摘要：目的 通過觀察抗衰延年方對衰老大鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax表達(dá)的影響，探討抗衰延年方延緩衰老的可能機(jī)制。方法 健康SD雄性大鼠40只，將其隨機(jī)分為正常組、衰老模型組、中藥組和吡拉西坦組；正常組不做任何處理，衰老模型組、中藥組和吡拉西坦組每日頸背部皮下注射D-半乳糖500 mg/kg，連續(xù)注射30 d；經(jīng)過30 d治療后以Morris 水迷宮進(jìn)行大鼠行為學(xué)測試后取材應(yīng)用原位雜交法檢測其Bcl-2 mRNA、Bax mRNA 表達(dá)。結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠行動遲緩，逃避潛伏期增多（P<0.05），Bcl-2 mRNA的表達(dá)降低（P<0.05），Bax mRNA的表達(dá)增高（P<0.05）；與模型組相比，中藥組大鼠活力增強(qiáng)，逃避潛伏期時(shí)間減少（P<0.05），Bcl-2 mRNA的表達(dá)增強(qiáng)（P<0.05），Bax mRNA的表達(dá)降低（P<0.05）。結(jié)論 抗衰延年方可改善衰老大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與其上調(diào)抑制細(xì)胞凋亡因子Bcl2表達(dá)，下調(diào)促凋亡關(guān)鍵因子Bax表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：抗衰延年方；衰老；原位雜交法；Bcl-2/Bax；大鼠

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1007-2349（2024）09-0071-04

Effects of Anti-aging and Life-prolonging Prescription on the Expression of Learning

and Memory and Apoptosis-related Factors Bcl-2 and Bax in Aging Rats

LI Zhi-liang， ZHOU Min， TANG Zhong-sheng， MENG Xiao， WANG You-qian， WEI Jie-yin

（Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025， China）

【Abstract】Objective： To study the effect of Anti-aging and Life-prolonging Prescription on the expression of apoptosis-related factors Bcl-2 and Bax in aging rats， and to explore the possible mechanism of the prescription. Methods： 40 healthy SD male rats were randomly divided into normal group， aging model group， TCM group and piracetam group. The normal group was not treated， and the aging model group， TCM group and piracetam group were injected with 500 mg/kg D-galactose subcutaneously daily on the neck and back for 30 days. After 30 days of treatment， Morris water maze was used to conduct behavioral tests on the rats， and Bcl-2 mRNA and Bax mRNA expression were detected by in situ hybridization. Results： Compared with the rats in the normal group， the rats in the model group acted slowly， the escape latency increased （P<0.05）， the expression of Bcl-2 mRNA decreased （P<0.05）， and the expression of Bax mRNA increased （P<0.05）. Compared with that of the model group， the activity of rats in the TCM group increased， the escape latency time decreased （P<0.05）， the expression of Bcl-2 mRNA increased （P<0.05）， and the expression of Bax mRNA decreased （P<0.05）. Conclusion： Anti-aging and Life-prolonging Prescription can improve the spatial learning and memory ability of aging rats， and its mechanism may be related to the up-regulation of the expression of anti-apoptotic factor Bcl2 and the down-regulation of key pro-apoptotic factor Bax.

【Key words】Anti-aging and Life-prolonging Prescription; Aging; In Situ Hybridization; Bcl-2/Bax; Rat

衰老與年齡的增長呈正相關(guān)性，并伴隨著機(jī)體各組織功能衰退的自然生理過程，但是在內(nèi)外眾多因素的刺激下，或加快，或減慢這一進(jìn)程，正如每個(gè)人壽命的不同。現(xiàn)今老齡化是社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展的必然趨勢，而全國人口普查結(jié)果也表明我國已步入老齡化社會，因此由老齡化所帶來的一系列問題對中國經(jīng)濟(jì)社會的發(fā)展產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響［1］，故對衰老的研究對于社會具有重要的意義。目前關(guān)于抗衰老的研究設(shè)計(jì)的學(xué)說中，主要分為兩大類：機(jī)體衰老和細(xì)胞衰老［2］。導(dǎo)致細(xì)胞衰老主要是由體內(nèi)相關(guān)的基因表達(dá)蛋白調(diào)控，其相關(guān)蛋白通過裂解進(jìn)入細(xì)胞核，通過發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄功能，從而誘導(dǎo)細(xì)胞衰老、凋亡的發(fā)生［3］。同時(shí)在調(diào)控細(xì)胞凋亡的過程中，抑凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2（B lymphocytoma-2，Bcl-2）和促凋亡蛋白B-淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白（B lymphocytoma-2 associated X protein，Bax）具有非常重要的作用。而Bcl-2屬于抗細(xì)胞凋亡家族成員，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡因子Bax的表達(dá)；與此同時(shí)，Bax又可以與Bcl-2結(jié)合成二聚體，影響細(xì)胞的凋亡，降低Bax表達(dá)，可以抑制凋亡復(fù)合體的形成［4］。本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察抗衰延年方對D-半乳糖所致衰老模型大鼠腦組織中Bcl-2和Bax的相關(guān)表達(dá)，探索抗衰延年方調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用及延緩細(xì)胞衰老的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康清潔級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量280～300 g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2019-0014。

1.1.2 藥物與試劑 自擬抗衰延年方：黨參、黃芪、白術(shù)、陳皮、枸杞、紅棗等（購于貴陽同仁堂店）；吡拉西坦（多多藥業(yè)有限公司，20160911）；D-半乳糖（上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，20200623），Bc1-2原位雜交檢測試劑盒（Servicebio，GF003-50T），Bax原位雜交檢測試劑盒（Servicebio，GF003-50T）。

1.1.3 儀器與設(shè)備 電子分析天平（日本島津，AUW-220D）；轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)（德國，徠卡-2016）；全自動封閉式組織脫水機(jī)（TSJ-Ⅱ）、包埋機(jī)（BMJ-Ⅲ）、病理組織漂烘儀（PHY-Ⅲ）（常州市中威電子儀器有限公司）；數(shù)碼三目攝像顯微鏡（BA400Digital，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）等；圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0（美國Media Cybernetics公司）；立式超低溫保存箱（Haier，DW 86L386）；高速冷凍離心機(jī)（湘儀貝克，TGL-20M）；Morris水迷宮測試分析軟件（荷蘭Nodule公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及模型制備 將適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后的大鼠參考秦紅兵等方法［5］，每日頸背部皮下注射D-半乳糖500 mg/kg，連續(xù)注射30 d，進(jìn)行造模。模型制作成功后，除去飼養(yǎng)和造模過程中死亡的8只大鼠，剩余的大鼠隨機(jī)分為模型組、抗衰延年方組（簡稱為中藥組）、吡拉西坦組（簡稱為西藥組）、正常對照組，各8只。

1.2.2 干預(yù)方法 （1）中藥組：每日1次給予抗衰延年方水煎劑灌胃治療，每次10 mL·kg-1。連續(xù)21次。（2）西藥組：隔日1次，給予10 mg·kg-1吡拉西坦灌胃治療。連續(xù)21d。（3）正常對照組和模型組：常規(guī)飼料喂養(yǎng)，不予其他干預(yù)性飼料。

1.2.3 Morris水迷宮行為學(xué)測試 Morris水迷宮為圓形水池，直徑100 cm，深50 cm，水深30 cm，水溫（24±2）℃，池壁上4個(gè)等距離點(diǎn)分水池為四個(gè)象限，選第三象限在其中央放置平臺，平臺無色透明，直徑6 cm，高28 cm，平臺沒于水面下2 cm，水池周圍參照物保持不變。第1～6 d 進(jìn)行定向航行實(shí)驗(yàn)，每日將大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限的順序從各入水點(diǎn)（各象限水池壁中點(diǎn)）靠池壁放入水中，記錄60 s內(nèi)大鼠從水中爬上站臺所需時(shí)間為逃避潛伏期；第7 d行空間探索實(shí)驗(yàn)，將大鼠從第Ⅰ象限入水點(diǎn)放入水池，記錄90 s內(nèi)大鼠在第Ⅲ象限游泳時(shí)間和穿越站臺次數(shù)。

連續(xù)7d定位航行實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠從入水到找到平臺后四肢爬上平臺并停留超過2s所需的時(shí)間，即逃避潛伏期時(shí)間。設(shè)定時(shí)間為90s，如90s后仍未找到平臺，則引導(dǎo)至平臺并使其停留5s，最終時(shí)間記為逃避潛伏期時(shí)間。

1.2.4 原位雜交法檢測其 Bcl-2 mRNA、Bax mRNA 按照試劑盒說明書進(jìn)行。經(jīng)切片、預(yù)雜交、雜交后使其顯影放入圖像分析系統(tǒng)Bcl-2 mRNA、Bax mRNA原位雜交圖進(jìn)行分析。每一切片40倍下隨機(jī)5個(gè)視野，檢測每一組的積分光密度、陽性細(xì)胞總面積，通過檢測結(jié)果用以分析差異。積分光密度代表陽性物質(zhì)的量，即測量被測個(gè)體截面積內(nèi)光密度積分值。光密度越大，表示顏色越深或濃度越濃，染色的顏色深度代表了陽性物質(zhì)的量越大［6］。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用統(tǒng)計(jì)軟件Graphpad 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差不齊時(shí)用非參檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮行為學(xué)結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠行動遲緩，逃避潛伏期時(shí)間明顯增多（P<0.05）；與模型組相比，中藥組大鼠活力增強(qiáng)，逃避潛伏期時(shí)間明顯減少（P<0.05）。如下圖1。

2.2 原位雜交法檢測Bcl-2 mRNA、Bax mRNA的表達(dá)結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠Bcl-2 mRNA的表達(dá)降低（P<0.05），Bax mRNA的表達(dá)增高（P<0.05）；與模型組相比，中藥組大鼠Bcl-2 mRNA的表達(dá)增強(qiáng)（P<0.05），Bax mRNA的表達(dá)降低（P<0.05）。如下圖2、圖3。

3 討論

中醫(yī)“衰老”一詞最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)太素·陰陽》“若人能修道察同，去損益之病，則陰陽氣和，無諸衰老，壽命無窮，與天地同極也”。同時(shí)該書亦記載“四十歲，五臟六腑十二經(jīng)脈，皆大盛以平定……五十歲，肝氣始衰……六十歲，心氣始衰，苦憂悲，血?dú)庑付琛呤畾q，脾氣虛，皮膚枯；八十歲，肺氣衰，魄離，故言善誤；九十歲，腎氣焦，四臟經(jīng)脈空虛”，詳述了生長衰老的生命全過程?！氨M終其天年，度百歲乃去”乃是理想狀態(tài)下的自然衰老，但現(xiàn)實(shí)中各種因素所致的先衰的狀況隨處可見［7］。而五臟衰敗亦可導(dǎo)致多種復(fù)雜疾病的發(fā)生，如腦梗死、阿爾茲海默癥、帕金森病等［8］，正如《黃帝內(nèi)經(jīng)》言“正氣存內(nèi)，邪不可干”。后世醫(yī)家在《黃帝內(nèi)經(jīng)》基礎(chǔ)之上不斷發(fā)展，認(rèn)為衰老病因病機(jī)為臟腑虛衰，尤其與肺脾腎密切相關(guān)。俞才鈞教授曾結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)擬定“抗衰延年方”，取其補(bǔ)肺護(hù)衛(wèi)、培土生金、補(bǔ)火生土、護(hù)陽堅(jiān)陰之意，進(jìn)行養(yǎng)生御病，延緩衰老并取得良好效果［9］。本次所使用的抗衰延年方是在俞才鈞教授“抗衰延年方”的基礎(chǔ)上加減而成，臨床使用效果良好，現(xiàn)探索其抗衰老的機(jī)制。

現(xiàn)代研究表明，細(xì)胞凋亡是由體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡過程［10］。Bcl-2被證實(shí)是最重要的有明顯抑制細(xì)胞凋亡作用的基因，是1985年由Tsujimoto等在人類濾泡型B細(xì)胞淋巴瘤染色體t（14：18）易位斷裂點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的［11］，而Bax是1993年由OltvaiZN等在人和鼠的B淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的［12］。又有研究證明，Bcl-2家族中有的可以抑制凋亡（Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等），有的可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡（Bax、Bak、Noxa等）。B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）基因是公認(rèn)的長壽基因之一，大多位于線粒體外膜上，具有明顯抑制細(xì)胞凋亡的作用。當(dāng)Bcl-2的表達(dá)增強(qiáng)時(shí)，細(xì)胞的存活期則延長，抑制細(xì)胞凋亡。Bax基因是最主要的凋亡基因之一，編碼的Bax蛋白質(zhì)可與Bcl-2形成異二聚體，對Bcl-2產(chǎn)生阻抑作用［8］。同時(shí)任桂平等［13］在研究衰老過程時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡起著十分關(guān)鍵的作用，也證實(shí)了Bcl-2家族中最有代表性的抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax引起衰老發(fā)生的相關(guān)性［14］。

本實(shí)驗(yàn)研究了抗衰延年方抗衰老的可能機(jī)制。研究結(jié)果表明，與正常組比較，模型組大鼠行動遲緩，逃避潛伏期增多（P<0.05），Bcl-2 mRNA的表達(dá)降低（P<0.05），Bax mRNA的表達(dá)增高（P<0.05）；與模型組相比，中藥組大鼠活力增強(qiáng)，逃避潛伏期時(shí)間減少（P<0.05），Bcl-2 mRNA的表達(dá)增強(qiáng)（P<0.05），Bax mRNA的表達(dá)降低（P<0.05）。最終認(rèn)為，抗衰延年方可提高衰老大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，發(fā)揮抗衰老作用，其機(jī)制可能與其上調(diào)抑制細(xì)胞凋亡因子Bcl2表達(dá)，下調(diào)促凋亡關(guān)鍵因子Bax表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期：2024-03-02）