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        液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)甲基化和乙?;揎椀慕M蛋白H3 及其在表觀遺傳藥物評(píng)估中的應(yīng)用

        2024-09-05 00:00:00史欽鋆瞿敏敏李治馬波陳佳徐斌徐華謝劍煒
        分析化學(xué) 2024年6期
        關(guān)鍵詞:串聯(lián)質(zhì)譜液相色譜乙?;?/a>

        摘要 基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(Liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS),采用三重四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)選擇離子監(jiān)測(cè)(Multiple reaction monitoring, MRM)模式,應(yīng)用自下而上的蛋白分析策略,對(duì)細(xì)胞組蛋白H3 N 端的常見(jiàn)甲基化和乙酰化修飾位點(diǎn)及表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。將本方法應(yīng)用于28 種表觀遺傳藥物引起的細(xì)胞組蛋白H3 修飾變化的檢測(cè),結(jié)果表明,其中25 種藥物(包括去乙?;敢种苿〢bexinostat、Valproic acid 和AGK7 等)暴露HepG2 細(xì)胞24 h 后誘導(dǎo)的組蛋白H3 修飾變化與其已報(bào)道的生物活性一致,同時(shí)也可檢測(cè)到其它修飾變化;其余3 種藥物,包括去甲基化酶抑制劑IOX1、GSK-j1 和乙?;D(zhuǎn)移酶抑制劑L002,在暴露細(xì)胞后僅檢測(cè)到與已報(bào)道活性不同的修飾變化;總體檢測(cè)吻合率達(dá)到89.3%。本方法能通量化定量分析組蛋白H3 修飾位點(diǎn)及其變化,具有特異性好和修飾信息豐富等優(yōu)勢(shì),有望為表觀遺傳活性化合物的篩選評(píng)估及作用機(jī)制探討提供新的技術(shù)工具。

        關(guān)鍵詞 表觀遺傳藥物;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;組蛋白;甲基化;乙?;?/p>

        組蛋白的表觀遺傳修飾對(duì)于相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展具有重要作用,其中,組蛋白H3 在染色質(zhì)組裝和基因表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[1-4]。目前研究最廣的組蛋白H3 表觀遺傳修飾類(lèi)型為乙?;图谆?。組蛋白賴氨酸位點(diǎn)的乙?;腿ヒ阴;ǔ7謩e由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(Histone acetyltransferase,HATs)和組蛋白去乙?;福℉istone deacetylase, HDACs)介導(dǎo)[5]。一般認(rèn)為,組蛋白的乙酰化有利于DNA 與組蛋白八聚體解離,可促使核小體結(jié)構(gòu)松弛,從而使轉(zhuǎn)錄因子與DNA 結(jié)合位點(diǎn)特異結(jié)合,進(jìn)而激活基因轉(zhuǎn)錄,而組蛋白的去乙酰化則發(fā)揮相反的作用。研究表明,組蛋白乙?;赡馨l(fā)揮更復(fù)雜的作用,如影響表觀記憶[6]、細(xì)胞周期調(diào)控[7]、干細(xì)胞分化[8]和細(xì)胞應(yīng)激應(yīng)答[9]等,與癌癥等疾病密切相關(guān)。與乙?;?lèi)似,組蛋白的甲基化狀態(tài)由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(Histone methyltransferase, HMTs)和組蛋白去甲基化酶(Histone demethylases, HDMS)調(diào)控。組蛋白甲基化可通過(guò)改變組蛋白和DNA 的結(jié)合構(gòu)象以及通過(guò)招募蛋白質(zhì)復(fù)合物,參與細(xì)胞分化和發(fā)育[10]、基因沉默[11]和轉(zhuǎn)基因抑制[12]等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程,在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13-14]。

        表觀遺傳的異常改變與腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關(guān)聯(lián)性研究促進(jìn)了抗癌靶向表觀遺傳療法的發(fā)展[15-16]。在臨床實(shí)踐中,表觀遺傳藥物既可單獨(dú)使用,也可與傳統(tǒng)抗癌藥聯(lián)用,在提高療效的同時(shí)也極大地降低了傳統(tǒng)抗癌藥的毒副作用[17]。近20 年來(lái),組蛋白去乙酰化酶抑制劑被廣泛用于抗癌治療,如伏立諾他(Vorinostat)和羅米地辛(Romidepsin)用于治療皮膚T 細(xì)胞淋巴瘤,羅米地辛和貝利司他(Belinostat)用于治療外周T 細(xì)胞淋巴瘤,帕比司他(Panobinostat)和地塞米松(Dexamethasone)聯(lián)合用于治療多發(fā)性骨髓瘤[18]。越來(lái)越多的研究表明,表觀遺傳效應(yīng)的調(diào)控在抗癌治療中發(fā)揮了重要作用,因此表觀遺傳藥物的研發(fā)備受關(guān)注,例如, Epizyme 公司的EZH2 抑制劑他澤司他(Tazemetostat)在不到6 個(gè)月的時(shí)間內(nèi)即獲得FDA 的二次批準(zhǔn)[19]。然而,表觀遺傳藥物的篩選目前仍面臨諸多制約因素,尤其是針對(duì)復(fù)雜多變的組蛋白表觀遺傳調(diào)控靶點(diǎn),尚缺乏有效的通量篩查檢測(cè)技術(shù)。

        目前,針對(duì)組蛋白修飾的檢測(cè)技術(shù)主要有染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)技術(shù)和高內(nèi)涵篩選(High-content screening, HCS)技術(shù)。ChIP 技術(shù)被廣泛應(yīng)用于研究轉(zhuǎn)錄因子與組蛋白修飾之間的相互作用,具有分辨率高、可定量和全基因組分析的能力[20],但不適用于高通量篩選。HCS技術(shù)具有可進(jìn)行細(xì)胞多參數(shù)分析和高通量篩選[21]的優(yōu)勢(shì),但無(wú)法對(duì)組蛋白翻譯后修飾(Post-translationalmodifications, PTMs)進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。上述兩種方法均受限于抗體的使用,而抗體存在批次之間差異和親和力差異等問(wèn)題[22-23],尤其是其檢測(cè)結(jié)果易受相鄰PTMs 的干擾[24]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Liquidchromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)技術(shù)具有高分辨率和高靈敏度,能夠高通量鑒定多種類(lèi)型的修飾,并可實(shí)現(xiàn)對(duì)低濃度修飾的準(zhǔn)確定量分析,已成為蛋白修飾檢測(cè)的常用技術(shù)。與ChIP 和HCS 技術(shù)相比, LC-MS/MS 無(wú)需使用抗體,能夠高通量發(fā)現(xiàn)和定量分析多種已知或未知修飾,是研究復(fù)雜修飾網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機(jī)制的有力工具。

        本研究建立了針對(duì)組蛋白H3 N 端1–40 位氨基酸肽段的LC-MS/MS 定量分析方法,并評(píng)估了涵蓋4 類(lèi)表觀遺傳修飾調(diào)控酶的28 種抑制劑所誘導(dǎo)的組蛋白H3 修飾變化。組蛋白H3 的N 端序列經(jīng)胰蛋白酶酶切后可獲得4 種肽段序列(圖1),包括39 個(gè)甲基化和乙酰化修飾組合(電子版文后支持信息表S1)。采用所建立的LC-MS/MS 定量方法在多反應(yīng)選擇離子監(jiān)測(cè)(Multiple reaction monitoring, MRM)模式下可同時(shí)檢測(cè)39 條靶標(biāo)肽段序列,具有靈敏度高和特異性好的優(yōu)勢(shì),可為表觀遺傳活性藥物的篩選評(píng)估提供新的技術(shù)支持。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 儀器與試劑

        Q-TRAP 5500 型三重四極桿-離子肼串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)AB Sciex 公司);ACQUITY 型超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters 公司);CO2 培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo-Fisher 公司);恒溫振蕩水浴(瑞士Gingko 公司);Milli-Q A10 型水凈化系統(tǒng)(美國(guó)Millipore 公司);CKX41 倒置顯微鏡(日本Olympus 公司);3k30高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma-Aldrich 公司)。C18 膜(上海安譜科學(xué)儀器有限公司);15 cm 培養(yǎng)皿(美國(guó)Corning 公司)。

        H3 經(jīng)胰蛋白酶酶解后的靶標(biāo)肽段以及穩(wěn)定同位素標(biāo)記的靶標(biāo)肽段(電子版文后支持信息表S1)購(gòu)自生物工程股份有限公司(上海);28 種表觀遺傳藥物,其中, NSC694621 購(gòu)自源葉生物科技有限公司(上海), AGK7 購(gòu)自陶素生化科技有限公司(上海),其余均購(gòu)自美國(guó)MedChemexpress 生物科技公司(電子版文后支持信息表S2);乙腈(色譜級(jí),百靈威科技有限公司(北京));甲酸(純度98%,美國(guó)Sigma-Aldrich 公司);二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)、濃H2SO4、NH4HCO3、濃氨水(NH3H2O)、三氯乙酸、丙酮和醋酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);丙酸酐(伊諾凱科技有限公司)。所用試劑均為分析純或以上純度。杜氏改良伊戈?duì)柵囵B(yǎng)基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium, DMEM)及胎牛血清(FetalBovine Serum, FBS)(美國(guó)賽默飛世爾科技公司);測(cè)序級(jí)胰蛋白酶(普洛麥格公司);胰酶消化液(凱基生物技術(shù)有限公司);細(xì)胞核提取試劑盒(索萊寶生物科技有限公司;10×磷酸鹽緩沖液干粉(Phosphatebuffer solution, PBS,酷來(lái)搏科技有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q A10 型水凈化系統(tǒng)制備的超純水并經(jīng)高溫滅菌。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與染毒處理

        HepG2 細(xì)胞置于15 cm 培養(yǎng)皿中,每皿加入20 mL 含10%胎牛血清及100 U/mL 青鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基溶液,于37 ℃、5% CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%密度后,吸除培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液,用無(wú)血清的培養(yǎng)基漂洗細(xì)胞2 次后進(jìn)行給藥處理。給藥組用DMSO 稀釋配制成系列表觀遺傳藥物溶液(0.01 mol/L),取10 μL 繼續(xù)用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至10 μmol/L 工作濃度;另平行設(shè)立0.1% DMSO 對(duì)照組。各皿細(xì)胞經(jīng)處理后,繼續(xù)于37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育24 h。

        1.2.2 組蛋白的提取

        按照使用說(shuō)明,采用細(xì)胞核提取試劑盒分離HepG2 細(xì)胞(約2×107 個(gè))的細(xì)胞核,然后加入400 μLH2SO4(0.2 mol/L)混勻[25], 4 ℃振蕩過(guò)夜后, 16000 r/min 離心10 min, 取上清液至1.5 mL 離心管中。逐滴加入132 μL 100%三氯乙酸沉淀組蛋白,用預(yù)冷的丙酮將組蛋白洗滌2 次,以去除殘留的三氯乙酸,于通風(fēng)櫥中干燥。將組蛋白溶解于30 μL NH4HCO3 溶液(50 mmol/L)中,備用。

        1.2.3 組蛋白H3丙酰化及胰酶酶解

        將15 μL 丙?;噭26](丙酸酐異-丙醇(3∶1, V/V)溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用)加入30 μL 組蛋白H3 樣品中,渦旋振蕩混勻, 51 ℃孵育20 min,真空離心濃縮至10 μL,用超純水重新溶解至30 μL,以濃氨水調(diào)節(jié)至pH=8.0;重復(fù)加入15 μL 丙酰化試劑,渦旋離心, 51 ℃孵育20 min, 真空離心濃縮至10 μL, 用超純水重新溶解至30 μL, 以濃氨水調(diào)節(jié)至pH=8.0;按照酶與底物質(zhì)量比為1∶10~1∶30 的比例加入測(cè)序級(jí)胰蛋白酶,于37 ℃水浴酶切, 6~10 h 后加入20%醋酸終止酶切反應(yīng),真空離心濃縮至10 μL;重復(fù)一次丙酰化反應(yīng)。酶解后的組蛋白H3 肽段及修飾情況見(jiàn)電子版文后支持信息表S1。

        1.2.4 肽段脫鹽

        將直徑約為1.5 mm 的C18 膜填裝入300 μL 規(guī)格的移液槍頭中[27],組裝成C18 槍頭;用20 μL 含0.5%甲酸的80%乙腈潤(rùn)濕, 20 μL 0.5%甲酸平衡,在1000 r/min 條件下離心1 min;樣品加入酶切后進(jìn)行上樣,相同條件下離心后再加入20 μL 0.5%甲酸潤(rùn)洗,棄去潤(rùn)洗液;加入20 μL 含0.5%甲酸的80%乙腈進(jìn)行洗脫,收集洗脫液,于55 ℃真空離心濃縮干燥。

        1.2.5 待測(cè)樣品的制備

        將干燥后的樣品用45 μL 0.1%甲酸溶液重新溶解,加入5 μL 混合同位素內(nèi)標(biāo)(IS)溶液, 14000 r/min離心10 min, 轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶中。加入混合IS 肽段至其終濃度分別為:a*, 50 ng/mL;b*, 10 ng/mL;c*, 10 ng/mL;K9*, 20 ng/mL。

        另配制含8 個(gè)濃度梯度的H3 靶標(biāo)肽段混合標(biāo)準(zhǔn)溶液std1~std8(std1~std8 中各組肽段對(duì)應(yīng)濃度分別為, H3-a:2.5、5、10、25、50、100、250 和500 ng/mL;H3-b:10、20、40、100、200、400、1000 和2000 ng/mL;H3-c:10、20、40、100、200、400、1000 和2000 ng/mL;H3-k9:1、2、4、10、20、40、100 和200 ng/mL),分別加入IS 肽段使其終濃度為:a*, 50 ng/mL;b*, 10 ng/mL;c*, 10 ng/mL;K9*, 20 ng/mL。

        同時(shí)設(shè)4 個(gè)質(zhì)控樣品,分別為高濃度HQC、中濃度MQC、低濃度LQC 和定量下限LOQ。HQC 溶液由80 μL std-8 溶液加入20 μL 超純水稀釋獲得;MQC、LQC 和LOQ 分別為std-5、std-2 和std-1 按相同方法稀釋配制而成。

        1.2.6 組蛋白H3肽段的LC-MS/MS檢測(cè)

        色譜分離條件ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm),柱溫40 ℃;流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液,流動(dòng)相B 為乙腈;流速0.25 mL/min;進(jìn)樣體積10 μL。梯度洗脫:0~1 min, 1% B;1~20 min, 16% B;20~30 min, 16%~50% B;30~35 min, 50%~1% B。

        MS 條件電噴霧離子源, 正離子檢測(cè)模式和MRM 質(zhì)譜掃描模式;離子源溫度:500 ℃;輔助加熱干燥氣GS2 60 psi;霧化氣GS1 40 psi(1 psi=6.895 kPa);噴霧電壓5.5 kV。H3 肽段標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)電子版文后支持信息表S3。數(shù)據(jù)采集分析軟件為AB Sciex Analyst 1.5 Software。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 液相色譜及質(zhì)譜方法的優(yōu)化

        在流動(dòng)相中加入甲酸能提高酶解肽段在質(zhì)譜中的離子化效率,并有助于保護(hù)肽段的完整性及減少背景信號(hào)等干擾??疾炝瞬煌姿釢舛认碌碾亩雾憫?yīng),最終確定甲酸終濃度為0.1%。此外, ACQUITYUPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)色譜柱對(duì)肽段的分離效果和穩(wěn)定性均較好,故將其用于組蛋白修飾肽段的分析。

        在ESI 正離子模式下,肽段帶正電荷,在質(zhì)譜中易于形成穩(wěn)定的離子,本研究選擇正離子模式進(jìn)行質(zhì)譜分析方法的建立和優(yōu)化。采用全掃描和子離子掃描模式依次對(duì)39 種組蛋白肽段標(biāo)準(zhǔn)品和4 種IS 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行監(jiān)測(cè)以確定母離子和子離子,并選擇豐度最高者作為定量離子對(duì)。同時(shí),對(duì)霧化氣、輔助加熱干燥氣等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,以期提升MRM 掃描的靈敏度和穩(wěn)定性,使方法更適用于多種組蛋白肽段的同時(shí)分析。最終確定了可用于39 種靶分析物及4 種IS 的最適參數(shù):以氮?dú)鉃楦稍餁?,離子源溫度為500 ℃,霧化氣GS1 40 psi,輔助加熱干燥氣GS2 60 psi,噴霧電壓為5.5 kV。各肽段監(jiān)測(cè)離子對(duì)及其碰撞電壓等參數(shù)詳見(jiàn)電子版文后支持信息表S3。

        2.2 方法學(xué)考察

        采用所建立的方法對(duì)H3-a、H3-K9、H3-b 和H3-c 系列肽段進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,系列肽段在空白細(xì)胞中的檢出限分別為2.5、1.0、10.0 和10.0 ng/mL,線性范圍分別為2.5~500 ng/mL、1~200 ng/mL、10~2000 ng/mL 和10~2000 ng/mL。每種肽段在各自濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(電子版文后支持信息表S4)。

        在連續(xù)3 個(gè)分析日內(nèi)采用本方法對(duì)4 個(gè)濃度水平的質(zhì)控溶液進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明,其日間和日內(nèi)準(zhǔn)確度均在85%~115%之內(nèi),而精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于15%,表明本方法具有良好的日內(nèi)和日間準(zhǔn)確度及精密度。

        2.3 數(shù)據(jù)處理

        酶解后的肽段含有多種修飾組合(圖2A),而同種修飾可能出現(xiàn)在多條檢測(cè)靶標(biāo)肽段上,例如組蛋白H3 的9 位賴氨酸乙?;↘9Ac)會(huì)同時(shí)出現(xiàn)在肽段K(Ac)STGGKAPR 和K(Ac)STGGK(Ac)APR(圖2B)中,因此,在本研究中,某特定修飾的豐度按其在所有修飾肽段中的含量之和進(jìn)行計(jì)算,并統(tǒng)一以整體含量相對(duì)穩(wěn)定的未修飾原始肽段進(jìn)行校正,例如,上述K9Ac 修飾的豐度按公式[K(Ac)STGGKAPR+K(Ac)STGGK(Ac)APR]/KSTGGKAPR 進(jìn)行計(jì)算。實(shí)驗(yàn)至少平行重復(fù)3 次,結(jié)果以平均值表示,當(dāng)實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組相差1.25 倍時(shí),認(rèn)為存在顯著性差異。

        2.4 表觀遺傳活性藥物引起的細(xì)胞組蛋白H3 甲基化和乙酰化修飾譜

        采用LC-MS/MS 方法定量檢測(cè)經(jīng)28 種表觀遺傳活性藥物暴露后的細(xì)胞組蛋白H3 的表觀遺傳修飾變化,結(jié)果表明, 25 種藥物引起的顯著性肽段修飾變化與其生物活性相符(表1 中加粗部分),檢測(cè)匹配度達(dá)89.3%;在17種甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑/去甲基化酶抑制劑中,除IOX1和GSK-j1外,有15種檢測(cè)結(jié)果符合已知報(bào)道(見(jiàn)電子版文后支持信息表S2);在11 種乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑/去乙?;敢种苿┲?,除L002 外,其它10種檢測(cè)結(jié)果符合已知報(bào)道(見(jiàn)電子版文后支持信息表S2)。圖3為4種類(lèi)型抑制劑的代表性檢測(cè)譜圖。此外,有19種抑制劑除了已知的修飾變化外,還檢出其它顯著性修飾變化;而IOXI、GSK-jl和L002(圖4)這3種藥物僅能檢測(cè)到已報(bào)道生物活性外的修飾變化。引起上述檢測(cè)結(jié)果差異的原因如下:(1)文獻(xiàn)報(bào)道的組蛋白修飾多基于抗體檢測(cè),而特定抗體僅能檢測(cè)特定的修飾位點(diǎn),即為“一對(duì)一”的檢測(cè)模式,而質(zhì)譜方法可同時(shí)通量檢測(cè)多種修飾,并可提供更豐富的修飾信息;(2)抗體存在交叉反應(yīng)性,同種類(lèi)型的修飾易干擾抗體檢測(cè)而產(chǎn)生假陽(yáng)性;(3)藥物引起的組蛋白甲基化和乙?;揎?,可能伴隨有磷酸化和泛素化等其它修飾,因此采用本方法未能檢出。

        以Seclidemstat為例,其暴露HepG2細(xì)胞后可檢測(cè)到預(yù)期的H3K4Mel表達(dá)水平升高,同時(shí)也檢測(cè)到H3K9Mel/Me3等修飾的顯著升高。研究表明,Seclidemstat是一種有效的非競(jìng)爭(zhēng)性可逆KDMIA(LSDl)抑制劑,可調(diào)控組蛋白H3的K4和K9位點(diǎn)的甲基化,促進(jìn)SWI/SNF復(fù)合物突變卵巢癌的抗腫瘤免疫,并抑制病毒產(chǎn)生、病毒DNA復(fù)制和晚期基因表達(dá),因此認(rèn)為檢測(cè)到H3K9甲基化修飾升高具有合理性。以Tazemetostat為例,其可通過(guò)抑制KMT酶活性下調(diào)H3K27甲基化以發(fā)揮抗腫瘤作用,而本研究檢測(cè)到其暴露細(xì)胞后導(dǎo)致H3K27Me3下降,而H3K27Me3能夠抑制基因的表達(dá),是基因沉默的重要標(biāo)志,其在多種腫瘤中異常表達(dá),表明檢測(cè)結(jié)果與化合物調(diào)控活性相符;同時(shí)還觀察到H3K4Mel豐度也呈現(xiàn)下降趨勢(shì),而H3K4Mel是增強(qiáng)子特異修飾,為其激活靶基因轉(zhuǎn)錄所必需。與H3K4Mel結(jié)合的DNA在正常細(xì)胞中呈現(xiàn)低甲基化水平,但在腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高甲基化水平,因此暴露于Seclidemstat和Tazemetostat的細(xì)胞均檢測(cè)到H3K4Mel表達(dá)水平的相應(yīng)變化,表明這兩種藥物用于治療的腫瘤類(lèi)型可能存在不同的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制。

        以L002為例,其為一種可逆的乙酰轉(zhuǎn)移酶p300(KAT3B)的有效抑制劑,通過(guò)抑制組蛋白乙?;瘉?lái)阻止STAT3 活化,對(duì)經(jīng)其暴露后的細(xì)胞樣本進(jìn)行檢測(cè),未發(fā)現(xiàn)H3K9Ac 水平下降,但觀察到H3K23Ac 明顯下降。近年的研究表明, H3K23Ac 除了以往認(rèn)為的具有基因表達(dá)調(diào)控、增強(qiáng)子活性、DNA 修復(fù)和穩(wěn)定性等作用外,還在神經(jīng)元的發(fā)育和功能中起著重要作用,可參與調(diào)控神經(jīng)元相關(guān)基因的表達(dá),影響神經(jīng)元的分化、連接和功能[35]。另有研究表明, L002 可改善高血壓相關(guān)的心腎纖維化[36]、逆轉(zhuǎn)高血壓誘發(fā)的心臟纖維化[37]等。因此,本研究結(jié)果可為L(zhǎng)002 作用機(jī)制的深入探討提供新的線索。

        3 結(jié)論

        建立了組蛋白H3 常見(jiàn)甲基化和乙?;揎椀腖C-MS/MS 通量檢測(cè)方法,并將其用于表征表觀遺傳藥物暴露誘導(dǎo)的細(xì)胞組蛋白H3 表觀遺傳修飾位點(diǎn)及其表達(dá)水平的變化。本方法具有靈敏度高、特異性好、定量分析準(zhǔn)確和可通量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn),為表觀遺傳活性化合物的篩選評(píng)估及其潛在作用位點(diǎn)和機(jī)制探討等提供了新的技術(shù)工具。

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