煙酰胺又名尼克酰胺、維生素PP、維生素B3，是B族維生素的一種，對人體有多種益處，其在食品中主要是作為抗氧化劑和營養(yǎng)強化劑使用，有助于延緩食品氧化過程，保持食品的新鮮度和口感，同時提高食品的營養(yǎng)價值。受煙酰胺生產(chǎn)工藝的影響，一般原料中都含有少量煙酸，其含量對煙酰胺的質量有著重要影響。由于煙酰胺與煙酸的結構相近，因此分離較為困難?，F(xiàn)有的檢測方法中，一般采用液相色譜法同時檢測樣品中的煙酰胺和煙酸，這種方法要求煙酰胺與煙酸的含量相近，互不產(chǎn)生干擾，并不適用于測定大量煙酰胺中煙酸的含量。本文采用了MAX混合型陰離子交換固相萃取柱，最終實現(xiàn)了煙酰胺與煙酸的分離，能準確測定出煙酰胺中煙酸的含量，為提高煙酰胺的質量提供了技術支持。

1. 材料與方法

1.1 儀器與試劑

賽默飛液相串聯(lián)質譜儀，包括四元泵、在線真空脫氣機、柱溫箱、自動進樣器、TSQ質譜檢測器，美國賽默飛世爾科技公司；電子天平：感量為0.0001mg，德國賽多利斯；Milli-Q型純水系統(tǒng)；MAX混合型陰離子交換固相萃取柱：1000mg/6mL，深圳逗點生物技術有限公司；煙酸標準品：純度大于99.0%，德國Dr.E；甲醇：色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司；甲酸：分析純，西隴科學股份有限公司。

1.2 溶液配制

煙酸標準儲備溶液（1000mg/L）：稱取煙酸標準品10mg于10mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?，使用時用水稀釋至所需質量濃度。

1.3 儀器工作條件

色譜柱：賽默飛Thermo Hypersil ODS（C18）色譜柱（1.7μm，50mm*2.1mm），或具有同等柱效的色譜柱；柱溫：35℃；進樣體積：5uL；流速：0.2mL/min。流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為甲醇，等度洗脫，A：B=50：50。

正離子模式掃描；霧化氣：氮氣；霧化室溫度：350℃；毛細管電壓：3.5kV；MRM多反應監(jiān)測模式檢測；煙酸的離子對參數(shù)為124/106、124/80，定量離子參數(shù)為124/106。

1.4 實驗步驟

1.4.1 樣品預處理。取0.1g煙酰胺原料樣品，加入10mL去離子水，制成煙酰胺水溶液。向MAX混合型陰離子交換固相萃取柱內加入3mL甲醇和3mL去離子水進行活化，將上述10mL煙酰胺水溶液加入至MAX混合型陰離子交換固相萃取柱中，自然流干。取3mL甲醇溶液洗脫MAX混合型陰離子交換固相萃取柱，棄去洗脫液。再向MAX混合型陰離子交換固相萃取柱中加入6mL含16%甲酸的甲醇溶液，對其進行洗脫，并收集洗脫后的甲醇溶液。向收集的甲醇溶液中加入去離子水，并定容至10mL。采用0.45μm濾膜過濾，液相串聯(lián)質譜儀測定。

1.4.2 定量方法。取煙酸的系列混合標準工作溶液，按照儀器工作條件測定其標準曲線，進行樣品分析，利用外標法進行定量，樣品中煙酸的含量為X（mg/kg），按照公式（1）計算。

X=C*V/m （1）

公式中：X表示煙酸的含量，單位為mg/kg；C表示外標法曲線所得煙酸濃度，單位為mg/L；V表示定容的體積，單位為mL；m表示樣品的稱樣量，單位為g。

2. 結果與討論

2.1 固相萃取柱的選擇

雖然煙酰胺與煙酸的定性離子對不一樣，但煙酰胺會嚴重干擾煙酸的測定，可能XqnlI3yt/OZbiWEkeMCinoCqUhBT11FvTTC4ddobCj4=是因為在正模式的測定條件下，大量煙酰胺分子在離子源處與煙酸產(chǎn)生競爭離子化現(xiàn)象，嚴重降低了煙酸的響應值，使得煙酸不容易被檢測到。因此，試驗采用固相萃取柱實現(xiàn)煙酰胺與煙酸的分離。

從煙酰胺與煙酸的化學結構式可以看出，兩者的結構差異主要體現(xiàn)在酰胺鍵與羧基的差別。利用這個結構差異，試驗選取MAX混合型陰離子交換固相萃取柱，利用其與煙酸羧基的強堿弱酸離子鍵作用來富集煙酸，從而實現(xiàn)煙酰胺與煙酸的分離。MAX混合型陰離子交換固相萃取柱的富集原理見圖1。

2.2 流動相的選擇

本試驗對比了甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-水、乙腈-水四種不同的流動相混合溶液，結果表明，甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動相時，煙酸的響應值更高。這可能是因為在正模式監(jiān)測下，添加0.1%甲酸有利于煙酸吡啶環(huán)上的氮原子結合氫原子，提高其響應值。同時，一般情況下，甲醇比乙腈更適合于正模式監(jiān)測，因此，經(jīng)過試驗，采用甲醇-0.1%甲酸水溶液作為混合流動相。

本試驗同時嘗試了不同比例的甲醇-0.1%甲酸水溶液，最后確定流動相比例為，A：B=50：50。見表1。

2.3 色譜柱的選擇

本試驗選用反相色譜柱、正相色譜柱進行色譜柱條件選擇，其型號分別為Thermo Hypersil ODS（C18）色譜柱、ZORBAX Rx-SIL色譜柱。結果表明，使用Thermo Hypersil ODS（C18）色譜柱時，煙酸出峰良好，并沒有發(fā)現(xiàn)待測物質過早出峰的情況。

2.4 質譜條件的優(yōu)化

將一定濃度的標準溶液以注射式連續(xù)直接進樣的方式進行一級質譜全掃描分析，通過優(yōu)化霧化室溫度、毛細管電壓等參數(shù)，得到煙酸的準分子離子峰。結果表明，煙酸在正模式比負模式的響應值更高，因此選擇m/z=[M+H]+作為準分子離子峰。然后選取準分子離子峰進行轟擊，通過優(yōu)化碰撞能量、質譜分辨率等參數(shù)，最大化地提高檢測的靈敏度。通過分析二級質譜信息得出，煙酸的二級質譜碎片主要包括m/z=106、m/z=80。試驗選取124/106、124/80作為監(jiān)測離子，其中定量離子參數(shù)為124/106。煙酸檢測色譜圖見圖2，煙酸的裂解規(guī)律見圖3。

2.5 洗脫溶液的選擇

MAX柱與煙酸的結合作用力為季銨離子與羧基的強堿弱酸離子鍵作用，要從MAX柱上洗脫煙酸，洗脫液的酸性一般要求比煙酸更強。煙酸的吡啶環(huán)是一個強吸電子基團，能夠增強煙酸上羧基的酸性，因此，煙酸的酸性比較強。本試驗分別嘗試5%乙酸的甲醇溶液、10%乙酸的甲醇溶液、16%乙酸的甲醇溶液、5%甲酸的甲醇溶液、10%甲酸的甲醇溶液、16%甲酸的甲醇溶液等6個不同組合溶液洗脫MAX柱。結果表明，乙酸的甲醇溶液并不能有效洗脫煙酸，回收效率并不高。為了能夠充分地洗脫MAX柱上富集的煙酸，本試驗采用含有16%甲酸的甲醇溶液洗脫MAX柱。

2.6 標準曲線、檢出限、回收率及精密度

配制質量濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.50、1.0mg/L的煙酸混合標準溶液，按儀器工作條件測定其標準曲線。結果表明，在0.05-1.0mg/L范圍內線性關系良好，其相關系數(shù)r>0.9990。結果見表2。

稱取空白煙酰胺樣品1.0g，分成三組，分別添加0.1、0.25、0.50mg/L三個濃度煙酸，相當于含有1、2.5、5mg/kg煙酸。按照本方法進行添加回收率和精密度（n=6）實驗，計算得到回收率為89.1%-116.4%，相對標準偏差為2.9%-9.2%。空白煙酰胺樣品加標回收率試驗結果表明，方法測定下限（10倍信噪比）可達1mg/kg。實驗結果見表3。

本文建立了固相萃取-液相串聯(lián)質譜法測定煙酰胺中煙酸含量的方法，其中的關鍵技術是根據(jù)煙酰胺與煙酸的結構，采用MAX混合型陰離子交換固相萃取柱實現(xiàn)煙酰胺與煙酸的分離，避免了兩者之間的互相干擾。實驗結果顯示，該方法線性關系良好、檢出限低，能夠滿足對食品級煙酰胺中煙酸的測定。

作者簡介：黃錦波（1988-），男，漢族，廣東茂名人，助理工程師，大學本科，研究方向為食品、化妝品與環(huán)境分析。