摘要 基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（Liquid chromatography tandem mass spectrometry， LC-MS/MS），采用三重四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)選擇離子監(jiān)測(cè)（Multiple reaction monitoring， MRM）模式，應(yīng)用自下而上的蛋白分析策略，對(duì)細(xì)胞組蛋白H3 N 端的常見(jiàn)甲基化和乙酰化修飾位點(diǎn)及表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。將本方法應(yīng)用于28 種表觀遺傳藥物引起的細(xì)胞組蛋白H3 修飾變化的檢測(cè)，結(jié)果表明，其中25 種藥物（包括去乙?；敢种苿〢bexinostat、Valproic acid 和AGK7 等）暴露HepG2 細(xì)胞24 h 后誘導(dǎo)的組蛋白H3 修飾變化與其已報(bào)道的生物活性一致，同時(shí)也可檢測(cè)到其它修飾變化；其余3 種藥物，包括去甲基化酶抑制劑IOX1、GSK-j1 和乙?；D(zhuǎn)移酶抑制劑L002，在暴露細(xì)胞后僅檢測(cè)到與已報(bào)道活性不同的修飾變化；總體檢測(cè)吻合率達(dá)到89.3%。本方法能通量化定量分析組蛋白H3 修飾位點(diǎn)及其變化，具有特異性好和修飾信息豐富等優(yōu)勢(shì)，有望為表觀遺傳活性化合物的篩選評(píng)估及作用機(jī)制探討提供新的技術(shù)工具。

關(guān)鍵詞 表觀遺傳藥物；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；組蛋白；甲基化；乙?；?/p>

組蛋白的表觀遺傳修飾對(duì)于相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展具有重要作用，其中，組蛋白H3 在染色質(zhì)組裝和基因表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[1-4]。目前研究最廣的組蛋白H3 表觀遺傳修飾類(lèi)型為乙?；图谆?。組蛋白賴氨酸位點(diǎn)的乙?；腿ヒ阴；ǔ７謩e由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（Histone acetyltransferase，HATs）和組蛋白去乙?；福℉istone deacetylase， HDACs）介導(dǎo)[5]。一般認(rèn)為，組蛋白的乙酰化有利于DNA 與組蛋白八聚體解離，可促使核小體結(jié)構(gòu)松弛，從而使轉(zhuǎn)錄因子與DNA 結(jié)合位點(diǎn)特異結(jié)合，進(jìn)而激活基因轉(zhuǎn)錄，而組蛋白的去乙酰化則發(fā)揮相反的作用。研究表明，組蛋白乙?；赡馨l(fā)揮更復(fù)雜的作用，如影響表觀記憶[6]、細(xì)胞周期調(diào)控[7]、干細(xì)胞分化[8]和細(xì)胞應(yīng)激應(yīng)答[9]等，與癌癥等疾病密切相關(guān)。與乙?；?lèi)似，組蛋白的甲基化狀態(tài)由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（Histone methyltransferase， HMTs）和組蛋白去甲基化酶（Histone demethylases， HDMS）調(diào)控。組蛋白甲基化可通過(guò)改變組蛋白和DNA 的結(jié)合構(gòu)象以及通過(guò)招募蛋白質(zhì)復(fù)合物，參與細(xì)胞分化和發(fā)育[10]、基因沉默[11]和轉(zhuǎn)基因抑制[12]等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13-14]。

表觀遺傳的異常改變與腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關(guān)聯(lián)性研究促進(jìn)了抗癌靶向表觀遺傳療法的發(fā)展[15-16]。在臨床實(shí)踐中，表觀遺傳藥物既可單獨(dú)使用，也可與傳統(tǒng)抗癌藥聯(lián)用，在提高療效的同時(shí)也極大地降低了傳統(tǒng)抗癌藥的毒副作用[17]。近20 年來(lái)，組蛋白去乙酰化酶抑制劑被廣泛用于抗癌治療，如伏立諾他（Vorinostat）和羅米地辛（Romidepsin）用于治療皮膚T 細(xì)胞淋巴瘤，羅米地辛和貝利司他（Belinostat）用于治療外周T 細(xì)胞淋巴瘤，帕比司他（Panobinostat）和地塞米松（Dexamethasone）聯(lián)合用于治療多發(fā)性骨髓瘤[18]。越來(lái)越多的研究表明，表觀遺傳效應(yīng)的調(diào)控在抗癌治療中發(fā)揮了重要作用，因此表觀遺傳藥物的研發(fā)備受關(guān)注，例如， Epizyme 公司的EZH2 抑制劑他澤司他（Tazemetostat）在不到6 個(gè)月的時(shí)間內(nèi)即獲得FDA 的二次批準(zhǔn)[19]。然而，表觀遺傳藥物的篩選目前仍面臨諸多制約因素，尤其是針對(duì)復(fù)雜多變的組蛋白表觀遺傳調(diào)控靶點(diǎn)，尚缺乏有效的通量篩查檢測(cè)技術(shù)。

目前，針對(duì)組蛋白修飾的檢測(cè)技術(shù)主要有染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation， ChIP）技術(shù)和高內(nèi)涵篩選（High-content screening， HCS）技術(shù)。ChIP 技術(shù)被廣泛應(yīng)用于研究轉(zhuǎn)錄因子與組蛋白修飾之間的相互作用，具有分辨率高、可定量和全基因組分析的能力[20]，但不適用于高通量篩選。HCS技術(shù)具有可進(jìn)行細(xì)胞多參數(shù)分析和高通量篩選[21]的優(yōu)勢(shì)，但無(wú)法對(duì)組蛋白翻譯后修飾（Post-translationalmodifications， PTMs）進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。上述兩種方法均受限于抗體的使用，而抗體存在批次之間差異和親和力差異等問(wèn)題[22-23]，尤其是其檢測(cè)結(jié)果易受相鄰PTMs 的干擾[24]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Liquidchromatography-tandem mass spectrometry， LC-MS/MS）技術(shù)具有高分辨率和高靈敏度，能夠高通量鑒定多種類(lèi)型的修飾，并可實(shí)現(xiàn)對(duì)低濃度修飾的準(zhǔn)確定量分析，已成為蛋白修飾檢測(cè)的常用技術(shù)。與ChIP 和HCS 技術(shù)相比， LC-MS/MS 無(wú)需使用抗體，能夠高通量發(fā)現(xiàn)和定量分析多種已知或未知修飾，是研究復(fù)雜修飾網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機(jī)制的有力工具。

本研究建立了針對(duì)組蛋白H3 N 端1–40 位氨基酸肽段的LC-MS/MS 定量分析方法，并評(píng)估了涵蓋4 類(lèi)表觀遺傳修飾調(diào)控酶的28 種抑制劑所誘導(dǎo)的組蛋白H3 修飾變化。組蛋白H3 的N 端序列經(jīng)胰蛋白酶酶切后可獲得4 種肽段序列（圖1），包括39 個(gè)甲基化和乙酰化修飾組合（電子版文后支持信息表S1）。采用所建立的LC-MS/MS 定量方法在多反應(yīng)選擇離子監(jiān)測(cè)（Multiple reaction monitoring， MRM）模式下可同時(shí)檢測(cè)39 條靶標(biāo)肽段序列，具有靈敏度高和特異性好的優(yōu)勢(shì)，可為表觀遺傳活性藥物的篩選評(píng)估提供新的技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Q-TRAP 5500 型三重四極桿-離子肼串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)AB Sciex 公司）；ACQUITY 型超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；CO2 培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo-Fisher 公司）；恒溫振蕩水浴（瑞士Gingko 公司）；Milli-Q A10 型水凈化系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）；CKX41 倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；3k30高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）。C18 膜（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）；15 cm 培養(yǎng)皿（美國(guó)Corning 公司）。

H3 經(jīng)胰蛋白酶酶解后的靶標(biāo)肽段以及穩(wěn)定同位素標(biāo)記的靶標(biāo)肽段（電子版文后支持信息表S1）購(gòu)自生物工程股份有限公司（上海）；28 種表觀遺傳藥物，其中， NSC694621 購(gòu)自源葉生物科技有限公司（上海）， AGK7 購(gòu)自陶素生化科技有限公司（上海），其余均購(gòu)自美國(guó)MedChemexpress 生物科技公司（電子版文后支持信息表S2）；乙腈（色譜級(jí)，百靈威科技有限公司（北京））；甲酸（純度98%，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide， DMSO）、濃H2SO4、NH4HCO3、濃氨水（NH3H2O）、三氯乙酸、丙酮和醋酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；丙酸酐（伊諾凱科技有限公司）。所用試劑均為分析純或以上純度。杜氏改良伊戈?duì)柵囵B(yǎng)基（Dulbecco′s Modified Eagle Medium， DMEM）及胎牛血清（FetalBovine Serum， FBS）（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；測(cè)序級(jí)胰蛋白酶（普洛麥格公司）；胰酶消化液（凱基生物技術(shù)有限公司）；細(xì)胞核提取試劑盒（索萊寶生物科技有限公司；10×磷酸鹽緩沖液干粉（Phosphatebuffer solution， PBS，酷來(lái)搏科技有限公司）。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q A10 型水凈化系統(tǒng)制備的超純水并經(jīng)高溫滅菌。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與染毒處理

HepG2 細(xì)胞置于15 cm 培養(yǎng)皿中，每皿加入20 mL 含10%胎牛血清及100 U/mL 青鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基溶液，于37 ℃、5% CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%密度后，吸除培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液，用無(wú)血清的培養(yǎng)基漂洗細(xì)胞2 次后進(jìn)行給藥處理。給藥組用DMSO 稀釋配制成系列表觀遺傳藥物溶液（0.01 mol/L），取10 μL 繼續(xù)用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至10 μmol/L 工作濃度；另平行設(shè)立0.1% DMSO 對(duì)照組。各皿細(xì)胞經(jīng)處理后，繼續(xù)于37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育24 h。

1.2.2 組蛋白的提取

按照使用說(shuō)明，采用細(xì)胞核提取試劑盒分離HepG2 細(xì)胞（約2×107 個(gè)）的細(xì)胞核，然后加入400 μLH2SO4（0.2 mol/L）混勻[25]， 4 ℃振蕩過(guò)夜后， 16000 r/min 離心10 min， 取上清液至1.5 mL 離心管中。逐滴加入132 μL 100%三氯乙酸沉淀組蛋白，用預(yù)冷的丙酮將組蛋白洗滌2 次，以去除殘留的三氯乙酸，于通風(fēng)櫥中干燥。將組蛋白溶解于30 μL NH4HCO3 溶液（50 mmol/L）中，備用。

1.2.3 組蛋白H3丙酰化及胰酶酶解

將15 μL 丙?；噭26]（丙酸酐異-丙醇（3∶1， V/V）溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用）加入30 μL 組蛋白H3 樣品中，渦旋振蕩混勻， 51 ℃孵育20 min，真空離心濃縮至10 μL，用超純水重新溶解至30 μL，以濃氨水調(diào)節(jié)至pH=8.0；重復(fù)加入15 μL 丙酰化試劑，渦旋離心， 51 ℃孵育20 min， 真空離心濃縮至10 μL， 用超純水重新溶解至30 μL， 以濃氨水調(diào)節(jié)至pH=8.0；按照酶與底物質(zhì)量比為1∶10～1∶30 的比例加入測(cè)序級(jí)胰蛋白酶，于37 ℃水浴酶切， 6～10 h 后加入20%醋酸終止酶切反應(yīng)，真空離心濃縮至10 μL；重復(fù)一次丙酰化反應(yīng)。酶解后的組蛋白H3 肽段及修飾情況見(jiàn)電子版文后支持信息表S1。

1.2.4 肽段脫鹽

將直徑約為1.5 mm 的C18 膜填裝入300 μL 規(guī)格的移液槍頭中[27]，組裝成C18 槍頭；用20 μL 含0.5%甲酸的80%乙腈潤(rùn)濕， 20 μL 0.5%甲酸平衡，在1000 r/min 條件下離心1 min；樣品加入酶切后進(jìn)行上樣，相同條件下離心后再加入20 μL 0.5%甲酸潤(rùn)洗，棄去潤(rùn)洗液；加入20 μL 含0.5%甲酸的80%乙腈進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，于55 ℃真空離心濃縮干燥。

1.2.5 待測(cè)樣品的制備

將干燥后的樣品用45 μL 0.1%甲酸溶液重新溶解，加入5 μL 混合同位素內(nèi)標(biāo)（IS）溶液， 14000 r/min離心10 min， 轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶中。加入混合IS 肽段至其終濃度分別為：a*， 50 ng/mL；b*， 10 ng/mL；c*， 10 ng/mL；K9*， 20 ng/mL。

另配制含8 個(gè)濃度梯度的H3 靶標(biāo)肽段混合標(biāo)準(zhǔn)溶液std1～std8（std1～std8 中各組肽段對(duì)應(yīng)濃度分別為， H3-a：2.5、5、10、25、50、100、250 和500 ng/mL；H3-b：10、20、40、100、200、400、1000 和2000 ng/mL；H3-c：10、20、40、100、200、400、1000 和2000 ng/mL；H3-k9：1、2、4、10、20、40、100 和200 ng/mL），分別加入IS 肽段使其終濃度為：a*， 50 ng/mL；b*， 10 ng/mL；c*， 10 ng/mL；K9*， 20 ng/mL。

同時(shí)設(shè)4 個(gè)質(zhì)控樣品，分別為高濃度HQC、中濃度MQC、低濃度LQC 和定量下限LOQ。HQC 溶液由80 μL std-8 溶液加入20 μL 超純水稀釋獲得；MQC、LQC 和LOQ 分別為std-5、std-2 和std-1 按相同方法稀釋配制而成。

1.2.6 組蛋白H3肽段的LC-MS/MS檢測(cè)

色譜分離條件ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm），柱溫40 ℃；流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B 為乙腈；流速0.25 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL。梯度洗脫：0～1 min， 1% B；1～20 min， 16% B；20～30 min， 16%～50% B；30～35 min， 50%～1% B。

MS 條件電噴霧離子源， 正離子檢測(cè)模式和MRM 質(zhì)譜掃描模式；離子源溫度：500 ℃；輔助加熱干燥氣GS2 60 psi；霧化氣GS1 40 psi（1 psi=6.895 kPa）；噴霧電壓5.5 kV。H3 肽段標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)電子版文后支持信息表S3。數(shù)據(jù)采集分析軟件為AB Sciex Analyst 1.5 Software。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜及質(zhì)譜方法的優(yōu)化

在流動(dòng)相中加入甲酸能提高酶解肽段在質(zhì)譜中的離子化效率，并有助于保護(hù)肽段的完整性及減少背景信號(hào)等干擾?？疾炝瞬煌姿釢舛认碌碾亩雾憫?yīng)，最終確定甲酸終濃度為0.1%。此外， ACQUITYUPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm）色譜柱對(duì)肽段的分離效果和穩(wěn)定性均較好，故將其用于組蛋白修飾肽段的分析。

在ESI 正離子模式下，肽段帶正電荷，在質(zhì)譜中易于形成穩(wěn)定的離子，本研究選擇正離子模式進(jìn)行質(zhì)譜分析方法的建立和優(yōu)化。采用全掃描和子離子掃描模式依次對(duì)39 種組蛋白肽段標(biāo)準(zhǔn)品和4 種IS 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行監(jiān)測(cè)以確定母離子和子離子，并選擇豐度最高者作為定量離子對(duì)。同時(shí)，對(duì)霧化氣、輔助加熱干燥氣等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，以期提升MRM 掃描的靈敏度和穩(wěn)定性，使方法更適用于多種組蛋白肽段的同時(shí)分析。最終確定了可用于39 種靶分析物及4 種IS 的最適參數(shù)：以氮?dú)鉃楦稍餁?，離子源溫度為500 ℃，霧化氣GS1 40 psi，輔助加熱干燥氣GS2 60 psi，噴霧電壓為5.5 kV。各肽段監(jiān)測(cè)離子對(duì)及其碰撞電壓等參數(shù)詳見(jiàn)電子版文后支持信息表S3。

2.2 方法學(xué)考察

采用所建立的方法對(duì)H3-a、H3-K9、H3-b 和H3-c 系列肽段進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，系列肽段在空白細(xì)胞中的檢出限分別為2.5、1.0、10.0 和10.0 ng/mL，線性范圍分別為2.5～500 ng/mL、1～200 ng/mL、10～2000 ng/mL 和10～2000 ng/mL。每種肽段在各自濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（電子版文后支持信息表S4）。

在連續(xù)3 個(gè)分析日內(nèi)采用本方法對(duì)4 個(gè)濃度水平的質(zhì)控溶液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，其日間和日內(nèi)準(zhǔn)確度均在85%～115%之內(nèi)，而精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于15%，表明本方法具有良好的日內(nèi)和日間準(zhǔn)確度及精密度。

2.3 數(shù)據(jù)處理

酶解后的肽段含有多種修飾組合（圖2A），而同種修飾可能出現(xiàn)在多條檢測(cè)靶標(biāo)肽段上，例如組蛋白H3 的9 位賴氨酸乙?；↘9Ac）會(huì)同時(shí)出現(xiàn)在肽段K（Ac）STGGKAPR 和K（Ac）STGGK（Ac）APR（圖2B）中，因此，在本研究中，某特定修飾的豐度按其在所有修飾肽段中的含量之和進(jìn)行計(jì)算，并統(tǒng)一以整體含量相對(duì)穩(wěn)定的未修飾原始肽段進(jìn)行校正，例如，上述K9Ac 修飾的豐度按公式[K（Ac）STGGKAPR+K（Ac）STGGK（Ac）APR]/KSTGGKAPR 進(jìn)行計(jì)算。實(shí)驗(yàn)至少平行重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值表示，當(dāng)實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組相差1.25 倍時(shí)，認(rèn)為存在顯著性差異。

2.4 表觀遺傳活性藥物引起的細(xì)胞組蛋白H3 甲基化和乙酰化修飾譜

采用LC-MS/MS 方法定量檢測(cè)經(jīng)28 種表觀遺傳活性藥物暴露后的細(xì)胞組蛋白H3 的表觀遺傳修飾變化，結(jié)果表明， 25 種藥物引起的顯著性肽段修飾變化與其生物活性相符（表1 中加粗部分），檢測(cè)匹配度達(dá)89.3%；在17種甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑/去甲基化酶抑制劑中，除IOX1和GSK-j1外，有15種檢測(cè)結(jié)果符合已知報(bào)道（見(jiàn)電子版文后支持信息表S2）；在11 種乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑/去乙?；敢种苿┲?，除L002 外，其它10種檢測(cè)結(jié)果符合已知報(bào)道（見(jiàn)電子版文后支持信息表S2）。圖3為4種類(lèi)型抑制劑的代表性檢測(cè)譜圖。此外，有19種抑制劑除了已知的修飾變化外，還檢出其它顯著性修飾變化；而IOXI、GSK-jl和L002（圖4）這3種藥物僅能檢測(cè)到已報(bào)道生物活性外的修飾變化。引起上述檢測(cè)結(jié)果差異的原因如下：（1）文獻(xiàn)報(bào)道的組蛋白修飾多基于抗體檢測(cè)，而特定抗體僅能檢測(cè)特定的修飾位點(diǎn)，即為“一對(duì)一”的檢測(cè)模式，而質(zhì)譜方法可同時(shí)通量檢測(cè)多種修飾，并可提供更豐富的修飾信息；（2）抗體存在交叉反應(yīng)性，同種類(lèi)型的修飾易干擾抗體檢測(cè)而產(chǎn)生假陽(yáng)性；（3）藥物引起的組蛋白甲基化和乙?；揎?，可能伴隨有磷酸化和泛素化等其它修飾，因此采用本方法未能檢出。

以Seclidemstat為例，其暴露HepG2細(xì)胞后可檢測(cè)到預(yù)期的H3K4Mel表達(dá)水平升高，同時(shí)也檢測(cè)到H3K9Mel/Me3等修飾的顯著升高。研究表明，Seclidemstat是一種有效的非競(jìng)爭(zhēng)性可逆KDMIA（LSDl）抑制劑，可調(diào)控組蛋白H3的K4和K9位點(diǎn)的甲基化，促進(jìn)SWI/SNF復(fù)合物突變卵巢癌的抗腫瘤免疫，并抑制病毒產(chǎn)生、病毒DNA復(fù)制和晚期基因表達(dá)，因此認(rèn)為檢測(cè)到H3K9甲基化修飾升高具有合理性。以Tazemetostat為例，其可通過(guò)抑制KMT酶活性下調(diào)H3K27甲基化以發(fā)揮抗腫瘤作用，而本研究檢測(cè)到其暴露細(xì)胞后導(dǎo)致H3K27Me3下降，而H3K27Me3能夠抑制基因的表達(dá)，是基因沉默的重要標(biāo)志，其在多種腫瘤中異常表達(dá)，表明檢測(cè)結(jié)果與化合物調(diào)控活性相符；同時(shí)還觀察到H3K4Mel豐度也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而H3K4Mel是增強(qiáng)子特異修飾，為其激活靶基因轉(zhuǎn)錄所必需。與H3K4Mel結(jié)合的DNA在正常細(xì)胞中呈現(xiàn)低甲基化水平，但在腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高甲基化水平，因此暴露于Seclidemstat和Tazemetostat的細(xì)胞均檢測(cè)到H3K4Mel表達(dá)水平的相應(yīng)變化，表明這兩種藥物用于治療的腫瘤類(lèi)型可能存在不同的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制。

以L002為例，其為一種可逆的乙酰轉(zhuǎn)移酶p300（KAT3B）的有效抑制劑，通過(guò)抑制組蛋白乙?；瘉?lái)阻止STAT3 活化，對(duì)經(jīng)其暴露后的細(xì)胞樣本進(jìn)行檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)H3K9Ac 水平下降，但觀察到H3K23Ac 明顯下降。近年的研究表明， H3K23Ac 除了以往認(rèn)為的具有基因表達(dá)調(diào)控、增強(qiáng)子活性、DNA 修復(fù)和穩(wěn)定性等作用外，還在神經(jīng)元的發(fā)育和功能中起著重要作用，可參與調(diào)控神經(jīng)元相關(guān)基因的表達(dá)，影響神經(jīng)元的分化、連接和功能[35]。另有研究表明， L002 可改善高血壓相關(guān)的心腎纖維化[36]、逆轉(zhuǎn)高血壓誘發(fā)的心臟纖維化[37]等。因此，本研究結(jié)果可為L(zhǎng)002 作用機(jī)制的深入探討提供新的線索。

3 結(jié)論

建立了組蛋白H3 常見(jiàn)甲基化和乙?；揎椀腖C-MS/MS 通量檢測(cè)方法，并將其用于表征表觀遺傳藥物暴露誘導(dǎo)的細(xì)胞組蛋白H3 表觀遺傳修飾位點(diǎn)及其表達(dá)水平的變化。本方法具有靈敏度高、特異性好、定量分析準(zhǔn)確和可通量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，為表觀遺傳活性化合物的篩選評(píng)估及其潛在作用位點(diǎn)和機(jī)制探討等提供了新的技術(shù)工具。

References

[1] DING Yong， XU Chao， WU Ji-Hui， SHI Yun-Yu， ZANG Jian-Ye， CAI Gang. Sci. China： Life Sci. ， 2017， 47（1）： 3-15.

丁勇， 許超， 吳季輝， 施蘊(yùn)渝， 臧建業(yè)， 蔡剛. 中國(guó)科學(xué)： 生命科學(xué)， 2017， 47（1）： 3-15.

[2] SCHWARTZENTRUBER J， KORSHUNOV A， LIU X Y， JONES D T W， PFAFF E， JACOB K， STURM D， FONTEBASSO A M， QUANG D A K， T?NJES M， HOVESTADT V， ALBRECHT S， KOOL M， NANTEL A， KONERMANN C， LINDROTH A，J?GER N， RAUSCH T， RYZHOVA M， KORBEL J O， HIELSCHER T， HAUSER P， GARAMI M， KLEKNER A， BOGNARL， EBINGER M， SCHUHMANN M U， SCHEURLEN W， PEKRUN A， FRüHWALD M C， ROGGENDORF W， KRAMM C，DüRKEN M， ATKINSON J， LEPAGE P， MONTPETIT A， ZAKRZEWSKA M， ZAKRZEWSKI K， LIBERSKI P P， DONG Z，SIEGEL P， KULOZIK A E， ZAPATKA M， GUHA A， MALKIN D， FELSBERG J， REIFENBERGER G， VON DEIMLING A，ICHIMURA K， COLLINS V P， WITT H， MILDE T， WITT O， ZHANG C， CASTELO-BRANCO P， LICHTER P， FAURY D，TABORI U， PLASS C， MAJEWSKI J， PFISTER S M， JABADO N. Nature， 2012， 482（7384）： 226-231.

[3] BEHJATI S， TARPEY P S， PRESNEAU N， SCHEIPL S， PILLAY N， VAN LOO P， WEDGE D C， COOKE S L， GUNDEMG， DAVIES H， NIK-ZAINAL S， MARTIN S， MCLAREN S， GOODY V， ROBINSON B， BUTLER A， TEAGUE J W， HALAID， KHATRI B， MYKLEBOST O， BAUMHOER D， JUNDT G， HAMOUDI R， TIRABOSCO R， AMARY M F， FUTREAL PA， STRATTON M R， CAMPBELL P J， FLANAGAN A M. Nat. Genet. ， 2013， 45（12）： 1479-1482.

[4] WU G， BRONISCER A， MCEACHRON T A， LU C， PAUGH B S， BECKSFORT J， QU C， DING L， HUETHER R，PARKER M， ZHANG J， GAJJAR A， DYER M A， MULLIGHAN C G， GILBERTSON R J， MARDIS E R， WILSON R K，DOWNING J R， ELLISON D W， ZHANG J， BAKER S J. Nat. Genet. ， 2012， 44（3）： 251-253.

[5] LI Y， SETO E. Cold Spring Harbor Perspect. Med. ， 2016， 6（10）： a026831.

[6] BURNS A M， GR?FF J. Curr. Opin. Neurobiol. ， 2021， 67： 75-84.

[7] KOPRINAROVA M， SCHNEKENBURGER M， DIEDERICH M. Curr. Top. Med. Chem. ， 2016， 16（7）： 732-744.

[8] ZHOU W， ZHAO T， DU J， JI G， LI X， JI S， TIAN W， WANG X， HAO A. Cell Death Dis. ， 2019， 10（3）： 198.

[9] KIM J， LEE H， YI S J， KIM K. Exp. Mol. Med. ， 2022， 54（7）： 878-889.

[10] ANTIGNANO F， ZAPH C. Immunol. Cell. Biol. ， 2015， 93（3）： 245-252.

[11] WANG L， CHEN H， LI J J， SHU H， ZHANG X， WANG Y， TYLER B M， DONG S. Nucleic Acids Res. ， 2020， 48（4）： 1790-1799.

[12] YAN C， BOYD D D. Mol. Cell. Biol. ， 2006， 26（17）： 6357-6371.

[13] GONG F， MILLER K M. Mutat. Res. ， Rev. Mutat. Res. ， 2019， 780： 37-47.

[14] HE K， CAO X， DENG X. Curr. Opin. Plant Biol. ， 2021， 61： 102001.

[15] XIAO Li， ZHOU Cui-Lan， CHEN Lin-Ling， GAO Han-Lin， LIAO Duan-Fang， LI Kai. Int. J. Genet. ， 2006， 29（5）： 372-374.

肖莉， 周翠蘭， 陳琳玲， 高漢林， 廖端芳， 李凱. 國(guó)際遺傳學(xué)雜志， 2006， 29（5）： 372-374.

[16] GARBER K. Nat. Biotechnol. ， 2020， 38（8）： 909-912.

[17] JIANG Rui， Lü Ke-Nao， PAN Xue-Feng， CUI Xin-Xia， SHEN Shi-Gang， DING Liang. Biotechnol. Bull. ， 2019， 35（8）： 213-225.

江芮， 呂柯孬， 潘學(xué)峰， 崔新霞， 申世剛， 丁良. 生物技術(shù)通報(bào)， 2019， 35（8）： 213-225.

[18] BATES S E. N. Engl. J. Med. ， 2020， 383（7）： 650-663.

[19] HOY S M. Drugs， 2020， 80（5）： 513-521.

[20] MUNDADE R， OZER H G， WEI H， PRABHU L， LU T. Cell Cycle， 2014， 13（18）： 2847-2852.

[21] LI S， XIA M. Arch. Toxicol. ， 2019， 93（12）： 3387-3396.

[22] BRADBURY A， PLüCKTHUN A. Nature， 2015， 518（7537）： 27-29.

[23] XU Wen-Yan， CHEN Hui-Yu， YU Xi-Yong， LIANG Lu. Chin. J. Clin. Pharmacol. ， 2022， 38（20）： 2502-2505.

徐文艷， 岑慧裕， 余細(xì)勇， 梁璐. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志， 2022， 38（20）： 2502-2505.

[24] GEFFEN Y， ANAND S， AKIYAMA Y， YARON T M， SONG Y， JOHNSON J L， GOVINDAN A， BABUR ?， LI Y，HUNTSMAN E， WANG L B， BIRGER C， HEIMAN D I， ZHANG Q， MILLER M， MARUVKA Y E， HARADHVALA N J，CALINAWAN A， BELKIN S， KERELSKY A， CLAUSER K R， KRUG K， SATPATHY S， PAYNE S H， MANI D R，GILLETTE M A， DHANASEKARAN S M， THIAGARAJAN M， MESRI M， RODRIGUEZ H， ROBLES A I， CARR S A，LAZAR A J， AGUET F， CANTLEY L C， DING L， GETZ G. Cell， 2023， 186（18）： 3945-3967.e26.

[25] SHECHTER D， DORMANN H L， ALLIS C D， HAKE S B. Nat. Protoc. ， 2007， 2（6）： 1445-1457.

[26] GARCIA B A， MOLLAH S， UEBERHEIDE B M， BUSBY S A， MURATORE T L， SHABANOWITZ J， HUNT D F. Nat.Protoc. ， 2007， 2（4）： 933-938.

[27] RAPPSILBER J， ISHIHAMA Y， MANN M. Anal. Chem. ， 2003， 75（3）： 663-670.

[28] DAI X J， LIU Y， XUE L P， XIONG X P， ZHOU Y， ZHENG Y C， LIU H M. J. Med. Chem. ， 2021， 64（5）： 2466-2488.

[29] SOLDI R， GHOSH HALDER T， WESTON A， THODE T， DRENNER K， LEWIS R， KAADIGE M R， SRIVASTAVA S，DANIEL AMPANATTU S， RODRIGUEZ DEL VILLAR R， LANG J， VANKAYALAPATI H， WEISSMAN B， TRENT J M，HENDRICKS W P D， SHARMA S， SALADI S. PLoS One， 2020， 15（7）： e0235705.

[30] YOO K H， HENNIGHAUSEN L. Int. J. Biol. Sci. ， 2012， 8（1）： 59-65.

[31] MARSOLIER J， PROMPSY P， DURAND A， LYNE A M， LANDRAGIN C， TROUCHET A， BENTO S T， EISELE A，F(xiàn)OULON S， BAUDRE L， GROSSELIN K， BOHEC M， BAULANDE S， DAHMANI A， SOURD L， LETOUZé E， SALOMONA V， MARANGONI E， PERIé L， VALLOT C. Nat. Genet. ， 2022， 54（4）： 459-468.

[32] KATZ L M， HIELSCHER T， LIECHTY B， SILVERMAN J， ZAGZAG D， SEN R， WU P， GOLFINOS J G， REUSS D，NEIDERT M C， WIRSCHING H G， BAUMGARTEN P， HEROLD-MENDE C， WICK W， HARTER P N， WELLER M，VON DEIMLING A， SNUDERL M， SEN C， SAHM F. Acta Neuropathol. ， 2018， 135（6）： 955-963.

[33] WANG Q， CHEN X， JIANG Y， LIU S， LIU H， SUN X， ZHANG H， LIU Z， TAO Y， LI C， HU Y， LIU D， YE D， LIU Y，WANG M， ZHANG X， SHEN Z. J. Mol. Cell. Biol. ， 2020， 12（2）： 125-137.

[34] CAO Z， SHI X， TIAN F， FANG Y， WU J B， MRDENOVIC S， NIAN X， JI J， XU H， KONG C， XU Y， CHEN X， HUANG Y，WEI X， YU Y， YANG B， CHUNG L W K， WANG F. Cell Death Dis. ， 2021， 12（1）： 2.

[35] LI K L， ZHANG L， YANG X M， FANG Q， YIN X F， WEI H M， ZHOU T， LI Y B， CHEN X L， TANG F， LI Y H， CHANG JF， LI W， SUN F. BMC Dev. Biol. ， 2018， 18： 20.

[36] RAI R， VERMA S K， KIM D， RAMIREZ V， LUX E， LI C， SAHOO S， WILSBACHER L D， VAUGHAN D E， QUAGGIN SE， GHOSH A K. Epigenetics， 2017， 12（11）： 1004-1013.

[37] RAI R， SUN T， RAMIREZ V， LUX E， EREN M， VAUGHAN D E， GHOSH A K. J. Cell. Mol. Med. ， 2019， 23（4）： 3026-3031.

[38] GREER E L， SHI Y. Nat. Rev. Genet. ， 2012， 13（5）： 343-357.