摘 要： 犬乳腺腫瘤是犬常發(fā)腫瘤之一，且有50%左右為惡性，其轉(zhuǎn)移傾向明顯，易引起動物死亡。Rho-GTPase蛋白家族中的PREX1蛋白，過度激活會導致Rac-GEF功能紊亂，影響細胞周期，改變細胞生理功能，PREX1的改變可能對細胞癌變有促進作用。為探討PREX1對犬乳腺腫瘤細胞生理功能的影響，本研究使用shRNA沉默PREX1表達，利用Western blot試驗檢測沉默后細胞PREX1蛋白表達量的變化，通過CCK-8試驗、克隆形成試驗探究其對犬乳腺腫瘤細胞系CHMp增殖能力的影響，通過劃痕試驗和Transwell試驗探索沉默其對犬乳腺腫瘤細胞系CHMp侵襲性的影響。研究結果表明，PREX1的低表達，可以抑制CHMp的增殖及侵襲能力。

關鍵詞： 犬乳腺腫瘤；CHMp細胞；增殖；遷移；侵襲

中圖分類號：S858.292；S857.4

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）08-3706-08

收稿日期：2023-08-03

基金項目：廣州市科技計劃項目（202201010033）

作者簡介：徐禧瑩（2001-），女，廣東廣州人，本科生，主要從事寵物腫瘤發(fā)生發(fā)展機制研究，E-mail：miz17665002335@126.com

通信作者：賈 坤，主要從事犬乳腺腫瘤相關研究，E-mail： jiakun@scau.edu.cn

Effects of Silencing PREX1 Expression on Proliferation and Invasiveness of CHMp

XU" Xiying， WANG" Yiheng， OU" Qianting， HONG" Linyuan， LIU" Xujing， LU" Xianying， JIA" Kun*

（College of Veterinary Medicine ，South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China）

Abstract：" Canine mammary gland tumors are a prevalent neoplasm in dogs， with around 50% of cases exhibiting malignancy. They have a conspicuous inclination to spread to other parts of the body and have the potential to readily result in the demise of animals. When the PREX1 protein in the Rho-GTPase family is overstimulated， it can make Rac-GEF less effective， which can mess up the cell cycle and change how cells work. Alterations in PREX1 can potentially facilitate the development of cancerous cells. This study aimed to investigate the influence of PREX1 on the physiological functions of canine mammary tumor cells. In this study， shRNA was used to silence the expression of PREX1. A Western blot test was then used to see how the expression of PREX1 protein changed in the cells after the suppression. The CCK-8 test and colony formation test were used to see how the substance affected the ability of the CHMp canine mammary carcinoma cell line to divide. Additionally， the scratch test and Transwell test were utilized to examine the influence of silencing the substance on the invasiveness of the cell line. Research indicates that reduced expression of PREX1 can impede the proliferation and invasion capacity of CHMp cell lines.

Key words： canine mammary tumor; CHMp; proliferation; migration; invasion

*Corresponding author：" JIA Kun， E-mail：jiakun@scau.edu.cn

腫瘤是動物機體在致癌因素影響下，局部組織、細胞在基因水平上失去對其生長的正常調(diào)控，形成異常增生或分化的細胞群。犬乳腺腫瘤是犬最常見的腫瘤之一，其發(fā)病率約占犬腫瘤疾病發(fā)病率的一半，其中約有47.5%的病例為惡性［1］ ，并且有明顯轉(zhuǎn)移傾向，嚴重影響犬的生命健康。

盡管近年來對犬乳腺腫瘤的防治方案在不斷改進完善，但治愈率并沒有得到明顯提高［2］ 。究其原因主要是由于病患在臨床就診時病程多已是中晚期［3］ ，治療效果甚微。因此及時診斷，并控制疾病發(fā)展對該病治療有著重要意義。

腫瘤細胞首先需要形成偽足并延伸，接著建立新的黏附位點，再收縮細胞體和退化細胞尾部以完成運動過程。PREX1主要激發(fā)的是Rac亞家族［4-5］ ，在細胞形態(tài)變化的過程中，Rac可激活下游效應子WAVE，誘導質(zhì)膜突起形成片狀偽足和基質(zhì)降解。在腫瘤細胞隨后的黏附過程中，活化的Rac1可通過激活PAKl磷酸化下游的黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）發(fā)揮作用［6-7］ 。曾有研究報道PREX1的mRNA在犬乳腺腫瘤中高表達［8］ ，但未進一步驗證PREX1在蛋白水平上的表達情況和對犬乳腺腫瘤生理影響。

shRNA（short hairpin RNA）是一種由兩個短反向重復序列組成的序列，其結構中有一發(fā)夾結構，在目前的疾病治療中有一定作用［9］ 。shRNA由polⅢ啟動子控制［10］ ，再連接5～6個T作為RNA聚合酶Ⅲ的轉(zhuǎn)錄終止子。shRNA通過與PREX1 的mRNA的特異性結合，可以使PREX1的蛋白表達量降低，減弱PREX1在信號通路中的作用，進而衰弱下游信號，使細胞發(fā)生發(fā)展受到阻滯。

CHMp細胞是犬乳腺腫瘤細胞的一支，分離自12歲雌性患惡性乳腺腫瘤犬的原發(fā)病灶，其TNM分期類型為T4N1（+）M1［11］ 。有研究曾對四種不同來源的犬乳腺腫瘤細胞進行性狀分析，得出CHMp細胞不論在細胞活力還是增殖能力方面均較強，適用于犬乳腺腫瘤相關因子和轉(zhuǎn)移機制的研究［12］ 。腫瘤細胞系在體外可以無限次數(shù)的快速增殖，不受分裂次數(shù)等限制，即獲得了永生性［13］ 。同時，在體外長期生長的腫瘤細胞，光學顯微鏡下可見有微絨毛、有偽足等結構；細胞的外形變成圓形；核仁和核膜輪廓比較顯著，大小逐漸變得一致；有大量核糖體顆粒，細胞間隙連接很少等［14］ 。腫瘤細胞的細胞質(zhì)很多，細胞質(zhì)與細胞核比例增大，多有分化現(xiàn)象。在培養(yǎng)上，體外培養(yǎng)和體內(nèi)培養(yǎng)環(huán)境有明顯的差異。體內(nèi)生長的腫瘤細胞，由血管提供所需的營養(yǎng)，而且依賴機體自動調(diào)節(jié)滲透壓和酸堿度；而體外培養(yǎng)的腫瘤細胞，主要靠緩沖系統(tǒng)來調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的酸堿度［15］ 。細胞生長過程中產(chǎn)生的代謝物質(zhì)往往會影響培養(yǎng)液的酸堿度，對細胞系的繁育有一定影響。

在本試驗中，我們作者使用shRNA降低了體外培養(yǎng)的CHMp細胞中PREX1表達量，探究CHMp細胞在體外增殖、遷移和侵襲能力的變化，為犬乳腺腫瘤的深入研究提供數(shù)據(jù)支持，以期揭示該疾病發(fā)生發(fā)展的分子機制，為犬乳腺腫瘤的診斷方法、治療靶點和犬乳腺腫瘤生物標志物等方面的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系

犬乳腺腫瘤細胞（CHMp）由本實驗室保存；含已連接shRNA質(zhì)粒的感受態(tài)細胞DH5α購自上海唯地廣州睿博生物技術有限公司。

1.1.2 試劑

Hiscript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Cham Q Universal SYBR qPCR Master Mix熒光定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、高糖培養(yǎng)基（Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM）和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）購自以色列Biological Industries公司；胰蛋白酶（trypsin-EDTA）、雙抗（penicillin-streptomycin）、Opti-MEM I減血清培養(yǎng)基購自賽默飛世爾科技有限公司；LipofectamineTM 8000TM reagent轉(zhuǎn)染試劑、快速封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、抗GAPDH鼠源單克隆抗體購自上海碧云天生物技術有限公司；氨芐青霉素、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒、Endo Free Maxi Plasmid Kit無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自天根生化科技有限公司；CCK solution、吉姆薩染液、高效RIPA組織/細胞裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）購自北京索萊寶科技有限公司；雙色預染蛋白Marker，PAGE凝膠快速制備試劑盒購自上海雅酶生物科技有限公司；抗PREX1兔源單克隆抗體購自美國Affinity Biosciences公司；羊抗兔熒光二抗購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；羊抗鼠熒光二抗購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成

參照NCBI上已發(fā)表有關犬PREX1的mRNA序列，設計合成qPCR特異性引物。其引物序列為F（5′-AAAGGCCTCACAGAGGAGAAC-3′）， R（5′-TACTCCAAGG-CAGCCAAGAAA-3′）。

1.2.2 細胞培養(yǎng)

CHMp細胞使用添加10%BSA血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37℃含5%CO2的溫箱中，每16～24h傳代一次，取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)試驗。

1.2.3 shRNA質(zhì)粒提取

使用氨芐抗性肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)睿博公司提供的含已連接shRNA質(zhì)粒的感受態(tài)細胞DH5α后，根據(jù)EndoFree Maxi Plasmid Kit試劑盒說明書進行質(zhì)粒提取操作。

1.2.4 細胞轉(zhuǎn)染和效率檢測

使用Lipofectamine 8000TM試劑將由睿博公司合成的shRNA轉(zhuǎn)染入對數(shù)生長期CHMp細胞中（分為轉(zhuǎn)染組shRNA-PREX1-CHMp、陰性對照組shRNA-NC-CHMp和空白對照組CHMp），使用RT-qPCR方法檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5 Western blot法檢測shRNA沉默后各組犬乳腺腫瘤細胞PREX1蛋白表達量

取穩(wěn)定傳代且生長狀態(tài)良好的CHMp、shRNA-PREX1-CHMp和shRNA-NC-CHMp細胞，使用預混的裂解液（預混比例：100 μL RIPA∶1 μL PMSF）分別裂解后提取蛋白。使用BCA法檢測提取的蛋白濃度。使用雅酶10.0%的PAGE凝膠快速制備試劑盒配置凝膠，待制膠完成后進行電泳（程序：80 V/30 min; 120 V/60 min）。裁取35～40 ku（內(nèi)參，36 ku）以及150～250 ku（目的蛋白，186 ku）的凝膠片段，在冰上轉(zhuǎn)至PVDF膜（程序：GAPDH：400 mA/20 min；PREX1：400 mA/90 min）。轉(zhuǎn)膜終了，使用快速封閉液對PVDF膜進行封閉，分別使用適量的一抗（稀釋的碧云天鼠源單克隆抗體：GAPDH：1∶5 000；稀釋的Affinity兔源單克隆抗體：PREX1：1∶500）浸潤含內(nèi)參和含目的蛋白的PVDF膜，于4 ℃環(huán)境孵育過夜。回收抗體液，使用PBST對PVDF膜清洗后，分別使用Abcam品牌和ABclonal的羊抗鼠熒光二抗和羊抗兔熒光二抗（稀釋倍數(shù)均為1∶5 000）對以上PVDF膜在常溫下避光、搖晃孵育1 h。使用PBST清洗，在LI-COR紅外雙色成像系統(tǒng)掃膜儀中掃膜成像，并用Image J軟件分析結果。

1.2.6 CCK-8法檢測shRNA-PREX1轉(zhuǎn)染犬乳腺腫瘤細胞增殖的情況

取穩(wěn)定傳代且生長狀態(tài)良好的CHMp、shRNA-PREX1-CHMp和shRNA-NC-CHMp細胞，將貼壁細胞重懸后稀釋為1×103個·100 μL-1，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，設置3個重復組，同時以不加細胞的培養(yǎng)基為空白對照。從接種后24 h開始，往細胞培養(yǎng)板中每孔加入10 μL的CCK Solution，繼續(xù)在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，后用酶標儀檢測每個加樣孔的OD450 nm值。每隔24 h，按上述步驟操作，直至72 h。

1.2.7 克隆形成試驗檢測shRNA-PREX1轉(zhuǎn)染犬乳腺腫瘤細胞增殖的情況

取穩(wěn)定傳代且生長狀態(tài)良好的CHMp、shRNA-PREX1-CHMp和shRNA-NC-CHMp細胞，將貼壁細胞重懸后稀釋為2×103個·孔-1，接種于6孔細胞培養(yǎng)板，設置3個重復組。將細胞培養(yǎng)板置于細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)1周。棄盡舊培養(yǎng)液來使細胞的克隆培養(yǎng)達到終止，清洗后加適量的多聚甲醛（4%），靜置1 h，進行細胞固定。固定終了，棄固定液，加入適量10%吉姆薩染液作細胞染色20 min。吸取染色液，并至自然干燥，拍照，并用ImageJ軟件分析結果。

1.2.8 劃痕試驗檢測shRNA-PREX1轉(zhuǎn)染犬乳腺腫瘤細胞遷移的情況

取穩(wěn)定傳代且生長狀態(tài)良好的CHMp、shRNA-PREX1-CHMp和shRNA-NC-CHMp細胞，將貼壁細胞重懸后稀釋為1×106個·孔-1，接種于6孔細胞培養(yǎng)板，設置3個重復組。細胞密度達85%時，棄掉培養(yǎng)液，并對貼壁細胞進行劃痕，洗滌劃下的細胞，并更換無血清培養(yǎng)基后鏡下拍照。細胞培養(yǎng)板于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別在12和24 h再次拍照。用ImageJ軟件分析結果。

1.2.9 Transwell試驗檢測shRNA-PREX1轉(zhuǎn)染犬乳腺腫瘤細胞侵襲的情況

取穩(wěn)定傳代且生長狀態(tài)良好的CHMp、shRNA-PREX1-CHMp和shRNA-NC-CHMp細胞，用不含血清的DMEM培養(yǎng)液將細胞懸液密度稀釋為5×105個·mL-1備用。向Transwell小室中加入用DMEM培養(yǎng)液稀釋的Matrigel基質(zhì)膠，待其凝固后吸出殘余液體，并向小室中加入200 μL細胞懸液，再將小室置于含500 μL完全培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)板中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)基，洗滌，乙醇固定，再使用10%吉姆薩染液作細胞染色15 min。染色終了，吸取染色液，擦去上層未侵襲成功的細胞，倒置顯微鏡下觀察并拍照。用Image J軟件分析結果。

2 結 果

2.1 RT-qPCR檢測各組細胞PREX1 mRNA的表達量

shRNA對犬乳腺腫瘤細胞CHMp的轉(zhuǎn)染效率

從感受態(tài)細胞DH5α提取已連接shRNA的質(zhì)粒，用于后續(xù)的轉(zhuǎn)染工作。轉(zhuǎn)染后，使用RT-qPCR方法進行mRNA表達量的檢測。結果顯示，與對照組相比，有效沉默后PREX1 mRNA的表達量明顯降低（Plt;0.05），表明在shRNA-PREX1-CHMp細胞中成功沉默了PREX1 mRNA的表達，但shRNA-NC-CHMp細胞中PREX1 mRNA的表達沒有受到明顯影響。即shRNA-PREX1-CHMp細胞組中PREX1 mRNA表達量較低，其他組可正常表達（圖1）。

2.2 Western blot檢測各組細胞PREX1蛋白的表達量

2.2 shRNA沉默PREX1表達后蛋白表達量檢測

用Western blot方法檢測CHMp、shRNA-NC-CHMP、shRNA-PREX1-CHMp3組細胞PREX1蛋白的表達量。結果表明（圖2、3），陰性對照組shRNA-NC-CHMp細胞與空白對照CHMp細胞之間在PREX1蛋白表達量上無明顯差異（Pgt;0.05），而轉(zhuǎn)染組shRNA-PREX1-CHMp細胞與對照組之間在PREX1蛋白表達量上有顯著差異性（Plt;0.01），與qRT-PCR的結果一致，說明CHMp細胞轉(zhuǎn)染shRNA-PREX1質(zhì)粒后PREX1蛋白表達量減少。

2.3 shRNA沉默PREX1對犬乳腺腫瘤細胞CHMp增殖效率能力的影響

對穩(wěn)定傳代和生長良好的細胞，使用CCK-8試驗和克隆形成試驗兩種方法對增殖能力進行檢測。根據(jù)CCK-8試驗，結果表明，shRNA-NC-CHMp細胞與空白對照CHMp細胞的OD值無明顯差異（Pgt;0.05），而轉(zhuǎn)染組shRNA-PREX1-CHMp與其他兩組細胞的OD值差異極顯著（Plt;0.01，圖4）。根據(jù)克隆形成試驗，結果表明，有效轉(zhuǎn)染后，CHMp細胞克隆形成率明顯降低（Plt;0.001，圖5、6）。這表明對PREX1有效沉默后，可導致CHMp細胞增殖能力減弱。

2.4 shRNA沉默PREX1對犬乳腺腫瘤細胞CHMp遷移效率能力的影響

對分布于6孔細胞培養(yǎng)板中等量的細胞，進行相同的劃痕操作，拍照后使用ImageJ軟件進行數(shù)據(jù)分析。遷移路徑效率以劃痕后區(qū)域面積變化作為指標，根據(jù)結果可發(fā)現(xiàn)，陰性對照組shRNA-NC-CHMp細胞與空白對照CHMp細胞的橫向遷移面積，結果不具有統(tǒng)計學差異（Pgt;0.05），而對照組和shRNA-PREX1-CHMp細胞對比，后者的橫向遷移面積相比于前者極顯著減少（Plt;0.001，圖7、8）。這表明對PREX1有效沉默后，可導致CHMp細胞遷移能力明顯減弱。

2.5 shRNA沉默PREX1對犬乳腺腫瘤細胞CHMp侵襲能力的影響

不同組別、相同數(shù)量的穿透Matrigel基質(zhì)膠，以侵襲的細胞數(shù)量作為細胞侵襲能力的衡量標準。根據(jù)結果顯示，陰性對照組shRNA-NC-CHMp細胞與空白對照CHMp細胞之間在遷移能力侵襲數(shù)量上無明顯差異（Pgt;0.05），而有效轉(zhuǎn)染組shRNA-PREX1-CHMp細胞與其他兩組之間在侵襲數(shù)量上有極顯著差異性（Plt;0.001），與空白對照組差距尤甚（圖9、10）。這表明對PREX1有效沉默后，可導致CHMp細胞侵襲能力明顯降低。

3 討 論

本研究較好地驗證了PREX1對犬乳腺腫瘤細胞生長特性的調(diào)控作用。從細胞水平上探究了PREX1的表達對犬乳腺腫瘤細胞生物學功能的影響。研究假設，沉默PREX1后，CHMp細胞的生物學活性有所減弱，故通過CCK-8試驗、克隆形成試驗、劃痕試驗、Transwell試驗對其進行驗證，發(fā)現(xiàn)沉默PREX1可以有效抑制犬乳腺腫瘤細胞CHMp的增殖、遷移和侵襲。

研究過程中使用的方法具有參考意義。CCK-8試驗利用細胞內(nèi)脫氫酶氧化還原，使試劑顏色發(fā)生 變化（生成甲臜），其生成量和CHMp活細胞數(shù)量成正比。通過無放射性的比色檢測方法，可以得到細胞的生長曲線。具有增殖活力的細胞能夠貼壁并形成克隆，故通過克隆形成試驗得到的克隆形成率用于描述CHMp增殖能力較為精確。通過在細胞培養(yǎng)板上人為制造空白區(qū)域，區(qū)域邊緣的細胞會向區(qū)域內(nèi)遷移。顯微鏡定期拍照，可用于判斷劃痕區(qū)域的愈合情況，從而反映細胞的遷移能力。Transwell小室中，CHMp細胞需要分泌水解酶，并變形運動，才可穿過基質(zhì)膠，進入下室。通過計算侵入下室的細胞比例數(shù)量，可較好反映細胞的侵襲能力。

更進一步地對PREX1的機理進行探討。

PREX1作為Rho-GTPase蛋白家族中的一員，其過度激活主要帶來Rac-GEF的紊亂，刺激中性粒細胞趨化和活性氧的形成［16］ 。在雌激素受體陽性的腫瘤中，PREX1的mRNA表達量有所上升，而在正常的乳腺組織中，很少發(fā)現(xiàn)其表達［4］ 。

Rac在細胞表面延伸，形成偽足的過程中發(fā)揮重要作用，在此其中，如板狀偽足的形成系典例［17］ ，通過效應器Lpd完成遷移和侵襲的前期準備。Lpd在細胞遷移過程中向細胞骨架傳遞信號，通過肌動蛋白、效應器VASP、WAVE相關復合物相互作用促進肌動蛋白聚合［6］ 。其中，VASP伸長肌動蛋白絲，WAVE相關復合物與Arp2/3之間發(fā)生信號轉(zhuǎn)導，從而使肌動蛋白更多地生成［18］ 。此時，癌細胞已經(jīng)獲得了遷移的基礎能力，在Rac過度表達的情況下，就可表現(xiàn)為顯性的體內(nèi)轉(zhuǎn)移，突破基底膜后，腫瘤從良性向惡性轉(zhuǎn)變，從而縮短患病動物生存時間［19］ 。蛋白質(zhì)SUMO化可改變蛋白質(zhì)結構，從而使功能發(fā)生變化。Lorente等［20］ 學者指出，使用銀杏酸抑制蛋白質(zhì)SUMO化，一方面可通過自噬細胞使癌細胞死亡，另一方面可通過Rac1途徑抑制腫瘤的侵襲活動。由此認為，根據(jù)Rac在腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲上的表現(xiàn)，若可從根本上消除由Rac過度表達的因素，腫瘤生長就會受到阻礙，故PREX1成為本研究的重要選擇。

本研究存在一些局限性。首先，我們所用細胞為標準的CHMp細胞，通過體外試驗得到的結論，不一定在神經(jīng)、體液、免疫多重調(diào)節(jié)下的機體內(nèi)有效，且本研究缺乏正常犬乳腺細胞作為對照，shRNA-PREX1的組合能否依舊在體內(nèi)正常且安全的運作有待商榷；其次，試驗未進行大量患病動物樣本的回顧性研究，試驗中CHMp細胞所提供的結論價值需要更多的證據(jù)支撐，而用于臨床后，前瞻性研究也很有必要。

PREX1的作用為在針對犬乳腺腫瘤的新型療法開發(fā)上提供了不同的視角。通過選擇性抑制PREX1的cAMP依賴性激活，設計針對性的阻斷化合物［21］ 。除此以外，將PREX1結構鎖定在緊密構象的狀態(tài)以抑制表達也有可行性，可嘗試設計變構調(diào)節(jié)劑以實現(xiàn)相應的構象。

4 結 論

本研究證實了通過沉默PREX1表達，CHMp細胞的增殖能力、遷移能力和侵襲能力減弱。這為后續(xù)對PREX1更深入的研究、探索其影響犬乳腺腫瘤相關機制提供理論基礎。

參考文獻（References）：

［1］ SALAS Y， MáRQUEZ A， DIAZ D， et al. Epidemiological study of mammary tumors in female dogs diagnosed during the period 2002-2012：a growing animal health problem［J］. PLoS One， 2015， 10（5）：e0127381.

［2］ KASZAK I， RUSZCZAK A， KANAFA S， et al. Current biomarkers of canine mammary tumors［J］. Acta Vet Scand， 2018， 60（1）：66.

［3］ DOLKA I， CZOPOWICZ M， GRUK-JURKA A， et al. Diagnostic efficacy of smear cytology and Robinson′s cytological grading of canine mammary tumors with respect to histopathology， cytomorphometry， metastases and overall survival［J］. PLoS One， 2018， 13（1）：e191595.

［4］ SOSA M S， LOPEZ-HABER C， YANG C F， et al. Identification of the Rac-GEF P-Rex1 as an essential mediator of ErbB signaling in breast cancer［J］. Mol Cell， 2010， 40（6）：877-892.

［5］ MONTERO J C， SEOANE S， OCAA A， et al. P-Rex1 participates in Neuregulin-ErbB signal transduction and its expression correlates with patient outcome in breast cancer［J］. Oncogene， 2011， 30（9）：1059-1071.

［6］ ACEVEDO-DíAZ A， ORTIZ-SOTO G， SUáREZ-ARROYO I J， et al. Ganoderma lucidum extract reduces the motility of breast cancer cells mediated by the RAC-Lamellipodin axis［J］. Nutrients， 2019， 11（5）：1116.

［7］ TU-SEKINE B， PADHI A， JIN S， et al. Inositol polyphosphate multikinase is a metformin target that regulates cell migration［J］. FASEB J， 2019， 33（12）：14137-14146.

［8］ 吳居業(yè)， 陳和壁， 盧寶春， 等. TNC、PREX1、THBS1和SERPINE1的mRNA在犬乳腺腫瘤中表達水平的差異性分析［J］. 中國獸醫(yī)科學， 2021， 51（5）：663-670.

WU J Y， CHEN H B， LU B C， et al. Analysis of the differences in the expression levels of the mRNA of TNC， PREX1， THBS1 and SERPINE1 in canine mammary tumors［J］. Chinese Veterinary Science， 2021， 51（5）：663-670. （in Chinese）

［9］ ACHARYA R. The recent progresses in shRNA-nanoparticle conjugate as a therapeutic approach［J］. Mater Sci Eng C， 2019， 104：109928.

［10］ JAI J， SHIRLEEN D， HANBALI C， et al. Multiplexed shRNA-miRs as a candidate for anti HIV-1 therapy：strategies， challenges， and future potential［J］. J Genet Eng Biotechnol， 2022， 20（1）：172.

［11］ NAKAGAWA T， WATANABE M， OHASHI E， et al. Cyclopedic protein expression analysis of cultured canine mammary gland adenocarcinoma cells from six tumours［J］. Res Vet Sci， 2006， 80（3）：317-323.

［12］ 崔 文， 范宏剛， 肖建華， 等. 犬乳腺腫瘤細胞系的生物學特性及p53因子表達分析［J］. 中國預防獸醫(yī)學報， 2014， 36（6）：444-447.

CUI W， FAN H G， XIAO J H， et al. Biological characterization and analysis the expression of p53 in cell lines of the canine mammary gland tumor［J］. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine， 2014， 36（6）：444-447. （in Chinese）

［13］ KONTOMANOLIS E N， KOUTRAS A， SYLLAIOS A， et al. Role of oncogenes and tumor-suppressor genes in carcinogenesis：a review［J］. Anticancer Res， 2020， 40（11）：6009-6015.

［14］ MATOS A J F， BAPTISTA C S， G?RTNER M F， et al. Prognostic studies of canine and feline mammary tumours：the need for standardized procedures［J］. Vet J， 2012， 193（1）：24-31.

［15］ MOULTON J E， TAYLOR D O， DORN C R， et al. Canine mammary tumors［J］. Pathol Vet， 1970， 7（4）：289-320.

［16］ WELCH H C E， COADWELL W J， ELLSON C D， et al. P-Rex1， a PtdIns（3， 4， 5）P3-and Gβγ-regulated guanine-nucleotide exchange factor for Rac［J］. Cell， 2002， 108（6）：809-821.

［17］ 楊 穎， 田文沁. Rho蛋白調(diào)控血小板細胞骨架重排的分子機制研究進展［J］. 中國實驗診斷學， 2020， 24（1）：147-149.

YANG Y， TIAM W Q. A review on the molecular mechanism of Rho protein regulating platelet cytoskeleton rearrangement［J］. Chinese Journal of Laboratory Diagnosis， 2020， 24（1）：147-149. （in Chinese）

［18］ KRAUSE M， GAUTREAU A. Steering cell migration：lamellipodium dynamics and the regulation of directional persistence［J］. Nat Rev Mol Cell Biol， 2014， 15（9）：577-590.

［19］ CARMONA G， PERERA U， GILLETT C， et al. Lamellipodin promotes invasive 3D cancer cell migration via regulated interactions with Ena/VASP and SCAR/WAVE［J］. Oncogene， 2016， 35（39）：5155-5169.

［20］ LORENTE M， GARCíA-CASAS A， SALVADOR N， et al. Inhibiting SUMO1-mediated SUMOylation induces autophagy-mediated cancer cell death and reduces tumour cell invasion via RAC1［J］. J Cell Sci， 2019， 132（20）：jcs234120.

［21］ YE R D. The Rho guanine nucleotide exchange factor P-Rex1 as a potential drug target for cancer metastasis and inflammatory diseases［J］. Pharmacol Res， 2020， 153：104676.

（編輯 白永平）