物的檢測提供有力的方法及技術(shù)參考。

        1 材料與方法

        1.1 儀器

        Aglient 1290超高效液相色譜儀,美國AB Sciex Triple Quad? 5500質(zhì)譜儀,OAN-EVAP 24型全自動氮吹儀,日本TAITEC Mix-VR多管漩渦混合儀,梅特勒AG285型天平,IKAKS501型旋渦混合器,德國Sigma 3K15冷凍離心機,Millipor超純水儀,新芝SB-1200DT型超聲波清洗機。

        1.2 材料與試劑

        乙腈(色譜純);甲醇(色譜純);甲酸(色譜純);0.2%甲酸甲醇溶液(V甲醇∶V甲酸=100∶0.2);甲醇水溶液(V甲醇∶V水=1∶1)。

        QuEChERS緩沖鹽試劑袋;Waters PRIME HLB(6cc 200 mg)固相萃取柱;快速定量濾紙。

        1.3 樣本制備

        量取適量牛奶,裝入潔凈容器作為試樣,密封并標(biāo)記,放置于-18 ℃冰箱中備用。

        1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

        準(zhǔn)確稱取20種喹諾酮類藥物(依諾沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、麻保沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星、西諾沙星、奧比沙星、萘啶酸、噁喹酸、氟甲喹、吡哌酸、氟羅沙星、加替沙星、司帕沙星、諾氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星)標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇分別配成1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,-20 ℃冰箱中保存,有效期 12個月;分別移取適量1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液于同一容量瓶中,用甲醇稀釋成100 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,-20 ℃冰箱中保存,有效期6個月;再移取100 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

        1.5 樣本前處理

        準(zhǔn)確稱取試樣5.00 g于50 mL離心管中,加入0.2%甲酸甲醇溶液10 mL,渦旋混勻后振蕩5 min,超聲提取5 min,5 000 r/min 離心5 min,收集上清液;向上清液中加入QuEChERS緩沖鹽試劑袋,充分渦旋混合1 min后,5 000 r/min離心10 min,取上清液過快速定量濾紙,所得濾液收集備用。

        移取上述濾液4.0 mL,過PRIME HLB固相萃取柱洗脫,準(zhǔn)確移取2.5 mL洗脫液至15 mL離心管內(nèi),在40 ℃水浴下氮氣吹干,再用甲醇水溶液(體積比1∶1)定容至1.00 mL,渦旋后過0.22 μm濾膜,待HPLC-MS/MS分析。

        1.6 HPLC-MS/MS條件

        1.6.1 高效液相色譜條件

        色譜柱:ACQUITYUPLC BEH C18(1.7 μm,2.1 mm×100 mm);流動相A相為0.1%甲酸水溶液;流動相B相為甲醇;柱溫為40 ℃;進(jìn)樣量5.0 μL。梯度洗脫程序見表1。

        1.6.2 質(zhì)譜條件

        離子源:電噴霧離子源;掃描方式:負(fù)離子掃描;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測;電噴霧電壓為5 500 V;離子源溫度為600 ℃;氣簾氣壓力為28 psi;碰撞氣壓力為10 psi;霧化氣壓力為55 psi;輔助加熱氣壓力為60 psi。

        定性離子對、定量離子對、采集時間、去簇電壓及碰撞能量見表2。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

        按方法條件設(shè)置儀器參數(shù),16種喹諾酮類藥物(依諾沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、麻保沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星、西諾沙星、奧比沙星、萘啶酸、噁喹酸、氟甲喹、吡哌酸、氟羅沙星、加替沙星、司帕沙星)配制濃度為1.00、2.00、20.00、100.00、200.00、300.00 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,其余4種喹諾酮類藥物(諾氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星)配制濃度為1.00、2.00、4.00、20.00、40.00、60.00 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,待儀器參數(shù)穩(wěn)定后,對系列標(biāo)準(zhǔn)樣本溶液進(jìn)行測定,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,相關(guān)系數(shù)r的范圍為0.995 59~0.999 91。具體見表3。

        2.2 方法檢出限確定

        以空白牛奶樣本為基質(zhì),做7個平行添加試驗,陽性添加20種喹諾酮類藥物的濃度均為0.500 0 μg/kg,按照1.4方法進(jìn)行前處理,進(jìn)行上機測定,測得方法檢出限范圍為0.051 4 ~0.928 0 μg/kg,具體見表3。計算公式如下:

        檢出限(μg/kg)=K·Sb·C/X

        式中:K取3;Sb為平行測試樣含量的標(biāo)準(zhǔn)偏差;C為加標(biāo)濃度,μg/kg;X為平行試樣含量的平均值。

        2.3 回收率及精密度確定

        以空白牛奶樣本為基質(zhì),向牛奶樣本中添加16種喹諾酮類藥物(依諾沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、麻保沙星、沙拉沙星、二氟沙星、西諾沙星、奧比沙星、萘啶酸、噁喹酸、氟甲喹、吡哌酸、氟羅沙星、加替沙星、司帕沙星)項目混標(biāo)0.5、10.0、100.0 μg/kg濃度水平,其余4種喹諾酮類藥物(諾氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星)項目混標(biāo)0.5、2.0、20.0 μg/kg濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗。按照方法進(jìn)行前處理,上機測試,結(jié)果如表4及表5所示。

        根據(jù)表4與表5中相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和回收率結(jié)果可發(fā)現(xiàn),該方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較低,且回收率表現(xiàn)較好,回收率為73.6%~110.0%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.33%~7.69%。該方法的檢出限較低,同時重復(fù)性較好,并且能保持較為優(yōu)異的回收率,可用于20種喹諾酮類藥物的準(zhǔn)確定性、定量檢測。

        3 結(jié)論

        本研究在現(xiàn)存標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上,對牛奶中喹諾酮類藥物的前處理過程進(jìn)行了優(yōu)化:純化步驟采用QuEChERS緩沖鹽試劑袋對樣本進(jìn)行初純化,同時緩沖鹽能夠更好地平衡提取體系的pH和防止樣本乳化;使用PRIME HLB小柱進(jìn)行進(jìn)一步純化,可以進(jìn)一步降低基質(zhì)干擾。在高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的分析中也得到了較為滿意的回收率、穩(wěn)定性和精密度結(jié)果。因此,本研究建立了一種基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測牛奶中喹諾酮類藥物的簡便測定方法,為相關(guān)行業(yè)檢測工作提供了檢測方法及技術(shù)參考。

        參考文獻(xiàn)

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        作者簡介:韓銀濤(1982- ),男,學(xué)士,高級獸醫(yī)師,主要從事動物疫病預(yù)防控制相關(guān)工作;E-mail:18738294@qq.com

        共同第一作者:龐李艷(1991- ),女,學(xué)士,獸醫(yī)師;E-mail:348776239@qq.com

        *通信作者:次仁玉珍(1994- ),女,學(xué)士,助理獸醫(yī)師;E-mail: 2449552533@qq.com

        吳凱(1991- ),男,學(xué)士,助理獸醫(yī)師;E-mail: 465358852@qq.com

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