摘 要： 旨在探究豬鏈球菌中ICE_Prophage攜帶耐藥基因轉移的情況，使用Illumina MiSeq和Pacbio RSII平臺對豬鏈球菌SC124菌株進行了全基因組測序，利用在線網站RAST、ICEberg 3.0、PHASTER和NCBI數據庫對SC124菌株的基因組序列進行分析；用肉湯稀釋法測定最小抑菌濃度；通過接合試驗驗證ICE_Prophage攜帶耐藥基因的可轉移性；采用反向PCR檢測環(huán)狀中間體的存在；用競爭試驗評估接合子是否具有適應性代價。結果顯示：豬鏈球菌SC124菌株中存在攜帶四環(huán)素類、大環(huán)內酯類和氨基糖苷類耐藥基因的ICE_Prophage（ICESsuSC124_ΦSsuSC124）；攜帶四環(huán)素類耐藥基因的ICESsuSC124以5.52×10-9頻率發(fā)生轉移，未發(fā)現前噬菌體發(fā)生轉移；ICESsuSC124可以形成一個大小約為3.8 kb的環(huán)狀中間體；與豬鏈球菌BAA相比，含有ICESsuSC124的接合子在無藥物壓力選擇的作用下不具有競爭優(yōu)勢，接合子會產生一定程度的適應性代價。綜上，豬鏈球菌SC124菌株中存在攜帶四環(huán)素類、大環(huán)內酯類和氨基糖苷類耐藥基因的ICE_Prophage，ICESsuSC124可發(fā)生水平轉移，其接合子可產生一定程度的適應性代價。

關鍵詞： 豬鏈球菌；ICE_Prophage；接合試驗；適應性代價

中圖分類號： S852.611

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）08-3699-07

收稿日期：2023-11-30

基金項目：河南省重點研發(fā)與推廣專項（科技攻關）（232102110094；232102110110；242102110068）

作者簡介：段慧慧（1998-），女，河南周口人，碩士生，主要從事細菌耐藥機制研究，E-mail：1832292562@qq.com

通信作者： 商艷紅，主要從事細菌耐藥機制研究，E-mail： shangyanhong@henau.edu.cn

Horizontal Transfer of Drug Resistance Genes Carried by ICE_Prophage in Streptococcus

suis SC124

DUAN" Huihui1， REN" Shihang1， ZHANG" Hongyin1， YU" Rui2， LIU" Zhonghu1， DU" Xiangdang1， SHANG

Yanhong1*

（1.College of Veterinary Medicine，Henan Agricultural University，Zhengzhou， Henan 450046， China;2.College

of Veterinary Medicine，Henan University of Animal Husbandry and Econom， Zhengzhou， Henan 450046， China）

Abstract：" This study aimed to investigate the transfer of drugantibiotic resistance genes （ARGs） carried by ICE_Prophage in Streptococcus suis. The whole genome sequencing of S. suis SC124 was sequenced by performed using the Illumina MiSeq and Pacbio RSII platforms. The whole genome sequence of SC124 strainisolates was analyzed by online websites RAST， ICEberg 3.0， PHASTER and NCBI database. MICs were determined by broth microdilution. The transferability of ICE_Prophage carrying drug resistance genesARGs in S. suis was investigated by conjugation. The present of circular intermediates was examined by inverse PCR. Competition was used to evaluate whether the transconjugant had fitness cost. The results showed that there was an ICE_Prophage （ICESsuSC124_ΦSsuSC124） carrying tetracycline， macrolide and aminoglycoside resistance genes in S. suis SC124 strain. ICESsuSC124 carrying tetracycline resistance genes was transferred at a frequency of 5.52×10-9， and no prophage transfer was found. Inverse PCR revealed that ICESsuSC124 formed a circular intermediate with a size of about 3.8 kb. Compared with S. suis BAA， the transconjugant containing ICESsuSC124 did not have a competitive advantage under the action of drug-free pressure selection， and the transconjugant can produce a certain degree of fitness cost. These results indicated thatIn conclusion， the ICE_Prophage carrying tetracycline， macrolide and aminoglycoside resistance genes in S. suis SC124， in which ICESsuSC124 could be horizontally transferred， and the transconjugant could produce a certain degree of fitness cost.

Key words： Streptococcus suis; ICE_Prophage; conjugation; fitness cost

*Corresponding author： SHANG Yanhong， E-mail： shangyanhong@henau.edu.cn

豬鏈球菌（Streptococcus suis）是一種人獸共患病病原菌，豬感染后可引起多種疾病，包括敗血癥、腦膜炎、關節(jié)炎和心內膜炎等［1］，人感染后主要表現為腦膜炎或鏈球菌中毒性休克樣綜合征（Streptococcal toxic shock-like syndrome，STSS）［2］?？股氐膹V泛使用導致臨床分離豬鏈球菌的耐藥譜逐漸擴大，這預示著耐藥機制也更加復雜。先前的研究已將豬鏈球菌描述為關鍵的抗生素抗性基因庫和驅動抗生素發(fā)生耐藥性進化的基因傳遞系統［3］，且基因的水平轉移是促進細菌產生多重耐藥的主要原因，在細菌的進化過程中發(fā)揮重要的作用。

細菌中可移動遺傳元件（mobilizable genetic elements，MGEs）主要包括質粒、基因組島、整合性接合元件（integrative and conjugative elements，ICEs）、轉座子、噬菌體（phage）和嵌合元件等，它們可組成不同的形式攜帶單個或多個抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes，ARGs）并在種內/種間轉移［4］。豬鏈球菌中ICEs能夠通過接合進行切除、環(huán)化和轉移［4］。前噬菌體（prophage）是在細菌細胞內保持非感染性狀態(tài)的噬菌體，既可整合到細菌染色體中，又可作為染色體外質粒存在，其可將產生噬菌體的能力傳遞給子代。先前的研究已證實豬鏈球菌中存在許多串聯遺傳元件形式，包括ICE_ICE、ICE_Prophage或Prophage_ICE等，這些攜帶ARGs的串聯遺傳元件逐漸增多，預示著豬鏈球菌存在其它潛在的傳播機制［5］。研究表明，噬菌體可以作為耐藥基因的儲存庫并促進耐藥基因在環(huán)境中的水平傳播［3，6］，且鏈球菌中SMphages可在ICE的幫助下發(fā)生轉移［6］。盡管發(fā)現的許多豬鏈球菌中存在ICE_Prophage，但其攜帶耐藥基因共同轉移的依據尚少；因此，探究ICE_Prophage攜帶ARGs發(fā)生轉移的機制可為科學防控豬鏈球菌病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源和藥敏試驗

豬鏈球菌SC124菌株分離自山西某豬場病豬的關節(jié)液，豬鏈球菌BAA-853（Rifr）（以下簡稱BAA）為實驗室保存菌株，所有菌株均在37℃培養(yǎng)于THB肉湯（含5%胎牛血清）或THA瓊脂（含5%無菌脫纖維羊血），用微量肉湯稀釋法測定細菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentrations，MICs），根據EUCAST藥敏指南判斷菌株是否耐藥［7］。選取利福平、夫西地酸鈉、克林霉素、林可霉素、紅霉素、四環(huán)素、氯霉素、氟苯尼考和氨芐西林鈉作為受試藥物。肺炎鏈球菌ATCC49619作為藥敏試驗的質控菌株。

1.2 全基因組測序分析和PCR分析

對豬鏈球菌SC124菌株進行基因組提取，質量檢測合格后，送至南京派森諾基因科技有限公司。采用PacBio RS和Illumina MiSeq平臺對豬鏈球菌SC124菌株進行全基因組測序，用HGAP4和CANU（1.6版本）組裝PacBio序列，然后用Illumina MiSeq（1.22版本）進行校正；使用Glimmer 3.0對閱讀框進行預測和注釋；使用Easyfig 2.2.2進一步分析和可視化ARGs的遺傳環(huán)境。根據試驗需求共合成了18對引物，P1～P7［4］用于確定菌株的MLST分型（dpr、thrA、cpn60、recA、gki、aroA和mutS），P8～P14［4］用于驗證串聯遺傳元件攜帶的耐藥基因（tet（O）、tet（40）、mef（A）、msr（D）、erm（B）、aph（3′）和ant（6）-I），P15（F：5′-GCATCTCACTTATCCAGCCC-3′，R：5′-CAAAGACAGCT-CCAACCTAT-3′）、P16（F：5′-AGATTAGGTTGCGTAGGGCA-3′，R：5′-AATATGCACAGGCG-TTCC-3′）、P17（F：5′-TTTAGCCAGTTTCGTCG-TT-3′，R：5′-CCTCGTTTCCAGGTCTTCG-3′）和P18（F：5′-AGCGAAGATCAGAAGAAC-3′，R：5′-GGTCGGTGACAAGCCAGA-3′）用于驗證串聯遺傳元件能否形成環(huán)狀中間體。引物均由河南尚亞生物技術有限公司合成，所有PCR產物進行Sanger測序。

1.3 接合試驗

接合試驗步驟按文獻［8］所述進行。以豬鏈球菌SC124菌株為供體菌、BAA菌株為受體菌進行接合試驗。在THA培養(yǎng)皿中加入32 mg·L-1利福平、32 mg·L-1夫西地酸鈉和32 mg·L-1四環(huán)素/16 mg·L-1紅霉素/32 mg·L-1四環(huán)素與16 mg·L-1紅霉素進行接合子篩選。通過藥敏試驗、PCR擴增和測序等方法驗證THA選擇培養(yǎng)皿（含有四環(huán)素/紅霉素/四環(huán)素與紅霉素、利福平和夫西地酸鈉）上生長出的接合子。

接合轉移的頻率=

接合子數量在有四環(huán)素/紅霉素/四環(huán)素與紅霉素的THA上生長的供體菌數

1.4 競爭試驗

豬鏈球菌供體菌、受體菌和接合子分別在180 r·min-1，37 ℃培養(yǎng)12 h，隨后將其按照1∶100接進新鮮的THB肉湯（含5%胎牛血清）中，每小時測定培養(yǎng)物OD600 nm，連續(xù)測量12 h，隨后用GraphPad 8.0繪制生長曲線。

競爭試驗由3個獨立的試驗完成。將豬鏈球菌BAA和接合子在180 r·min-1，37 ℃培養(yǎng)16 h，分別將1×108 CFU的豬鏈球菌BAA與1×108 CFU的接合子混合。混合物在37 ℃和180 r·min-1下生長，每12 h以1∶100稀釋到新鮮THB肉湯中。每次稀釋前，取樣并同時涂于不含抗生素和含四環(huán)素的THA板上。含四環(huán)素平板上生長的菌落數為混合培養(yǎng)體系中耐藥菌的數量，無抗生素平板上的菌落數減去四環(huán)素平板上的菌落數即為混合培養(yǎng)系統中敏感菌的數量。

2 結 果

2.1 在豬鏈球菌中發(fā)現了ICE_Prophage

利用在線工具RAST、ICEberg 3.0和PHASTER對SC124菌株的全基因組測序結果進行分析，發(fā)現一個攜帶四環(huán)素類、大環(huán)內酯類和氨基糖苷類耐藥基因的ICE_Prophage，長約125.765 kb，將其命名為ICESsuSC124_ΦSsuSC124。通過NCBI數據庫的比對，發(fā)現此串聯遺傳元件與Huang等［3］分離出的豬鏈球菌TZ080501菌株和Wu等［9］分離出的SC070731菌株相似性最大（圖1）。進一步對3株豬鏈球菌中串聯遺傳元件基因組分析，發(fā)現它們的ICE和前噬菌體的兩端均存在相似的8 bp不完全重復序列；且這些不完全重復序列與ICE和Prophage的位置無關（表1）。

豬鏈球菌SC124的串聯遺傳元件中ICESsuSC124攜帶核糖體保護類型耐藥基因tet（O）和MFS外排泵耐藥基因tet（40）；此外，ICESsuSC124中還存在一種Zeta毒素-抗毒素（TA）結構。通過PHASTER在線工具預測出ΦSsuSC124是一個完整型前噬菌體（intact prophage，得分gt;90），大小約為56.4 kb，由核心區(qū)和可變區(qū)組成。其中前噬菌體的核心結構包含了5個功能模塊（DNA復制、DNA修飾、DNA包裝和形態(tài)發(fā)生、宿主細胞裂解和溶源控制）。ΦSsuSC124的可變區(qū)中含有大環(huán)內酯類-林可酰胺類-鏈霉素B抗性耐藥基因［erm（B）、mef（A）、msr（D）］和氨基糖苷類耐藥基因［ant（6）-I、aph（3′）］，這與Huang等［6］的研究結果相似。有研究證實，肺炎鏈球菌和化膿鏈球菌中存在的攜帶mef（A）和msr（D）耐藥基因的Mega元件可賦予細菌大環(huán)內酯類藥物的耐藥表型［10-11］。通過對ΦSsuSC124的進一步分析，發(fā)現其也含有類似的Mega元件。藥敏結果顯示豬鏈球菌SC124對四環(huán)素和紅霉素耐藥（表2）。

2.2 豬鏈球菌中環(huán)狀中間體活性驗證

豬鏈球菌中有活性的ICEs和前噬菌體等遺傳元件在發(fā)生水平轉移時會先形成環(huán)狀結構（形成機制見圖2A），隨后同源重組到其它鏈球菌中［12］。利用“1.2”中設計的引物，用PCR擴增的方法對SC124菌株中串聯遺傳元件進行活性驗證；測序結果顯示ICESsuSC124和ΦSsuSC124能形成環(huán)狀中間體（圖2B），表明豬鏈球菌SC124菌株中存在的ICESsuSC124和ΦSsuSC124可形成具有活性的遺傳元件，在某種特定的情況下，這些串聯遺傳元件以多種形式在種內/間發(fā)生水平轉移。

2.3 ICESsuSC124的可轉移性

接合試驗表明，ICESsuSC124可以從供體菌轉移到受體菌，但是未發(fā)現前噬菌體發(fā)生轉移（圖1）。ICESsuSC124被插入到豬鏈球菌中最常見的rum1321-1331位點，其兩端可形成11 bp的重復序列（5′-CACGTGGAGTG-3′），該位點在豬鏈球菌中高度保守。藥敏結果顯示，獲得ICESsuSC124的受體菌四環(huán)素MIC值升高（表2）；供體菌SC124（ST7）、受體菌BAA（ST1）和接合子（ST1）通過MLST分型進行鑒別。

2.4 豬鏈球菌生長曲線與競爭試驗結果

測定了受體菌BAA與接合子BAA+ICESsuSC124在無藥物壓力下的生長動力學，繪制生長曲線圖（圖3A）。結果表明，在沒有藥物壓力的選擇下，豬鏈球菌BAA與接合子BAA+ICESsuSC124的生長速度無顯著差異。

豬鏈球菌BAA與接合子BAA+ICESsuSC124的競爭試驗結果顯示，從第2天開始，接合子BAA+ICESsuSC124的比例開始下降，第4代時出現短暫的上升；連續(xù)傳代30次，仍能夠檢測到攜帶ICESsuSC124的菌株，盡管接合子的比例偶爾出現上升的現象，但整體呈下降趨勢（圖3B）。這些結果表明，與豬鏈球菌BAA相比，含有ICESsuSC124的接合子在無藥物壓力選擇的作用下不具有競爭優(yōu)勢，說明含有ICESsuSC124的接合子存在一定程度的適應性代價。

3 討 論

盡管豬鏈球菌SC124菌株中的ICE_Prophage串聯遺傳元件與前人報道［3，9］的高度相似，但其在豬鏈球菌中的普遍性缺乏研究。通過對ICESsuSC124_ΦSsuSC124串聯遺傳元件的分析，發(fā)現其攜帶多種ARGs，這使得多種常用藥物對具有該結構的豬鏈球菌失去治療作用，給臨床治療帶來巨大困難。相關研究證實，豬鏈球菌還可產生多種毒力因子，有助于其在宿主體內感染和定植［13］。Rocker等［14］的研究表明，TA結構是調節(jié)細菌生理學的關鍵參與者，毒素激活后可通過干擾重要的細胞過程來誘導細胞停滯或程序性細胞死亡。TA結構還可以調節(jié)生物膜的形成、增加病原菌的毒力和增強病原體在宿主體內的存活率，與細菌的致病性緊密相關［15］。經過分析，在ICESsuSC124上存在的TA結構與先前的報道［14］同源，這提示豬鏈球菌中的ICEs所攜帶的遺傳物質對宿主具有潛在的危害。此外，ΦSsuSC124還含有穿孔素蛋白（holin）基因，Shi等［16］的研究揭示豬鏈球菌前噬菌體的穿孔素可以裂解多種革蘭陽性細菌，比裂解酶的裂解普更廣，且更容易靶向金黃色葡萄球菌的膜。通過對基因組的遺傳環(huán)境分析和環(huán)狀中間體活性驗證，發(fā)現ΦSsuSC124不僅能整合到細菌的染色體上，而且能形成游離的、有活性的前噬菌體；雖然ΦSsuSC124的不同存在形式未對豬鏈球菌SC124菌株的正常生長造成影響，但仍需要引起人們的關注。

通過對豬鏈球菌TZ080501菌株、SC070731菌株和SC124菌株的基因組進行分析，發(fā)現它們的ICE和前噬菌體的兩端均存在相似的8 bp不完全重復序列。有趣的是，盡管TZ080501菌株的串聯遺傳元件形式為Prophage_ICE，SC070731菌株和SC124菌株的串聯遺傳元件形式為ICE_Prophage，它們的插入位點不會因串聯遺傳元件的順序不同而有所不同，且這些不完全重復的序列與文獻［6］報道的一致。通過接合試驗和環(huán)狀中間體PCR擴增等方法，證實了ICESsuSC124可發(fā)生轉移，賦予受體菌四環(huán)素抗性。ICESsuSC124的轉移表明，豬鏈球菌中耐藥基因轉移的方式多樣化，這對遏制豬鏈球菌形成新的耐藥機制和致病機制造成了極大的困難。因未檢測到前噬菌體發(fā)生轉移，參照文獻［6］中的方法，在獲得含有ICESsuSC124的接合子后，以SC124菌株為供體菌，接合子BAA+ICESsuSC124為受體菌，再次進行接合試驗。經過多次試驗后，未在相應的篩選培養(yǎng)基上獲得含有前噬菌體的接合子，表明SC124菌株的ΦSsuSC124未能整合到受體菌中，與文獻［6］中報道的結果有所不同，這預示著豬鏈球菌SC124菌株中存在的ΦSsuSC124整合機制更加保守/復雜，有待進一步探究。

有研究表明，細菌產生耐藥性往往伴隨著適應性代價的產生［17］，耐藥性的適應性代價對細菌耐藥性進化軌跡有一定的預測作用［18］。因此，監(jiān)測細菌的耐藥性適應性代價對控制耐藥危機具有重要的意義。本研究通過競爭試驗，證實了接合子BAA+ICESsuSC124具有一定程度的適應性代價。在連續(xù)傳代過程中，雖然接合子的比例整體呈下降趨勢，但并非持續(xù)性下降；適應性代價的存在使得減少抗生素的使用會導致耐藥菌株的減少，但值得注意的是，耐藥菌也可通過進化恢復其適應性，從而產生補償性進化的過程［19］，這增加了人們想要利用適應性代價逆轉細菌耐藥性的產生與傳播的困難。

4 結 論

豬鏈球菌SC124中發(fā)現的ICE_Prophage可攜帶耐藥基因和Zeta毒素-抗毒素等結構；ICESsuSC124可通過接合試驗發(fā)生水平轉移；藥敏結果顯示ICESsuSC124的轉移賦予了受體菌四環(huán)素的耐藥表型，增大了細菌獲得耐藥性和致病性的風險；競爭試驗結果表明含有ICESsuSC124的接合子存在一定程度的適應性代價，監(jiān)測細菌的耐藥性適應性代價對控制耐藥危機具有重要的意義。

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（編輯 白永平）