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        酶解提取-高效液相色譜-電感藕合等離子體質(zhì)譜法測定富硒食品中的有機(jī)硒組分

        2024-10-31 00:00:00邱險輝張秀芹
        中國食品 2024年20期

        作為人體必需的微量元素之一,硒的形態(tài)與其生物功能密切相關(guān)。無機(jī)硒的毒性大、活性低,多以硒酸鹽和亞硒酸鹽的形式存在;有機(jī)硒的毒性小、生物活性高,多以硒蛋白、硒代氨基酸、硒多糖以及硒核酸等形式存在。隨著人們對硒的重視程度的提高,市場上出現(xiàn)了越來越多的富硒產(chǎn)品,但是目前我國檢測硒的標(biāo)準(zhǔn)是針對總硒或無機(jī)硒,對人體有益的有機(jī)硒的檢測還暫無標(biāo)準(zhǔn)。通過文獻(xiàn)查詢發(fā)現(xiàn),目前對有機(jī)硒形態(tài)檢測方法的研究集中在液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法、電泳-電感耦合等離子體質(zhì)譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、ICP-MS與飛行時間質(zhì)譜結(jié)合的方法等方面。本研究旨在通過酶解法,將食品中所含有的、以不同形式存在的有機(jī)硒轉(zhuǎn)化為硒代氨基酸,利用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法對其進(jìn)行形態(tài)分離并定量,從而為市售食品有機(jī)硒的形態(tài)檢測提供參考。

        1. 儀器與試劑

        1.1 儀器

        1260高效液相色譜-NexION 1000電感耦合等離子體質(zhì)譜儀,美國PE公司;Milli-Q超純水機(jī),美國密理博公司;Sigma4-16KS高速離心機(jī),德國Sigma公司;ME204E、ME155DU分析天平,瑞士Mettler Toledo公司;VORTEX3旋渦混勻器,德國IKA公司;恒溫水浴振蕩器,上海智城分析儀器制造有限公司。

        1.2 試劑

        甲醇,色譜純;三氟乙酸,分析純;乙烷磺酸,分析純;鹽酸,分析純;三羥甲基氨基甲烷,分析純;蛋白酶液:CAS9014-01-1,IUB3.2.21.14,300U/mL-400U/mL,不得含丙三醇穩(wěn)定劑;硒代胱氨酸,純度≥98%;甲基-硒代半胱氨酸,純度≥98%;硒代蛋氨酸,純度≥98%;無機(jī)硒儲備液,100mg/L。

        2. 試驗(yàn)與方法

        2.1 溶G26TyKA+MkpmGTLgYnbg5w==液配制

        2.1.1 有機(jī)硒標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液(100mg/L):分別精密稱取硒代胱氨酸、甲基-硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸10.2mg于100mL容量瓶中,用一級水定容。

        2.1.2 有機(jī)硒標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液(1mg/L):取1mL儲備液至100mL容量瓶中,用一級水定容。

        2.1.3 無機(jī)硒中間液:取無機(jī)硒儲備液1mL于100mL容量瓶中,用一級水定容。

        2.1.4 硒混和工作液:用0.05mol/L的MES-RTIS緩沖液稀釋標(biāo)準(zhǔn)中間液,得到質(zhì)量濃度為5、10、20、50、100μg/L的有機(jī)硒標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)液中的無機(jī)硒濃度均為20μg/L。

        2.1.5 流動相溶液(98%三氟乙酸水溶液(0.2%v/v)-2%甲醇):取3.92mL三氟乙酸,加入1000mL一級水、40mL甲醇,一級水定容至2000mL,過0.45μm有機(jī)系濾膜,超聲脫氣10min。

        2.1.6 氫氧化鈉溶液(1mol/L):稱取4g氫氧化鈉,用水稀釋至100mL,混勻。

        2.1.7 氫氧化鈉溶液(6mol/L):稱取24g氫氧化鈉,用水稀釋至100mL,混勻。

        2.1.8 鹽酸溶液(1mol/L):稱取8.33mL鹽酸,用水稀釋至100mL,混勻。

        2.1.9 0.05mol/L的MES-RTIS緩沖液:稱取19.52g的2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸和12.2g的三羥甲基氨基甲烷,用1.7L水溶解,根據(jù)室溫用6mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為8.3,加水稀釋至2L。

        2.1.10 蛋白酶溶液:用0.05mol/L的MES-TRIS緩沖溶液配置成為50mg/mL的蛋白酶溶液,使用前現(xiàn)配并于0℃-5℃條件下暫存。

        2.2 樣品前處理

        將食品可食部分經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎均勻,稱取0.2-1.0g于50mL耐120℃離心管中,準(zhǔn)確移取并加入0.05mol/L的MES-RTS緩沖液20mL,加入50mg/mL蛋白酶100uL,加蓋密封,渦旋5min混勻。于60℃水浴搖床水浴振搖10min,開蓋,加入3mol/L乙酸溶液2.5mL,控制試樣溫度保持在(60±1)℃,用1mol/L氫氧化鈉溶液或者1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)試樣pH至4.5±0.2,持續(xù)酶解2h,中間每0.5h取出搖勻1次。取出冷卻后,5000r/min離心10min,取上清液,過0.45μm有機(jī)系濾膜,待測,同時作空白試驗(yàn)。

        2.3 儀器條件

        2.3.1 液相色譜條件:C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm);流動相:98%三氟乙酸水溶液(0.2%v/v)-2%甲醇,等度,流速為1.0mL/min、進(jìn)樣量為100μL、柱溫為30℃。

        2.3.2 ICP-MS條件:功率為1600W、采樣深度為8mm、霧化室溫度為2℃、等離子體氣流量為17mL/min、輔助氣流量為1.2mL/min、載氣流量為0.95mL/min、檢測質(zhì)荷比(m/z)為78。

        3. 結(jié)果與分析

        3.1 方法線性關(guān)系、檢出限和回收率

        本研究建立的食品中3種硒氨基酸的檢出限均為0.04mg/kg,定量限為0.12mg/kg;在5-100μg/L之間,線性良好;相關(guān)系數(shù)均在0.999以上,10倍定量限濃度的添加回收率為84.2%-116.0%。詳見表1。

        3.2 前處理過程的優(yōu)化

        3.2.1 色譜條件的選擇。首先選擇離子色譜柱Hamilton PRP-X100,以檸檬酸銨-甲醇為流動相,結(jié)果硒代蛋氨酸(SeMet)的分離效果不理想,出峰時間長,存在分離度低、拖尾等情況;無機(jī)硒與硒代胱氨酸(SeCyS2)不能完全分開,通過調(diào)節(jié)流動相pH及有機(jī)相比例仍無法改善。將流動相更換為三氟乙酸水溶液-甲醇后,雖然可以分離,但出現(xiàn)響應(yīng)較低的情況。選用C18反相色譜柱后,分別嘗試不同的流動相,發(fā)現(xiàn)流動相為三氟乙酸水溶液(0.2%)-甲醇(98:2,V:V)時,各組分的分離度較高,且響應(yīng)值較高,如圖1所示。

        3.2.2 前處理的優(yōu)化。為防止高溫、濃酸等極端條件導(dǎo)致有機(jī)硒向無機(jī)硒轉(zhuǎn)化,提取液選擇相對溫和的水、0.1mol/L的鹽酸、無水乙醇、0.05mol/L的MES-RTIS緩沖液+蛋白酶,以此進(jìn)行對比研究。提取過程中,加入提取時間和提取溫度作為變量進(jìn)行考察。交叉實(shí)驗(yàn)證實(shí),0.05mol/L的MES-RTIS緩沖液+蛋白酶在常溫下振蕩提取120min和160min的差異不大,考慮時間成本問題,將提取時間定為120min,詳見表2。在固定時間和提取液的情況下,通過對不同溫度下不同樣品的提取效果進(jìn)行對比,發(fā)現(xiàn)在60℃時,每種產(chǎn)品的3種有機(jī)硒氨基酸提取量最大,即該溫度為最佳提取溫度,詳見表3。

        酶提取效果優(yōu)于其他提取液,主要是因?yàn)樯矬w內(nèi)的大部分硒以結(jié)合蛋白的形式存在,通過蛋白酶的酶解,可以釋放出更多的硒氨基酸。最佳提取溫度的確定和實(shí)驗(yàn)中所使用酶的來源密切相關(guān),不同來源酶的最佳活性溫度有較大差異,本研究中選用的是枯草桿菌蛋白酶,其最佳活性溫度為50℃-60℃。

        綜上所述,本研究建立的高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法提取方法簡單、高效,且檢出限低、線性范圍寬、各組分分離效果好,能夠滿足富硒食品和特殊醫(yī)學(xué)配方乳粉中硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸及L-甲基硒代半胱氨酸的形態(tài)檢測,同時可為市場上以添加無機(jī)硒冒充富硒食品的執(zhí)法治理提供技術(shù)支持。

        作者簡介:邱險輝(1983-),男,漢族,廣東梅州人,工程師,大學(xué)本科,研究方向?yàn)槭称芳笆秤棉r(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測。

        *通信作者:張秀芹(1974-),女,漢族,黑龍江雙鴨山人,正高級獸醫(yī)師,博士,研究方向?yàn)槭称?、飼料、獸藥質(zhì)量安全檢測技術(shù)及應(yīng)用。

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