牛肉的品質及變化與能量物質及伴隨產(chǎn)生的產(chǎn)物相關，宰后早期肉品經(jīng)過無氧酵解、肌原纖維蛋白降解（肉的成熟）過程，磷酸腺苷含量及代謝效率會對牛肉品質產(chǎn)生重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，當磷酸腺苷水平不足時，會引發(fā)線粒體功能障礙，導致細胞發(fā)生凋亡，進而使肌肉中的纖維蛋白含量減少，這將直接影響牛肉的嫩度和質地。因此，通過測定屠宰后牛肉中磷酸腺苷含量及相關蛋白質的磷酸化水平差異，對于進一步確定牛肉品質差異具有重要意義。

磷酸腺苷包括三種主要形式，分別是三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）以及一磷酸腺苷（AMP）。肉產(chǎn)品中磷酸腺苷的分析方法主要有酶學法、色譜法和液質聯(lián)用等，而樣品前處理的結果會對分析指標、成本、效率產(chǎn)生直接影響。應用色譜法對牛肉中的磷酸腺苷進行測定時，由于牛肉等生物樣品具有基質復雜、干擾物多、待測物濃度低等缺點，因此需對樣品進行前處理，以去除潛在的干擾物質并富集待測組分，確保后續(xù)分析的準確性。因此，如何在復雜的牛肉基質中快速、準確地分離出磷酸腺苷并進行高效分析，成為當前研究的重要課題。

QuEChERS方法是一種應用廣泛的樣品前處理技術，具有快速、簡單、廉價、有效、可靠和安全的特點。使用QuEChERS方法對樣品進行預處理時，主要涉及萃取劑、脫水劑和凈化劑的選擇。硫酸鎂和硫酸鈉常用作脫水劑，可以顯著降低水相，促進樣品在有機相中的分布和兩相的分層，從而有效地將水分從有機相中吸附出來，使目標化合物更純凈。在農(nóng)藥多重殘留的分析中，常用的萃取劑有丙酮、乙腈和乙酸乙酯等。常用的吸附劑有乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C18）等，針對不同類型的雜質具有各自獨特的清除效果。其中，PSA含有伯胺和仲胺，具有較強的結合能力和良好的選擇性，能有效去除樣品中的極性雜質和有機酸，特別是在去除碳水化合物和脂類物質時表現(xiàn)出色。C18則側重于去除樣品中的非極性物質和油脂，適用于脂溶性化合物較多的樣品，去除脂類雜質效果顯著，能使目標分析物的純度大幅提升。隨著方法的不斷改進以及新材料的開發(fā)，QuEChERS可以針對不同樣品使用不同的萃取劑、脫水劑、凈化劑，但目前采用QuEChERS進行磷酸腺苷的測定未見相關報道。

石墨烯（Graphene）是一種新型二維納米材料，具有較高的比表面積，能提供大量的表面吸附位點，有助于從復雜樣品基質中高效提取目標化合物。同時，石墨烯擁有豐富的π電子體系，能與含苯環(huán)結構的化合物發(fā)生強烈的π-π堆積作用，從而增強對這類物質的吸附能力。因此，石墨烯可以作為一種理想的吸附劑。本研究基于QuEChERS方法，以石墨烯為凈化劑，建立QuEChERS-Graphene-UPLC法測定牛肉中磷酸腺苷含量。研究結果可應用于牛肉中磷酸腺苷分離富集及檢測，輔助進行牛肉肉質評定。

1. 儀器與材料

1.1 儀器

超高效液相色譜儀，美國Waters公司Acquity；高速離心機，德國Eppendorf 5810R；電子天平（精度0.0001g），METTLER公司AE240；多管渦旋混合儀，杭州奧盛儀器有限公司MTV-100。

1.2 材料

對照品：5’-三磷酸腺苷二鈉鹽（含量＞98%）、5’-二磷酸腺苷鈉鹽（含量＞98%）、5’-磷酸腺苷二鈉鹽（含量＞98%），日本東京化成工業(yè)株式會社；高氯酸、氨水、醋酸銨等均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；乙腈、甲醇（農(nóng)殘級），F(xiàn)isher美國；0.22μm水系、有機過濾膜及0.22μm針筒式濾膜過濾器，天津津騰公司。

2. 實驗與方法

2.1 樣品前處理

精確稱量新鮮牛肉樣品5g（精確至0.001g），搗碎研磨后置于50mL離心管中，分為2份，每管添加15mL的6%冷高氯酸。采用渦旋振蕩（1200rpm，10min）對樣品進行前處理，然后完全浸泡10min，4500r/min冷凍離心10min，吸取2mL上清液進一步純化。

2.2 純化

從有機相中提取約2mL上清液，轉移至5mL離心管中，分別在各管中加入不同量的石墨烯（A：空白；B：10mg石墨烯；C：25mg石墨烯）。渦旋振蕩（1200rpm，10min），然后完全浸泡10min，4500r/min冷凍離心10min。取上清液用0.22μm的微孔濾膜過濾至樣品瓶內(nèi)，供超高效液相色譜分析。

2.3 色譜條件

采用水質UPLC HSS T3柱（2.1×150mm，1.8μm）進行分析，流速0.30mL/min、柱溫25℃、注樣量10μL。流動相A：磷酸二氫銨水溶液，流動相B：乙腈-0.05mmol/L磷酸二氫銨水溶液（10：90），梯度洗脫。

2.4 定性與定量鑒定

分別準確稱量ATP、ADP、AMP標準品各10mg，放入10mL測量瓶中，用4℃超純水溶解，配制成濃度為1.0mg/mL的對照原液。將對照原液稀釋至20、10、5、2、0.5μg/L，隨后注入5個濃度梯度的控制溶液。以待測組分的質量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）進行回歸分析，得到ATP、ADP和AMP之間的線性關系。每個樣品測量6次（n=6），計算各個樣品的回收率和相對標準偏差。

2.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結果以平均數(shù)±標準差表示，P＜0.05表示差異顯著。

3. 結果與討論

3.1 石墨烯處理效果比較

牛肉樣品基質復雜，含有大量的蛋白質、脂肪和其他有機物，可能會干擾目標化合物的檢測，采用吸附劑可以去除樣品中的雜質，從而提高檢測水平。本研究基于QuEChERS方法，采用石墨烯作為吸附劑進行前處理，結果如圖1所示，能顯著提高牛肉基質中雜質的純化效果，有效降低背景干擾和基線噪聲，使基線大大穩(wěn)定。

石墨烯具有比表面積大、結構穩(wěn)定、耐酸堿等性質，與其他常用填料（如C18、多壁碳納米管）相比，其用量和洗脫液體積少，但目標物回收率高。本研究發(fā)現(xiàn)，10mg石墨烯即可達到較好的純化效果，相同的結果在其他研究中也有發(fā)現(xiàn)。例如，同等量的C18不足以吸附目標物，容易發(fā)生穿透現(xiàn)象，因此所需的吸附劑量大大高于石墨烯。有人研究了石墨烯和石墨化炭黑（GCB）對于黃瓜中色素的吸附效果，結果表明，相比于GCB，石墨烯在去除色素方面具有更高的效率。目前利用石墨烯對肉類樣品進行前處理的研究較少，本研究結果顯示，石墨烯對牛肉樣品中雜質的純化效果較好，且用量少于傳統(tǒng)吸附劑，在后續(xù)研究中將采用10mg石墨烯作為吸附劑，進一步考察方法的線性關系、檢出限、定量限等。

3.2 色譜條件的改進

磷酸腺苷是兩性化合物，極性較強，導致它與極性流動相的親和力更大，與非極性固定相的作用較弱，故而在反向色譜柱上不能有效滯留或分離。為了提高磷酸腺苷在色譜分析中的分離效果，本研究對色譜條件進行了優(yōu)化，以磷酸二氫銨緩沖液與乙腈作為流動相的組合，采用梯度洗脫的方式進行分離。其中，磷酸二氫銨緩沖液是為了提供穩(wěn)定的pH環(huán)境，乙腈則通過與緩沖液的梯度洗脫，調(diào)節(jié)目標化合物的溶解性。通過一系列實驗發(fā)現(xiàn)，當流動相的pH=6.7時，能夠實現(xiàn)磷酸腺苷與樣品中其他未知物質的良好分離，這種分離效果不僅能確保磷酸腺苷呈現(xiàn)出清晰峰形，還大大提升了定性和定量分析的準確性。

3.3 方法的線性關系、定量限和檢出限

配制濃度分別為1、5、10、20、50、100μg/L的磷酸腺苷標準溶液，并對三種形式的磷酸腺苷（ATP、ADP、AMP）進行色譜檢測，評估其線性關系。實驗數(shù)據(jù)顯示，三種磷酸腺苷在設定濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出優(yōu)異的線性關系，相關系數(shù)（R2）均大于0.99，表明該方法具有高度的線性響應能力。三種磷酸腺苷的檢測限為0.001-2.000μg/L，定量限為0.003-5.000μg/L。每個樣品的檢測時間較短，僅需15min。動物死亡后，ATP會迅速分解為ADP和AMP，然后進一步分解為嘌呤核苷酸和次黃嘌84a371c517f803d134414e1e88e431999ef6fa411b3b4628376ea96fc5b89255呤核苷酸，因此較低的檢出限對于測定ATP及其代謝產(chǎn)物的含量具有重要意義，本方法能夠滿足實際檢測需求。

綜上所述，作為一種優(yōu)質蛋白質的來源，牛肉因其低脂肪、高蛋白特性受到消費者歡迎。研究表明，牛肉中磷酸腺苷的含量對牛肉的風味、色澤、嫩度影響顯著，定量測定牛肉中磷酸腺苷的含量具有重要的現(xiàn)實意義。為此，本研究基于QuEChERS方法，開發(fā)了一種超高效液相色譜（UHPLC）分析方法，以提高磷酸腺苷檢測的準確性、靈敏性。該方法具有以下優(yōu)點：（1）采用石墨烯作為吸附劑，可有效去除牛肉樣品中的脂肪酸、氨基酸及色素等雜質，提高了檢測的準確性和靈敏性，而且相較于其他吸附劑，石墨烯用量少，安全可靠；（2）實驗只有稱樣、勻漿、離心、上機4個步驟，操作簡單；（3）每個樣品上機檢測時間只需要15min。因此，本方法能夠滿足大批量樣品檢測的要求，可以在牛肉樣品測定中推廣應用，也為磷酸腺苷在其他生物樣品中的檢測提供了參考。

基金項目：2023年度河北北方學院基本科研業(yè)務費項目（JYT2023014）。

作者簡介：段曉燕（1987-），女，漢族，河北陽原人，副研究員，碩士研究生，研究方向為畜牧學研究與教學管理。

*通信作者：劉宇（1987-），男，回族，陜西安康人，副研究員，博士，研究方向為非編碼RNA與動物生長發(fā)育調(diào)控。