摘 要：本研究分別用鋁膠佐劑和ISA 201佐劑配制的豬細(xì)小病毒病滅活疫苗來免疫乳鼠，乳鼠免疫后表現(xiàn)正常，無死亡；5倍劑量免疫仔豬后，免疫豬未出現(xiàn)不良反應(yīng)；隨后檢測免疫14、21、30、60、90、120、150、180、210 d時(shí)的抗體水平。結(jié)果顯示，用ISA 201佐劑配制的滅活疫苗免疫豬后免疫期可達(dá)6個(gè)月，用鋁膠佐劑配制的滅活疫苗免疫豬后免疫期可達(dá) 5個(gè)月。綜合試驗(yàn)結(jié)果，建議選擇用ISA 201佐劑作為豬細(xì)小病毒病滅活疫苗的佐劑。

關(guān)鍵詞：ISA 201佐劑；鋁膠佐劑；佐劑吸收；不良反應(yīng)；抗體效價(jià)

中圖分類號(hào)：S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2024）05-0033-04

豬細(xì)小病毒病是一種危害養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬細(xì)小病毒病是由細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬中的豬細(xì)小病毒（porcine parvovirus，PPV）引起的一種豬繁殖障礙疾病，可通過胎盤感染胎兒，嚴(yán)重時(shí)引起胎兒死亡[1]。妊娠前期的母豬感染可引起母豬流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、畸形胎、木乃伊胎[2-3]。PPV可與豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒以及豬瘟病毒混合感染，導(dǎo)致病情加重。因此，接種安全、高效疫苗是預(yù)防豬細(xì)小病毒病一種有效的措施[4]。

1 材料

1.1 細(xì)胞及毒株

豬睪丸細(xì)胞（swine testicle cells，ST細(xì)胞）、豬細(xì)小病毒PPVS-1株均由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究保存。

1.2 試劑

DMEM（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）培養(yǎng)基和牛血清均購自GIBICO公司；鋁膠佐劑為美國Chemtrade公司生產(chǎn)；ISA 20b76a4cd9704b7d05170ed41144819f68c8166ada7afe5652214319cab1d1dfb71佐劑為法國SEPPIC公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

乳鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；2月齡的仔豬（PPV HI＜8）來源于江蘇省某豬場。

1.4 試驗(yàn)地點(diǎn)

上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房。

2 方法

2.1 病毒液制備

將活化的豬細(xì)小病毒（PPVS-1株）接種ST細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE）。當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)75％時(shí)收毒，并將其置于－20 ℃冰柜中，反復(fù)凍融3次，離心收集細(xì)胞病毒液，置于－20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 病毒含量測定

2.2.1 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（hemagglutination test，HA）

在微量板上，從第1孔至第12孔，每孔加入25 μL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS，pH 7.2），吸取25 μL備用病毒液，從第1孔起，依次作倍比稀釋，每孔加入0.25％豚鼠紅細(xì)胞懸液25 μL，并設(shè)不加病毒液的紅細(xì)胞為對(duì)照孔，將微量板在振蕩器上搖勻，室溫放置1 h。以使100％紅細(xì)胞凝集的最高稀釋度作為判定終點(diǎn)。

2.2.2 TCID50測定

用細(xì)胞維持液將病毒液作10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8 5個(gè)稀釋度，分別接種于長勢良好的ST細(xì)胞中（96孔細(xì)胞培養(yǎng)板），每個(gè)稀釋度接種4孔，每孔100 μL，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照孔。接種后，置37 ℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中，每日觀察細(xì)胞病變。按Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

2.3 病毒液的滅活

將制備的病毒液加入體積分?jǐn)?shù)為0.03％二乙烯亞胺（binary ethylenimine，BEI）后，搖勻，置30 ℃、100 r/min搖床中滅活120 h。取樣進(jìn)行病毒滅活的安全檢測。

2.4 病毒滅活的安全檢測

取滅活后的病毒液1 mL分別接種于ST細(xì)胞，共接種4瓶（25 cm2細(xì)胞瓶），37 ℃吸附1 h后，棄去病毒液，PBS洗滌2～3次后，加入10 mL細(xì)胞維持液，置37 ℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。細(xì)胞液凍融2次后合并收集，并于長勢良好的單層ST細(xì)胞上再盲傳2代，觀察并記錄細(xì)胞病變。如無細(xì)胞病變，逐瓶作HA測定，HA陰性則病毒滅活完全。

2.5 滅活疫苗的制備

2.5.1 鋁膠佐劑滅活疫苗的制備

將滅活的豬細(xì)小病毒（PPVS-1株）液與鋁膠佐劑以5∶1的比例混合，充分搖勻，即制成豬細(xì)小病毒病鋁膠滅活疫苗。

2.5.2 ISA 201佐劑滅活疫苗的制備

將滅活的豬細(xì)小病毒（PPVS-1株）液與ISA 201佐劑以1∶1的比例加入乳化罐中，乳化時(shí)攪拌速度80 r/min，均質(zhì)速度2 800 r/min，溫度不超過25 ℃，乳化20 min，即配制成豬細(xì)小病毒病油乳劑滅活疫苗。

2種疫苗均配制成1 mL疫苗含107.0 TCID50病毒。

2.6 物理性狀的檢驗(yàn)

按《中國獸藥典》[5]進(jìn)行檢驗(yàn)。

2.7 無菌檢驗(yàn)

按《中國獸藥典》[5]進(jìn)行檢驗(yàn)。

2.8 疫苗的安全性檢驗(yàn)

2.8.1 乳鼠安全性試驗(yàn)

取2～4日齡乳鼠3窩（帶母鼠飼養(yǎng)），分別皮下注射2種疫苗，100 μL/只。每日觀察并記錄乳鼠的采食、精神狀況等，連續(xù)觀察7 d。

2.8.2 仔豬安全性試驗(yàn)

2月齡仔豬（PPV HI抗體陰性）12頭，隨機(jī)分成3組，每組4頭。分別肌內(nèi)注射2種疫苗和PBS（陰性對(duì)照），10 mL/頭，每日觀察并記錄豬的采食、精神狀況等，連續(xù)觀察21 d。

2.9 效力試驗(yàn)

取體重約350 g的豚鼠15只，隨機(jī)分成3組，每組5只，分別肌內(nèi)注射2種疫苗和PBS（陰性對(duì)照），0.5 mL/只。接種疫苗28 d后，采血，測定PPV HI抗體。

2.10 抗體消長規(guī)律及免疫持續(xù)期試驗(yàn)

取PPV HI抗體陰性豬12頭，隨機(jī)分成3組，每組4頭。其中第1組、第2組分別肌內(nèi)接種2種疫苗，2 mL/頭，第3組不免疫作為對(duì)照組。免疫后14、21、30、60、90、120、150、180、210 d隨機(jī)抽樣采血，檢測PPV HI抗體。

2.11 HI試驗(yàn)

96孔微量板加PBS 25 μL/孔，被檢血清25 μL加入第1孔與PBS混合均勻，倍比稀釋至第9孔，棄去移液器內(nèi)25 μL液體，使血清稀釋度為1∶16～1∶4 096，1～10孔加入血凝素25 μL/孔，11孔不加血凝素，補(bǔ)加25 μL PBS。每排的第10孔為血凝素對(duì)照，第11孔為紅細(xì)胞對(duì)照。震蕩器上混合15 s，4 ℃過夜，次日，室溫下每孔加入25 μL 0.25％豚鼠紅細(xì)胞，1 h左右觀察結(jié)果。每次測定需設(shè)陽性血清和陰性血清對(duì)照。以使8個(gè)血凝單位的病毒不發(fā)生凝集的最高血清稀釋度的倒數(shù)來表示。HI價(jià)≥16判為陽性，HI＜16判為陰性[5]。

3 結(jié)果

3.1 毒價(jià)測定及滅活的安全測定

將病毒反復(fù)凍融后，取樣進(jìn)行TCID50的測定。依Reed-Muench法計(jì)算病毒毒價(jià)為107.5 TCID50/mL。取滅活的病毒接種ST細(xì)胞，2代細(xì)胞無病變，說明病毒液滅活徹底。

3.2 不同佐劑配制的疫苗接種后安全性試驗(yàn)

3.2.1 乳鼠安全性試驗(yàn)

3窩乳鼠的采食、精神狀態(tài)均正常，注射部位無紅腫，且免疫乳鼠無死亡（表1）。

3.2.2 仔豬安全性試驗(yàn)

用2種不同佐劑配制的滅活疫苗對(duì)仔豬進(jìn)行接種試驗(yàn)，臨床觀察結(jié)果表明：試驗(yàn)豬體溫、體重與對(duì)照組豬的無顯著差異，均發(fā)育良好，精神和食欲正常，未出現(xiàn)一過性熱反應(yīng)和局部炎癥反應(yīng)等情況，說明制備的2種疫苗是安全的。結(jié)果見表2。

結(jié)果表明，兩種豬細(xì)小病毒病滅活疫苗（PPVS-1株）對(duì)乳鼠和仔豬的超劑量接種是安全的。

3.3 效力試驗(yàn)

豚鼠接種疫苗28 d后，采血，測定PPV HI抗體，結(jié)果免疫組PPV HI抗體全部轉(zhuǎn)為陽性，而對(duì)照組PPV HI抗體均為陰性（表3）。

3.4 抗體消長規(guī)律及免疫持續(xù)期的試驗(yàn)

用ISA 201作為佐劑的疫苗接種后14 d，仔豬均產(chǎn)生抗體反應(yīng)，PPV HI≥32；用鋁膠作為佐劑的疫苗接種后14 d，PPV HI≥32（表4）。

4 結(jié)論

乳鼠免疫后采食、精神狀態(tài)均正常，注射部位無紅腫，且免疫乳鼠無死亡；接種2種疫苗后仔豬發(fā)育良好，精神和食欲均正常，未出現(xiàn)一過性熱反應(yīng)和局部炎癥反應(yīng)等情況。用ISA 201佐劑配制的滅活疫苗免疫期可達(dá)6個(gè)月，用鋁膠佐劑配制的滅活疫苗免疫期可達(dá)5個(gè)月。因此建議選用ISA 201佐劑作為豬細(xì)小病毒病滅活疫苗的佐劑。

參考文獻(xiàn)

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[2] STRECK A F，TRUYEN U．Porcine parvovirus[J]．Current Issues in Molecular Biology，2020，37：33-46.

[3] MENGELING W L，LAGER K M，VORWALD A C．The effect of porcine parvovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus on porcine reproductive performance[J]. Animal Reproduction Science，2000，60/61：199-210.

[4] 崔宇超，崔尚金．豬細(xì)小病毒流行與防治進(jìn)展[J]．養(yǎng)豬，2015（1）：123-128.

[5] 中國獸藥典委員會(huì)．中華人民共和國獸藥典（2020版）[S]．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2021．

基金項(xiàng)目：上海市科技興農(nóng)技術(shù)培育項(xiàng)目《課題號(hào)：2022-02-08-00-12-F01097）

作者簡介：趙本連（1971-），男，確士，高級(jí)善醫(yī)師，主要從事動(dòng)物授苗的研發(fā)與生產(chǎn)

"通信作者：彭麗英：Emil：pengliying20100aliyun com