摘要：【目的】了解冬青種質(zhì)資源葉表型多樣性，揭示冬青種質(zhì)資源的表型多樣性機(jī)理，為引種栽培與品種選育提供依據(jù)?！痉椒ā繉?2份冬青種質(zhì)資源的18個(gè)表型性狀進(jìn)行測定，通過差異分析、方差分析、主成分分析和聚類分析研究其表型變異?！窘Y(jié)果】冬青種質(zhì)資源葉表型性狀變異較大，尤其是葉面積；Shannon多樣性指數(shù)變化范圍為1.00～2.03；冬青種質(zhì)資源葉表型性狀變異豐富，變異主要來源于種間。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，各性狀之間存在顯著相關(guān)，葉片外部性狀與葉片解剖性狀呈顯著負(fù)相關(guān)；通過主成分分析提取了葉長、葉片緊實(shí)度、柵欄組織和氣孔密度4個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率為85.20%，基本能反映冬青屬植物的總體性狀表現(xiàn)；聚類分析將42份冬青種質(zhì)資源分為大葉-大葉柄類、小葉-小葉柄類、中葉-葉硬鋸齒類和中葉-葉薄紙質(zhì)類4大類群。【結(jié)論】冬青種質(zhì)資源葉表型性狀變異豐富，屬內(nèi)變異主要來源于物種間。葉片外部性狀是冬青種質(zhì)資源表型分化的主要因素；葉長、葉片緊實(shí)度、柵欄組織和氣孔密度是劃分冬青種質(zhì)資源的4個(gè)主導(dǎo)因子，可作為冬青種質(zhì)資源的分類鑒定依據(jù)。本研究可為冬青屬植物的分類、資源利用和栽培繁育提供理論參考。

關(guān)鍵詞：冬青屬；葉表型；性狀變異；聚類分析

中圖分類號：S718"""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

文章編號：1000-2006（2024）05-0090-07

Leaf phenotypic diversity analysis of holly germplasm resources

WANG Xuejie1， ZHOU Peng2， HOU Sixuan1， FANG Yanming1*， ZHANG Min2*

（1. Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China， College of Life Sciences，" Key Laboratory of State Forestry and Grassland Administration on Subtropical Forest Biodiversity Conservation， Nanjing Forestry University， Nanjing 210037， China；2. Jiangsu Academy of Forestry， Nanjing 211153， China）

Abstract： 【Objective】 This study aims to understand the leaf phenotypic diversity of holly （Ilex spp.） germplasm resources， elucidate the mechanisms behind this diversity， and support the introduction， cultivation" and breeding of new varieties. 【Method】 We observed 18 phenotypic traits across 42 holly germplasm resources and analyzed the phenotypic variation using differential analysis， variance analysis， principal component analysis （PCA）， and cluster analysis. 【Result】 There was significant variation in the leaf phenotypic traits among the holly germplasm resources， particularly in leaf area. The Shannon diversity index ranged from 1.00 to 2.03， indicating rich phenotypic diversity primarily due to interspecies variation. Correlation analysis showed a significant negative relationship between external leaf traits and anatomical traits. PCA identified four principal components， namely" leaf length， tissue compactness， palisade tissue thickness， and stomatal density， that accounted for 85.20% of the variation， effectively capturing the overall characteristics of the holly plants. Cluster analysis grouped the 42 resources into four categories based on their leaf traits： large leaf with large petiole， small leaf with small petiole， medium leaf with hard serrations， and medium leaf with thin texture. 【Conclusion】 The study confirms substantial intrageneric phenotypic diversity in holly， driven predominantly by interspecies differences. External leaf traits were pivotal in phenotypic differentiation. The identified principal components， namely leaf length， compactness， palisade structure， and stomatal density， are crucial for classifying and identifying holly germplasm resources. Based on the leaf phenotypes， the resources were categorized into four distinct groups， providing a theoretical foundation for further classification， resource utilization， and breeding within the genus Ilex L.

Keywords：Ilex（holly）; leaf phenotypic; traits variation; cluster analysis

表型受遺傳和環(huán)境的雙重調(diào)控，是植物多樣性的直觀體現(xiàn)，表型特征的差異在很大程度上體現(xiàn)了同種植物的區(qū)別以及不同種植物之間的相似性，表型多樣性是在形態(tài)學(xué)水平上檢測植物遺傳多樣性最簡便易行且快速的方法[1-2]。葉是植物進(jìn)行光合作用、蒸騰作用的重要器官，其表型性狀對植物具有至關(guān)重要的作用，不同生長環(huán)境的植物其葉形態(tài)也有較大的變異，因此常被用作種間分類和表型變異分析。

冬青屬（Ilex）是被子植物中種類最多的木本雌雄異株植物屬，全球有660余種，廣泛分布于南、北半球的熱帶、亞熱帶至溫帶地區(qū)，主產(chǎn)中南美洲和亞洲熱帶[3]。中國是冬青屬的重要分布區(qū)，有 204 種，隸屬于3亞屬9組21系[4]，是冬青屬物種的多樣性中心之一。冬青屬存在著大量的天然變型、變種、雜交種，許多變種、變型還是重要的觀賞植物[5]、蜜源植物和藥用植物[6-9]，具有多種功效[10]。近10多年國內(nèi)冬青屬植物的引種和育種研究開始增多[11]，前期的引種多為民間自發(fā)的重復(fù)引進(jìn)，造成同物異名或異物同名等現(xiàn)象，從形態(tài)特征性狀上進(jìn)行定性和分析，探索冬青種質(zhì)資源的葉表型性狀及其遺傳變異，尋找穩(wěn)定的遺傳性狀，將為我國冬青種質(zhì)鑒定和多樣性評價(jià)提供重要的依據(jù)。本研究以42份冬青種質(zhì)資源為研究對象，分析其葉表型多樣性，以期對我國冬青屬植物的引種栽培與品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為42份冬青種質(zhì)資源（表1），均采自江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院國家觀賞冬青種質(zhì)資源庫。該資源庫位于江蘇省南京市江寧區(qū)東善橋（118°46′39.609″E，31°51′41.580″N），海拔208.6 m，年均氣溫13～22" ℃，夏季平均高溫23" ℃，冬季平均低溫14" ℃，年均降水量1 090.6 mm，屬于典型的亞熱帶季風(fēng)氣候。

1.2 表型特征測定方法

1.2.1 葉片外部性狀測量

參考覃冬梅[12]的方法，在試驗(yàn)地現(xiàn)場對葉片外部性狀進(jìn)行測量。每種選長勢相近的3株樣樹，在樣樹的東南西北4個(gè)方向各選擇3根枝條，對枝頂向下的第5～6片葉子進(jìn)行葉長（leaf length，LL）、葉寬（leaf width，LW）、葉柄長（petiole length，PL）、長寬比（leaf length to width ratio，LLW）、葉面積（leaf area，LA）和周長（leaf perimeter，LP）的測量。

1.2.2 葉片解剖結(jié)構(gòu)測量

葉片的橫切面采用冰凍切片的方式[13]，在遠(yuǎn)離中脈的葉片中央切出1 cm×1 cm小塊，制作成臨時(shí)裝片；使用Nikon 50i熒光顯微鏡（日本）觀察，鏡檢后拍照，用Image J2.10e分析軟件測量葉片解剖厚度（leaf anatomical thickness，LAT）、葉肉細(xì)胞厚度（mesophyll cell thickness，MCT）、葉片柵欄組織厚度（palisade tissue thickness，PTT）、葉片海綿組織厚度（spongy tissue thickness，STT），并計(jì)算柵欄組織/海綿組織比（柵海比，grid-to-sea ratio，GTSR）、葉片緊實(shí)度（leaf tissue structure tightness，TST，%）和葉片疏松度（leaf tissue structure looseness，TSL，%）。每種樣品隨機(jī)觀察10個(gè)切片，每個(gè)切片選取3個(gè)視野，每個(gè)測量指標(biāo)重復(fù)30次，取平均值。

1.2.3 葉片氣孔結(jié)構(gòu)測量

葉片下表皮的制作采用透明膠帶-刮片法[14-15]，選取健康無病害的成熟葉片，切成1 cm×1 cm小塊，制作成臨時(shí)裝片。用Nikon 50i熒光顯微鏡觀察拍照，隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行觀察，并用Image J2.10e分析軟件測量氣孔個(gè)數(shù)（stomatal number，SN）、氣孔面積（stomatal area，SA），計(jì)算平均值。氣孔密度（stomatal density，SD）為單位視野測量的葉片氣孔個(gè)數(shù)（N）與單位視野測量的面積（A）之比。

1.2.4 葉片質(zhì)量性狀分析

葉緣特征（leaf margin features，LMF）和葉質(zhì)地（leaf texture，LT）采用分級評定方式。葉緣特征：1為鋸齒狀，2為芒狀鋸齒，3為圓齒狀，4為全緣，5為尖硬刺齒，6為細(xì)圓齒狀，7為淺鈍齒。葉質(zhì)地：1為紙質(zhì)，2為革質(zhì)，3為厚革質(zhì)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel對葉片表型性狀進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)，包括最大值（max）、最小值（min）、均值（average）、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）、極差（R）和變異系數(shù)（CV）。

采用 Shannon-Wiener 指數(shù)表示形態(tài)多樣性程度[16-17]，采用巢氏設(shè)計(jì)方差分析計(jì)算方差分量及表型分化系數(shù)[18-19]。表型分化系數(shù)Vst=δ2p/（δ2p+δ2），其中，δ2p為種間的方差分量，δ2為種內(nèi)的方差分量。

使用Origin 2021對冬青種質(zhì)資源性狀間的 Pearson 相關(guān)系數(shù)進(jìn)行計(jì)算，考查其相關(guān)關(guān)系，并進(jìn)行相關(guān)性分析；采用最大方差法進(jìn)行主成分分析；經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換，采用歐氏距離類平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬青葉表型性狀變異及多樣性分析

對冬青種質(zhì)資源的18個(gè)表型性狀進(jìn)行變異分析（表2）可知，種間和部分種內(nèi)除葉緣特征和葉質(zhì)地這兩個(gè)性狀外，其余16個(gè)數(shù)量性狀存在顯著差異，表現(xiàn)出豐富的表型多樣性。從變異系數(shù)看，冬青種質(zhì)資源各性狀在不同材料之間具有廣泛的變異，且不同性狀的變異程度不同，冬青種質(zhì)資源變異系數(shù)為16.48%～92.80%。6個(gè)葉片外部性狀中，葉面積（LA）變異系數(shù)最大，為92.80%；葉片長寬比（LLW）的變異系數(shù)最小，為28.20%。另外，葉片長寬比的變異系數(shù)小于葉片長和葉片寬，說明葉片形狀較單個(gè)葉片長或葉片寬性狀穩(wěn)定。10個(gè)葉片解剖性狀中，海綿組織厚度（STT）的變異系數(shù)最大，為45.50%；葉片疏松度（TSL）變異系數(shù)最小，為16.48%。由平均變異系數(shù)來看，葉片表型性狀的變異離散程度由高到低分別為葉片外部性狀＞質(zhì)量性狀＞葉片解剖性狀。

Shannon-Wiener指數(shù)反映不同表型性狀的豐富及均勻程度[20]。從多樣性指數(shù)結(jié)果（表2）可以看出冬青種質(zhì)資源形態(tài)多樣性豐富，18個(gè)葉表型性狀的Shannon多樣性指數(shù)為1.00～2.03，平均值為1.81，葉質(zhì)地的多樣性指數(shù)最小，葉片解剖結(jié)構(gòu)厚的多樣性指數(shù)最大。其中：6個(gè)葉片外部性狀按Shannon多樣性指數(shù)從大到小排序?yàn)橹荛L（1.97）＞葉長（1.88）＞葉寬（1.86）＞葉柄長（1.85）＞長寬比（1.80）＞面積（1.57）；10個(gè)葉片解剖性狀按Shannon多樣性指數(shù)從大到小排序?yàn)槿~片解剖厚度（2.03）＞葉肉細(xì)胞厚度（2.02）＞葉片疏松度（2.01）=氣孔面積（2.01）＞葉片緊實(shí)度（1.94）＞柵海比（1.87）＞海綿組織厚度（1.83）＞氣孔個(gè)數(shù)（1.81）=氣孔密度（1.81）＞柵欄組織厚度（1.78）；2個(gè)質(zhì)量性狀按Shannon多樣性指數(shù)從大到小排序?yàn)槿~緣特征（1.61）＞葉質(zhì)地（1.00）。

2.2 冬青葉表型性狀變異的表型分化

采用巢氏設(shè)計(jì)方差分析對冬青種質(zhì)資源18個(gè)表型性狀進(jìn)行方差分量及表型分化系數(shù)分析，結(jié)果見表3。冬青種質(zhì)資源的平均表型分化系數(shù)為60.19%，種間方差分量占總變異的54.393%，種內(nèi)方差分量占總變異的35.819%，說明種間變異是表型變異的主要來源。

2.3 冬青葉表型性狀相關(guān)性分析

對所測定的18個(gè)葉片表型性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見圖1。在葉片外部性狀中，葉長與葉寬、葉柄長呈極顯著正相關(guān)，葉寬與葉柄長呈極顯著正相關(guān)；葉長、葉寬、葉柄長與面積、周長均呈極顯著正相關(guān)。在葉片解剖性狀中，葉片解剖厚度與葉肉細(xì)胞厚度呈極顯著正相關(guān)；葉片解剖厚度、葉肉細(xì)胞厚度與柵欄組織厚度、海綿組織厚度、葉片疏松度、氣孔面積呈極顯著正相關(guān)，柵欄組織厚度與海綿組織厚度呈極顯著正相關(guān)；而葉片解剖厚度、葉肉細(xì)胞厚度、海綿組織厚度與柵海比、葉片緊實(shí)度呈極顯著負(fù)相關(guān)，柵海比、葉片緊實(shí)度與葉片疏松度、氣孔面積呈極顯著負(fù)相關(guān)；氣孔個(gè)數(shù)與氣孔面積呈顯著負(fù)相關(guān)，與氣孔密度呈極顯著正相關(guān)；氣孔面積與氣孔密度呈顯著負(fù)相關(guān)；在葉片質(zhì)量性狀中，葉緣特征與除葉長寬比之外的葉片外部性狀呈顯著負(fù)相關(guān)，葉質(zhì)地與葉片解剖結(jié)構(gòu)呈顯著相關(guān)。

2.4 冬青葉表型性狀主成分分析

對冬青種質(zhì)資源18個(gè)表型性狀進(jìn)行主成分分析，得到4個(gè)特征值大于1的主成分，反映了冬青種質(zhì)資源葉表型變異，累積貢獻(xiàn)率為85.20%（表4）。前兩個(gè)主成分貢獻(xiàn)率達(dá) 66.77%，選取前兩個(gè)主成分來解釋冬青種質(zhì)資源葉表型變異。另由表4可知：PC1在葉長、葉寬、葉柄長、面積、周長中具有較大載荷，可將PC1看作外部性狀因子；PC2在柵海比、葉片緊實(shí)度、葉片疏松度中具有較大的載荷，這些是描述解剖性狀比率的指標(biāo)；PC3在葉片解剖厚度、葉肉細(xì)胞厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度中具有較大的載荷，因此將PC2和PC3看作解剖性狀因子；PC4在氣孔個(gè)數(shù)和氣孔面積中具有較大的載荷，將PC4看作氣孔結(jié)構(gòu)因子。

2.5 冬青葉表型性狀聚類分析

經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換，采用歐氏距離類平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類，結(jié)果（圖2）顯示，42份冬青種質(zhì)資源可分為4類。第Ⅰ類群只有1份種質(zhì)，其中葉長、葉柄長、葉面積、周長、海綿組織厚度的均值最大，可見該種質(zhì)的性狀特點(diǎn)為葉片大，葉柄長，葉厚革質(zhì)；第Ⅱ類群包括11份種質(zhì)，共同特征為葉片小，葉柄短，葉片緊實(shí)度較高，氣孔個(gè)數(shù)較多，氣孔密度較大，葉片革質(zhì)，葉片邊緣具有鋸齒或者鈍齒；第Ⅲ類群包括21份種質(zhì)，共同特征為葉片大小中等，葉片厚，葉片疏松，胞間隙較大，氣孔面積較大，葉片邊緣具有尖硬刺齒或全緣，葉片厚革質(zhì)或革質(zhì)；第Ⅳ類群包括9份種質(zhì)，共同特征為葉長寬比大于2，葉片薄，氣孔個(gè)數(shù)較少，葉片邊緣具有鋸齒或全緣，葉片多為紙質(zhì)。

3 討 論

表型性狀變異往往在適應(yīng)性和進(jìn)化上具有重要意義，豐富的表型變異提高了群體適應(yīng)不同環(huán)境的可能性，也為種的形成奠定了基礎(chǔ)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)冬青種質(zhì)資源葉表型性狀多樣性差異大，變異豐富，其中葉長、葉面積、葉周長、葉片解剖厚度以及氣孔面積的變異系數(shù)和Shannon-Wiener指數(shù)較高，說明這5個(gè)性狀能夠較好地反映物種間的遺傳變異，這與前人的研究結(jié)果[22-23]相似。

方差分量比及表型分化系數(shù)顯示，冬青種質(zhì)資源葉表型性狀的變異主要來自種間，表型分化系數(shù)在種間表現(xiàn)為葉片外部性狀（76.47%）＞葉片質(zhì)量性狀（71.18%）＞葉片解剖性狀（48.23%），說明冬青種質(zhì)資源葉片形態(tài)差異主要表現(xiàn)在外部性狀，種內(nèi)的分化系數(shù)較小，因此葉片外部性狀適合作為種間分類學(xué)指標(biāo)。其中柵欄組織厚度、柵海比、葉片緊實(shí)度、氣孔個(gè)數(shù)和氣孔面積5個(gè)表型性狀變異主要來源于種內(nèi)，種內(nèi)的多樣性大于種間的多樣性，因此可將這5個(gè)指標(biāo)作為種內(nèi)分類依據(jù)。

冬青種質(zhì)資源的18個(gè)葉片表型性狀之間存在著不同程度的相關(guān)關(guān)系，其中，除了長寬比，葉片外部性狀間均呈極顯著正相關(guān)，葉片外部性狀與葉片解剖性狀呈顯著負(fù)相關(guān)，葉片外部性狀對葉片解剖性狀具有抑制作用，葉片性狀間復(fù)雜的相關(guān)性可能是因?yàn)閿?shù)量性狀受多基因控制所致[24]。根據(jù)主成分分析結(jié)果選取4個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率可達(dá)到85.20%，能反映全部指標(biāo)的絕大部分信息，葉長、葉片緊實(shí)度、柵欄組織厚度和氣孔密度是4個(gè)主成分的主導(dǎo)因子，對葉片表型多樣性起著關(guān)鍵作用，是影響冬青種質(zhì)資源形態(tài)多樣性的主要因素，可作為冬青種質(zhì)資源分類的主要表型指標(biāo)，這與前人選取葉長、解剖結(jié)構(gòu)作為冬青種質(zhì)資源典型性狀指標(biāo)所得的結(jié)果[25-26]一致。

聚類分析能綜合種質(zhì)資源的性狀類型并進(jìn)行分類，能較好地反映種質(zhì)材料之間的親緣關(guān)系。根據(jù)性狀聚類特點(diǎn)，將表型特征相似的冬青種質(zhì)資源聚在一起，結(jié)果顯示，42份冬青種質(zhì)資源可分為大葉-大葉柄類、小葉-小葉柄類、中葉-葉硬鋸齒類、中葉-葉薄紙質(zhì)類4大類群。第Ⅰ類群僅有大葉冬青一份種質(zhì)，大葉冬青與其他冬青屬植物表型性狀相差較大，單獨(dú)成一個(gè)分支；第Ⅱ類群主要是小葉-小葉柄類，這類冬青有較高的觀賞價(jià)值，易修剪，屬于觀賞冬青類；第Ⅲ類群為硬齒類冬青，阿拉斯加冬青與厚葉冬青先聚類，再與‘銀邊’枸骨葉冬青聚類，后依次與其余枸骨葉冬青物種聚類，阿拉斯加冬青和‘銀邊’枸骨葉冬青均是歐洲冬青的育種品種，而厚葉冬青與他們的表型特征較為相似，聚在一起，這與研究人員用測序和分子標(biāo)記所得結(jié)果[3，27-28]有一定的差異，可能是與資源品種、分析指標(biāo)以及環(huán)境因素等有關(guān)；第Ⅳ類群為中葉-葉薄紙質(zhì)類，大部分為落葉冬青，‘奧斯特’和‘冬黃’首先聚在一起，再與‘冬紅’和‘格瑞’聚在一起，同一個(gè)種的聚集在一起。

綜上所述，冬青種質(zhì)資源葉表型性狀變異豐富，變異主要來源于物種間。葉片外部性狀是冬青種質(zhì)資源表型分化的主要因素；葉長、葉片緊實(shí)度、柵欄組織和氣孔密度是4個(gè)主成分的主導(dǎo)因子，可作為冬青種質(zhì)資源的分類鑒定依據(jù)。依據(jù)葉表型性狀可將冬青種質(zhì)資源劃分為大葉-大葉柄類、小葉觀賞類、中葉硬鋸齒類和中葉紙質(zhì)落葉類。該研究對于今后我國冬青種質(zhì)資源的引種栽培與品種選育具有一定的參考價(jià)值，后續(xù)將結(jié)合其他表型性狀、分子標(biāo)記等多方面的研究，進(jìn)一步對冬青種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定、分類與評價(jià)。

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（責(zé)任編輯 鄭琰燚）

基金項(xiàng)目：江蘇省林科院自主科研項(xiàng)目（ZZKY202105）；江蘇省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（花卉）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（JATS[2023]384）。

第一作者：王雪潔（wxjxxz@njfu.edu.cn）。*通信作者：方炎明（jwu4@njfu.edu.cn），教授，負(fù)責(zé)選題指導(dǎo)和論文審定；張敏（nmzhang@163.com），研究員，負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)和論文修改。

引文格式：王雪潔，周鵬，侯思璇，等.冬青種質(zhì)資源葉表型多樣性分析[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2024，48（5）：90-96.

WANG X J，ZHOU P，HOU S X，et al.Leaf phenotypic diversity analysis of holly germplasm resources[J]. Journal of Nanjing Forestry University （Natural Sciences Edition），2024，48（5）：90-96.