摘要 建立了一種以金、鉑納米粒子修飾的金屬有機(jī)框架材料（MAP）為標(biāo)記物的降鈣素原（Procalcitonin，PCT）快速定量免疫層析檢測(cè)方法。本方法以靜電吸附法制備的MAP-抗PCT 單克隆抗體偶聯(lián)物為檢測(cè)探針，將抗PCT 多克隆抗體和羊抗鼠IgG 分別噴涂硝酸纖維素（NC）膜構(gòu)建試紙條的檢測(cè)線和質(zhì)控線，采用基于信號(hào)放大的夾心免疫法定量檢測(cè)PCT。結(jié)果表明， MAP 免疫層析試紙條具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，利用其檢測(cè)PCT 的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍為0.61 pg/mL～320 ng/mL，檢出限為0.25 pg/mL，日內(nèi)和日間精密度（RSD）均小于15%。實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果表明，本方法僅需微量樣本即可檢測(cè)全血中PCT 的濃度，對(duì)于炎癥反應(yīng)的早期診斷、監(jiān)測(cè)治療及預(yù)后判斷具有重要意義。

關(guān)鍵詞 側(cè)流免疫層析法；降鈣素原；快速檢測(cè)；納米酶

生物標(biāo)志物的高靈敏和快速檢測(cè)對(duì)于疾病診斷具有重要意義。目前，生物標(biāo)志物的臨床檢測(cè)方法主要為儀器分析法，具有檢測(cè)靈敏度高、可自動(dòng)化以及適合高通量檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)[1]。但是，儀器分析法通常需要大型儀器設(shè)備，價(jià)格昂貴、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，難以滿足欠發(fā)達(dá)地區(qū)對(duì)生物標(biāo)志物快速檢測(cè)的需求，也無(wú)法用于家庭自檢[2]。免疫層析試紙條法（Lateral flow immunoassay， LFIA）具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)結(jié)果直觀、耗時(shí)少以及成本低等優(yōu)點(diǎn)[3]，適于大規(guī)?？焖俸Y查，是目前發(fā)展最快的一種即時(shí)診斷方法。

金納米顆粒（Au nanoparticles， AuNPs）基于局域表面等離子體共振效應(yīng)可產(chǎn)生鮮艷的顏色，因而被廣泛用作LFIA 方法的信號(hào)探針。然而，傳統(tǒng)的30～40 nm AuNPs 探針因摩爾消光系數(shù)較低、顏色信號(hào)偏弱，用于試紙條檢測(cè)時(shí)靈敏度有限，無(wú)法滿足痕量待測(cè)物以及微量樣本的檢測(cè)需求。基于AuNPs 有序組裝的信號(hào)放大策略可有效提高試紙條的檢測(cè)靈敏度。該策略通常利用鏈霉親和素-生物素[4]、互補(bǔ)核酸鏈[5]或抗原與抗體間[6]的特異性結(jié)合使更多的AuNPs 在檢測(cè)線（T 線）區(qū)域二次富集，從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)放大。然而，該策略雖然可將試紙條檢測(cè)靈敏度提升1～2 個(gè)數(shù)量級(jí)，但因二次富集效率存在差異，易導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果變異系數(shù)變大。將大量AuNPs 負(fù)載至大粒徑載體（細(xì)菌[7]、碳納米管[8]和一維硅納米棒[9]等）上以增強(qiáng)探針顏色信號(hào)的強(qiáng)度，也是提高試紙條檢測(cè)靈敏度的有效策略。但是，當(dāng)所用載體粒徑過(guò)大時(shí)，其遷移速率變慢，這將帶來(lái)探針在T 線上非特異性駐留的風(fēng)險(xiǎn)，從而使假陽(yáng)性結(jié)果的可能性增加。此外，使用熒光微球、染料聚苯乙烯微球[10]以及磁性熒光微球[11]等探針也可提高試紙條的檢測(cè)靈敏度，但通常只能提高一個(gè)數(shù)量級(jí)左右。

酶催化信號(hào)放大是一種被廣泛應(yīng)用于提高各類分析方法靈敏度的有效策略[12]。Zhang 等[13]以辣根過(guò)氧化物酶（Horseradish peroxidase， HRP）和抗體共標(biāo)記AuNPs 作為L(zhǎng)FIA 探針，利用HRP 的高催化活性催化底物顯色，從而提高了試紙條的檢測(cè)靈敏度。但是， HRP 等天然酶的催化活性高度依賴于蛋白質(zhì)的構(gòu)象，易受溫度、pH 值和離子強(qiáng)度等環(huán)境因素的影響[14]，從而限制了基于天然酶的信號(hào)探針在檢測(cè)中的應(yīng)用。納米酶是一類具有類天然酶活性的納米材料[15]，與天然酶相比具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、環(huán)境耐受性強(qiáng)、成本低以及長(zhǎng)期穩(wěn)定性好等優(yōu)勢(shì)[16]。相比于大部分金屬基納米酶，鉑納米粒子（Platinumnanoparticles， PtNPs）具有更優(yōu)越且穩(wěn)定的類過(guò)氧化物酶（POD）催化活性，通過(guò)調(diào)控PtNPs 的尺寸、形貌、晶面和組成成分等可進(jìn)一步增強(qiáng)其催化活性[17]。就尺寸因素而言，小粒徑的PtNPs 具有更大的比表面積，因此更容易暴露催化活性位點(diǎn)，從而具有更高的催化活性。但是，小粒徑PtNPs 在使用過(guò)程中因表面能過(guò)高而易發(fā)生團(tuán)聚，導(dǎo)致催化活性下降[18]。將小粒徑PtNPs 固定在多孔納米材料的表面或孔隙中，理論上可以改善其分散性，獲得穩(wěn)定的高催化活性。金屬有機(jī)框架材料（Metal-organic frameworks，MOFs）是一類以金屬離子或金屬團(tuán)簇為節(jié)點(diǎn)，與有機(jī)配體自組裝形成的多孔材料[19]，具有高比表面積、可調(diào)節(jié)的孔徑、可調(diào)控的化學(xué)成分和嚴(yán)格定義的金屬節(jié)點(diǎn)，因而可作為限域負(fù)載或原位生長(zhǎng)納米材料的優(yōu)良載體[20-21]。

降鈣素原（Procalcitonin， PCT）是血清降鈣素的前體肽[22]，被認(rèn)為是診斷和檢測(cè)細(xì)菌感染的理想生物標(biāo)志物[23]。準(zhǔn)確測(cè)定血液中的PCT 濃度對(duì)于輔助診斷細(xì)菌性感染具有重要意義[24]。在健康人血液中，PCT 濃度一般低于0.1 ng/mL[25-26]；當(dāng)血液中PCT 的濃度大于0.5 ng/mL 時(shí)，患者發(fā)生嚴(yán)重?cái)⊙Y或敗血性休克的風(fēng)險(xiǎn)大大增加[27-28]。受限于檢測(cè)靈敏度，采用常規(guī)膠體金試紙條檢測(cè)PCT 時(shí)，通常需要靜脈穿刺采血獲得足夠量的樣本[29]，而對(duì)于難以進(jìn)行靜脈穿刺的人群，例如嬰幼兒及老年患者，樣本收集存在一定困難。本研究以鋯基金屬有機(jī)框架納米材料（Zr-MOF）[30]為載體，通過(guò)在MOF 上原位生長(zhǎng)AuNPs 獲得具有強(qiáng)比色信號(hào)的MOF@AuNPs 納米復(fù)合物（MA）；在MA 上繼續(xù)生長(zhǎng)PtNPs，獲得了具有高類POD活性的MOF@AuNP@PtNPs 復(fù)合物（MAPs）。考察了以MAPs 為探針的LFIA（MAP-LFIA）對(duì)PCT 的檢測(cè)性能。由于MAPs 不僅具有較強(qiáng)的比色信號(hào)，還具有非常高的類POD 活性，因此通過(guò)酶催化信號(hào)放大可以實(shí)現(xiàn)PCT 的靈敏檢測(cè)。本研究開發(fā)的MAP-LFIA 可快速、超靈敏定量檢測(cè)稀釋后血樣中的痕量PCT，對(duì)嬰幼兒及老年患者僅需從足底或指部獲取微量血樣（2 μL）即可滿足檢測(cè)需求。