摘要 基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（Liquid chromatography tandem mass spectrometry， LC-MS/MS），采用三重四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)選擇離子監(jiān)測（Multiple reaction monitoring， MRM）模式，應(yīng)用自下而上的蛋白分析策略，對細胞組蛋白H3 N 端的常見甲基化和乙?；揎椢稽c及表達水平進行定量分析。將本方法應(yīng)用于28 種表觀遺傳藥物引起的細胞組蛋白H3 修飾變化的檢測，結(jié)果表明，其中25 種藥物（包括去乙酰化酶抑制劑Abexinostat、Valproic acid 和AGK7 等）暴露HepG2 細胞24 h 后誘導(dǎo)的組蛋白H3 修飾變化與其已報道的生物活性一致，同時也可檢測到其它修飾變化；其余3 種藥物，包括去甲基化酶抑制劑IOX1、GSK-j1 和乙酰化轉(zhuǎn)移酶抑制劑L002，在暴露細胞后僅檢測到與已報道活性不同的修飾變化；總體檢測吻合率達到89.3%。本方法能通量化定量分析組蛋白H3 修飾位點及其變化，具有特異性好和修飾信息豐富等優(yōu)勢，有望為表觀遺傳活性化合物的篩選評估及作用機制探討提供新的技術(shù)工具。

關(guān)鍵詞 表觀遺傳藥物；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；組蛋白；甲基化；乙酰化

組蛋白的表觀遺傳修飾對于相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展具有重要作用，其中，組蛋白H3 在染色質(zhì)組裝和基因表達過程中發(fā)揮了關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[1-4]。目前研究最廣的組蛋白H3 表觀遺傳修飾類型為乙?；图谆?。組蛋白賴氨酸位點的乙酰化和去乙?；ǔ７謩e由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（Histone acetyltransferase，HATs）和組蛋白去乙?；福℉istone deacetylase， HDACs）介導(dǎo)[5]。一般認為，組蛋白的乙?；欣贒NA 與組蛋白八聚體解離，可促使核小體結(jié)構(gòu)松弛，從而使轉(zhuǎn)錄因子與DNA 結(jié)合位點特異結(jié)合，進而激活基因轉(zhuǎn)錄，而組蛋白的去乙?；瘎t發(fā)揮相反的作用。研究表明，組蛋白乙?；赡馨l(fā)揮更復(fù)雜的作用，如影響表觀記憶[6]、細胞周期調(diào)控[7]、干細胞分化[8]和細胞應(yīng)激應(yīng)答[9]等，與癌癥等疾病密切相關(guān)。與乙酰化類似，組蛋白的甲基化狀態(tài)由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（Histone methyltransferase， HMTs）和組蛋白去甲基化酶（Histone demethylases， HDMS）調(diào)控。組蛋白甲基化可通過改變組蛋白和DNA 的結(jié)合構(gòu)象以及通過招募蛋白質(zhì)復(fù)合物，參與細胞分化和發(fā)育[10]、基因沉默[11]和轉(zhuǎn)基因抑制[12]等多個生物學(xué)過程，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13-14]。

表觀遺傳的異常改變與腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關(guān)聯(lián)性研究促進了抗癌靶向表觀遺傳療法的發(fā)展[15-16]。在臨床實踐中，表觀遺傳藥物既可單獨使用，也可與傳統(tǒng)抗癌藥聯(lián)用，在提高療效的同時也極大地降低了傳統(tǒng)抗癌藥的毒副作用[17]。近20 年來，組蛋白去乙?；敢种苿┍粡V泛用于抗癌治療，如伏立諾他（Vorinostat）和羅米地辛（Romidepsin）用于治療皮膚T 細胞淋巴瘤，羅米地辛和貝利司他（Belinostat）用于治療外周T 細胞淋巴瘤，帕比司他（Panobinostat）和地塞米松（Dexamethasone）聯(lián)合用于治療多發(fā)性骨髓瘤[18]。越來越多的研究表明，表觀遺傳效應(yīng)的調(diào)控在抗癌治療中發(fā)揮了重要作用，因此表觀遺傳藥物的研發(fā)備受關(guān)注，例如， Epizyme 公司的EZH2 抑制劑他澤司他（Tazemetostat）在不到6 個月的時間內(nèi)即獲得FDA 的二次批準[19]。然而，表觀遺傳藥物的篩選目前仍面臨諸多制約因素，尤其是針對復(fù)雜多變的組蛋白表觀遺傳調(diào)控靶點，尚缺乏有效的通量篩查檢測技術(shù)。

目前，針對組蛋白修飾的檢測技術(shù)主要有染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation， ChIP）技術(shù)和高內(nèi)涵篩選（High-content screening， HCS）技術(shù)。ChIP 技術(shù)被廣泛應(yīng)用于研究轉(zhuǎn)錄因子與組蛋白修飾之間的相互作用，具有分辨率高、可定量和全基因組分析的能力[20]，但不適用于高通量篩選。HCS技術(shù)具有可進行細胞多參數(shù)分析和高通量篩選[21]的優(yōu)勢，但無法對組蛋白翻譯后修飾（Post-translationalmodifications， PTMs）進行準確的定量分析。上述兩種方法均受限于抗體的使用，而抗體存在批次之間差異和親和力差異等問題[22-23]，尤其是其檢測結(jié)果易受相鄰PTMs 的干擾[24]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Liquidchromatography-tandem mass spectrometry， LC-MS/MS）技術(shù)具有高分辨率和高靈敏度，能夠高通量鑒定多種類型的修飾，并可實現(xiàn)對低濃度修飾的準確定量分析，已成為蛋白修飾檢測的常用技術(shù)。與ChIP 和HCS 技術(shù)相比， LC-MS/MS 無需使用抗體，能夠高通量發(fā)現(xiàn)和定量分析多種已知或未知修飾，是研究復(fù)雜修飾網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機制的有力工具。

本研究建立了針對組蛋白H3 N 端1–40 位氨基酸肽段的LC-MS/MS 定量分析方法，并評估了涵蓋4 類表觀遺傳修飾調(diào)控酶的28 種抑制劑所誘導(dǎo)的組蛋白H3 修飾變化。組蛋白H3 的N 端序列經(jīng)胰蛋白酶酶切后可獲得4 種肽段序列（圖1），包括39 個甲基化和乙?；揎椊M合（電子版文后支持信息表S1）。采用所建立的LC-MS/MS 定量方法在多反應(yīng)選擇離子監(jiān)測（Multiple reaction monitoring， MRM）模式下可同時檢測39 條靶標(biāo)肽段序列，具有靈敏度高和特異性好的優(yōu)勢，可為表觀遺傳活性藥物的篩選評估提供新的技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Q-TRAP 5500 型三重四極桿-離子肼串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB Sciex 公司）；ACQUITY 型超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；CO2 培養(yǎng)箱（美國Thermo-Fisher 公司）；恒溫振蕩水浴（瑞士Gingko 公司）；Milli-Q A10 型水凈化系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；CKX41 倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；3k30高速冷凍離心機（美國Sigma-Aldrich 公司）。C18 膜（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）；15 cm 培養(yǎng)皿（美國Corning 公司）。

H3 經(jīng)胰蛋白酶酶解后的靶標(biāo)肽段以及穩(wěn)定同位素標(biāo)記的靶標(biāo)肽段（電子版文后支持信息表S1）購自生物工程股份有限公司（上海）；28 種表觀遺傳藥物，其中， NSC694621 購自源葉生物科技有限公司（上海）， AGK7 購自陶素生化科技有限公司（上海），其余均購自美國MedChemexpress 生物科技公司（電子版文后支持信息表S2）；乙腈（色譜級，百靈威科技有限公司（北京））；甲酸（純度98%，美國Sigma-Aldrich 公司）；二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide， DMSO）、濃H2SO4、NH4HCO3、濃氨水（NH3H2O）、三氯乙酸、丙酮和醋酸（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；丙酸酐（伊諾凱科技有限公司）。所用試劑均為分析純或以上純度。杜氏改良伊戈爾培養(yǎng)基（Dulbecco′s Modified Eagle Medium， DMEM）及胎牛血清（FetalBovine Serum， FBS）（美國賽默飛世爾科技公司）；測序級胰蛋白酶（普洛麥格公司）；胰酶消化液（凱基生物技術(shù)有限公司）；細胞核提取試劑盒（索萊寶生物科技有限公司；10×磷酸鹽緩沖液干粉（Phosphatebuffer solution， PBS，酷來搏科技有限公司）。實驗用水為Milli-Q A10 型水凈化系統(tǒng)制備的超純水并經(jīng)高溫滅菌。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與染毒處理

HepG2 細胞置于15 cm 培養(yǎng)皿中，每皿加入20 mL 含10%胎牛血清及100 U/mL 青鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基溶液，于37 ℃、5% CO2 細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至80%密度后，吸除培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液，用無血清的培養(yǎng)基漂洗細胞2 次后進行給藥處理。給藥組用DMSO 稀釋配制成系列表觀遺傳藥物溶液（0.01 mol/L），取10 μL 繼續(xù)用無血清培養(yǎng)基稀釋至10 μmol/L 工作濃度；另平行設(shè)立0.1% DMSO 對照組。各皿細胞經(jīng)處理后，繼續(xù)于37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育24 h。

1.2.2 組蛋白的提取

按照使用說明，采用細胞核提取試劑盒分離HepG2 細胞（約2×107 個）的細胞核，然后加入400 μLH2SO4（0.2 mol/L）混勻[25]， 4 ℃振蕩過夜后， 16000 r/min 離心10 min， 取上清液至1.5 mL 離心管中。逐滴加入132 μL 100%三氯乙酸沉淀組蛋白，用預(yù)冷的丙酮將組蛋白洗滌2 次，以去除殘留的三氯乙酸，于通風(fēng)櫥中干燥。將組蛋白溶解于30 μL NH4HCO3 溶液（50 mmol/L）中，備用。

1.2.3 組蛋白H3丙?；耙让该附?/p>

將15 μL 丙?；噭26]（丙酸酐異-丙醇（3∶1， V/V）溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用）加入30 μL 組蛋白H3 樣品中，渦旋振蕩混勻， 51 ℃孵育20 min，真空離心濃縮至10 μL，用超純水重新溶解至30 μL，以濃氨水調(diào)節(jié)至pH=8.0；重復(fù)加入15 μL 丙?；噭?，渦旋離心， 51 ℃孵育20 min， 真空離心濃縮至10 μL， 用超純水重新溶解至30 μL， 以濃氨水調(diào)節(jié)至pH=8.0；按照酶與底物質(zhì)量比為1∶10～1∶30 的比例加入測序級胰蛋白酶，于37 ℃水浴酶切， 6～10 h 后加入20%醋酸終止酶切反應(yīng)，真空離心濃縮至10 μL；重復(fù)一次丙?；磻?yīng)。酶解后的組蛋白H3 肽段及修飾情況見電子版文后支持信息表S1。

1.2.4 肽段脫鹽

將直徑約為1.5 mm 的C18 膜填裝入300 μL 規(guī)格的移液槍頭中[27]，組裝成C18 槍頭；用20 μL 含0.5%甲酸的80%乙腈潤濕， 20 μL 0.5%甲酸平衡，在1000 r/min 條件下離心1 min；樣品加入酶切后進行上樣，相同條件下離心后再加入20 μL 0.5%甲酸潤洗，棄去潤洗液；加入20 μL 含0.5%甲酸的80%乙腈進行洗脫，收集洗脫液，于55 ℃真空離心濃縮干燥。

1.2.5 待測樣品的制備

將干燥后的樣品用45 μL 0.1%甲酸溶液重新溶解，加入5 μL 混合同位素內(nèi)標(biāo)（IS）溶液， 14000 r/min離心10 min， 轉(zhuǎn)移至進樣小瓶中。加入混合IS 肽段至其終濃度分別為：a*， 50 ng/mL；b*， 10 ng/mL；c*， 10 ng/mL；K9*， 20 ng/mL。

另配制含8 個濃度梯度的H3 靶標(biāo)肽段混合標(biāo)準溶液std1～std8（std1～std8 中各組肽段對應(yīng)濃度分別為， H3-a：2.5、5、10、25、50、100、250 和500 ng/mL；H3-b：10、20、40、100、200、400、1000 和2000 ng/mL；H3-c：10、20、40、100、200、400、1000 和2000 ng/mL；H3-k9：1、2、4、10、20、40、100 和200 ng/mL），分別加入IS 肽段使其終濃度為：a*， 50 ng/mL；b*， 10 ng/mL；c*， 10 ng/mL；K9*， 20 ng/mL。

同時設(shè)4 個質(zhì)控樣品，分別為高濃度HQC、中濃度MQC、低濃度LQC 和定量下限LOQ。HQC 溶液由80 μL std-8 溶液加入20 μL 超純水稀釋獲得；MQC、LQC 和LOQ 分別為std-5、std-2 和std-1 按相同方法稀釋配制而成。

1.2.6 組蛋白H3肽段的LC-MS/MS檢測

色譜分離條件ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm），柱溫40 ℃；流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B 為乙腈；流速0.25 mL/min；進樣體積10 μL。梯度洗脫：0～1 min， 1% B；1～20 min， 16% B；20～30 min， 16%～50% B；30～35 min， 50%～1% B。

MS 條件電噴霧離子源， 正離子檢測模式和MRM 質(zhì)譜掃描模式；離子源溫度：500 ℃；輔助加熱干燥氣GS2 60 psi；霧化氣GS1 40 psi（1 psi=6.895 kPa）；噴霧電壓5.5 kV。H3 肽段標(biāo)準品的質(zhì)譜參數(shù)見電子版文后支持信息表S3。數(shù)據(jù)采集分析軟件為AB Sciex Analyst 1.5 Software。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜及質(zhì)譜方法的優(yōu)化

在流動相中加入甲酸能提高酶解肽段在質(zhì)譜中的離子化效率，并有助于保護肽段的完整性及減少背景信號等干擾。考察了不同甲酸濃度下的肽段響應(yīng)，最終確定甲酸終濃度為0.1%。此外， ACQUITYUPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm）色譜柱對肽段的分離效果和穩(wěn)定性均較好，故將其用于組蛋白修飾肽段的分析。

在ESI 正離子模式下，肽段帶正電荷，在質(zhì)譜中易于形成穩(wěn)定的離子，本研究選擇正離子模式進行質(zhì)譜分析方法的建立和優(yōu)化。采用全掃描和子離子掃描模式依次對39 種組蛋白肽段標(biāo)準品和4 種IS 標(biāo)準品進行監(jiān)測以確定母離子和子離子，并選擇豐度最高者作為定量離子對。同時，對霧化氣、輔助加熱干燥氣等參數(shù)進行了優(yōu)化，以期提升MRM 掃描的靈敏度和穩(wěn)定性，使方法更適用于多種組蛋白肽段的同時分析。最終確定了可用于39 種靶分析物及4 種IS 的最適參數(shù)：以氮氣為干燥氣，離子源溫度為500 ℃，霧化氣GS1 40 psi，輔助加熱干燥氣GS2 60 psi，噴霧電壓為5.5 kV。各肽段監(jiān)測離子對及其碰撞電壓等參數(shù)詳見電子版文后支持信息表S3。

2.2 方法學(xué)考察

采用所建立的方法對H3-a、H3-K9、H3-b 和H3-c 系列肽段進行檢測，結(jié)果表明，系列肽段在空白細胞中的檢出限分別為2.5、1.0、10.0 和10.0 ng/mL，線性范圍分別為2.5～500 ng/mL、1～200 ng/mL、10～2000 ng/mL 和10～2000 ng/mL。每種肽段在各自濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（電子版文后支持信息表S4）。

在連續(xù)3 個分析日內(nèi)采用本方法對4 個濃度水平的質(zhì)控溶液進行測定，結(jié)果表明，其日間和日內(nèi)準確度均在85%～115%之內(nèi)，而精密度的相對標(biāo)準偏差（RSD）均小于15%，表明本方法具有良好的日內(nèi)和日間準確度及精密度。

2.3 數(shù)據(jù)處理

酶解后的肽段含有多種修飾組合（圖2A），而同種修飾可能出現(xiàn)在多條檢測靶標(biāo)肽段上，例如組蛋白H3 的9 位賴氨酸乙酰化（K9Ac）會同時出現(xiàn)在肽段K（Ac）STGGKAPR 和K（Ac）STGGK（Ac）APR（圖2B）中，因此，在本研究中，某特定修飾的豐度按其在所有修飾肽段中的含量之和進行計算，并統(tǒng)一以整體含量相對穩(wěn)定的未修飾原始肽段進行校正，例如，上述K9Ac 修飾的豐度按公式[K（Ac）STGGKAPR+K（Ac）STGGK（Ac）APR]/KSTGGKAPR 進行計算。實驗至少平行重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值表示，當(dāng)實驗組與正常對照組相差1.25 倍時，認為存在顯著性差異。

2.4 表觀遺傳活性藥物引起的細胞組蛋白H3 甲基化和乙?；揎椬V

采用LC-MS/MS 方法定量檢測經(jīng)28 種表觀遺傳活性藥物暴露后的細胞組蛋白H3 的表觀遺傳修飾變化，結(jié)果表明， 25 種藥物引起的顯著性肽段修飾變化與其生物活性相符（表1 中加粗部分），檢測匹配度達89.3%；在17種甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑/去甲基化酶抑制劑中，除IOX1和GSK-j1外，有15種檢測結(jié)果符合已知報道（見電子版文后支持信息表S2）；在11 種乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑/去乙?；敢种苿┲?，除L002 外，其它10種檢測結(jié)果符合已知報道（見電子版文后支持信息表S2）。圖3為4種類型抑制劑的代表性檢測譜圖。此外，有19種抑制劑除了已知的修飾變化外，還檢出其它顯著性修飾變化；而IOXI、GSK-jl和L002（圖4）這3種藥物僅能檢測到已報道生物活性外的修飾變化。引起上述檢測結(jié)果差異的原因如下：（1）文獻報道的組蛋白修飾多基于抗體檢測，而特定抗體僅能檢測特定的修飾位點，即為“一對一”的檢測模式，而質(zhì)譜方法可同時通量檢測多種修飾，并可提供更豐富的修飾信息；（2）抗體存在交叉反應(yīng)性，同種類型的修飾易干擾抗體檢測而產(chǎn)生假陽性；（3）藥物引起的組蛋白甲基化和乙酰化修飾，可能伴隨有磷酸化和泛素化等其它修飾，因此采用本方法未能檢出。

以Seclidemstat為例，其暴露HepG2細胞后可檢測到預(yù)期的H3K4Mel表達水平升高，同時也檢測到H3K9Mel/Me3等修飾的顯著升高。研究表明，Seclidemstat是一種有效的非競爭性可逆KDMIA（LSDl）抑制劑，可調(diào)控組蛋白H3的K4和K9位點的甲基化，促進SWI/SNF復(fù)合物突變卵巢癌的抗腫瘤免疫，并抑制病毒產(chǎn)生、病毒DNA復(fù)制和晚期基因表達，因此認為檢測到H3K9甲基化修飾升高具有合理性。以Tazemetostat為例，其可通過抑制KMT酶活性下調(diào)H3K27甲基化以發(fā)揮抗腫瘤作用，而本研究檢測到其暴露細胞后導(dǎo)致H3K27Me3下降，而H3K27Me3能夠抑制基因的表達，是基因沉默的重要標(biāo)志，其在多種腫瘤中異常表達，表明檢測結(jié)果與化合物調(diào)控活性相符；同時還觀察到H3K4Mel豐度也呈現(xiàn)下降趨勢，而H3K4Mel是增強子特異修飾，為其激活靶基因轉(zhuǎn)錄所必需。與H3K4Mel結(jié)合的DNA在正常細胞中呈現(xiàn)低甲基化水平，但在腫瘤細胞中呈現(xiàn)高甲基化水平，因此暴露于Seclidemstat和Tazemetostat的細胞均檢測到H3K4Mel表達水平的相應(yīng)變化，表明這兩種藥物用于治療的腫瘤類型可能存在不同的發(fā)生和發(fā)展機制。

以L002為例，其為一種可逆的乙酰轉(zhuǎn)移酶p300（KAT3B）的有效抑制劑，通過抑制組蛋白乙?；瘉碜柚筍TAT3 活化，對經(jīng)其暴露后的細胞樣本進行檢測，未發(fā)現(xiàn)H3K9Ac 水平下降，但觀察到H3K23Ac 明顯下降。近年的研究表明， H3K23Ac 除了以往認為的具有基因表達調(diào)控、增強子活性、DNA 修復(fù)和穩(wěn)定性等作用外，還在神經(jīng)元的發(fā)育和功能中起著重要作用，可參與調(diào)控神經(jīng)元相關(guān)基因的表達，影響神經(jīng)元的分化、連接和功能[35]。另有研究表明， L002 可改善高血壓相關(guān)的心腎纖維化[36]、逆轉(zhuǎn)高血壓誘發(fā)的心臟纖維化[37]等。因此，本研究結(jié)果可為L002 作用機制的深入探討提供新的線索。

3 結(jié)論

建立了組蛋白H3 常見甲基化和乙?；揎椀腖C-MS/MS 通量檢測方法，并將其用于表征表觀遺傳藥物暴露誘導(dǎo)的細胞組蛋白H3 表觀遺傳修飾位點及其表達水平的變化。本方法具有靈敏度高、特異性好、定量分析準確和可通量檢測等優(yōu)點，為表觀遺傳活性化合物的篩選評估及其潛在作用位點和機制探討等提供了新的技術(shù)工具。

References

[1] DING Yong， XU Chao， WU Ji-Hui， SHI Yun-Yu， ZANG Jian-Ye， CAI Gang. Sci. China： Life Sci. ， 2017， 47（1）： 3-15.

丁勇， 許超， 吳季輝， 施蘊渝， 臧建業(yè)， 蔡剛. 中國科學(xué)： 生命科學(xué)， 2017， 47（1）： 3-15.

[2] SCHWARTZENTRUBER J， KORSHUNOV A， LIU X Y， JONES D T W， PFAFF E， JACOB K， STURM D， FONTEBASSO A M， QUANG D A K， T?NJES M， HOVESTADT V， ALBRECHT S， KOOL M， NANTEL A， KONERMANN C， LINDROTH A，J?GER N， RAUSCH T， RYZHOVA M， KORBEL J O， HIELSCHER T， HAUSER P， GARAMI M， KLEKNER A， BOGNARL， EBINGER M， SCHUHMANN M U， SCHEURLEN W， PEKRUN A， FRüHWALD M C， ROGGENDORF W， KRAMM C，DüRKEN M， ATKINSON J， LEPAGE P， MONTPETIT A， ZAKRZEWSKA M， ZAKRZEWSKI K， LIBERSKI P P， DONG Z，SIEGEL P， KULOZIK A E， ZAPATKA M， GUHA A， MALKIN D， FELSBERG J， REIFENBERGER G， VON DEIMLING A，ICHIMURA K， COLLINS V P， WITT H， MILDE T， WITT O， ZHANG C， CASTELO-BRANCO P， LICHTER P， FAURY D，TABORI U， PLASS C， MAJEWSKI J， PFISTER S M， JABADO N. Nature， 2012， 482（7384）： 226-231.

[3] BEHJATI S， TARPEY P S， PRESNEAU N， SCHEIPL S， PILLAY N， VAN LOO P， WEDGE D C， COOKE S L， GUNDEMG， DAVIES H， NIK-ZAINAL S， MARTIN S， MCLAREN S， GOODY V， ROBINSON B， BUTLER A， TEAGUE J W， HALAID， KHATRI B， MYKLEBOST O， BAUMHOER D， JUNDT G， HAMOUDI R， TIRABOSCO R， AMARY M F， FUTREAL PA， STRATTON M R， CAMPBELL P J， FLANAGAN A M. Nat. Genet. ， 2013， 45（12）： 1479-1482.

[4] WU G， BRONISCER A， MCEACHRON T A， LU C， PAUGH B S， BECKSFORT J， QU C， DING L， HUETHER R，PARKER M， ZHANG J， GAJJAR A， DYER M A， MULLIGHAN C G， GILBERTSON R J， MARDIS E R， WILSON R K，DOWNING J R， ELLISON D W， ZHANG J， BAKER S J. Nat. Genet. ， 2012， 44（3）： 251-253.

[5] LI Y， SETO E. Cold Spring Harbor Perspect. Med. ， 2016， 6（10）： a026831.

[6] BURNS A M， GR?FF J. Curr. Opin. Neurobiol. ， 2021， 67： 75-84.

[7] KOPRINAROVA M， SCHNEKENBURGER M， DIEDERICH M. Curr. Top. Med. Chem. ， 2016， 16（7）： 732-744.

[8] ZHOU W， ZHAO T， DU J， JI G， LI X， JI S， TIAN W， WANG X， HAO A. Cell Death Dis. ， 2019， 10（3）： 198.

[9] KIM J， LEE H， YI S J， KIM K. Exp. Mol. Med. ， 2022， 54（7）： 878-889.

[10] ANTIGNANO F， ZAPH C. Immunol. Cell. Biol. ， 2015， 93（3）： 245-252.

[11] WANG L， CHEN H， LI J J， SHU H， ZHANG X， WANG Y， TYLER B M， DONG S. Nucleic Acids Res. ， 2020， 48（4）： 1790-1799.

[12] YAN C， BOYD D D. Mol. Cell. Biol. ， 2006， 26（17）： 6357-6371.

[13] GONG F， MILLER K M. Mutat. Res. ， Rev. Mutat. Res. ， 2019， 780： 37-47.

[14] HE K， CAO X， DENG X. Curr. Opin. Plant Biol. ， 2021， 61： 102001.

[15] XIAO Li， ZHOU Cui-Lan， CHEN Lin-Ling， GAO Han-Lin， LIAO Duan-Fang， LI Kai. Int. J. Genet. ， 2006， 29（5）： 372-374.

肖莉， 周翠蘭， 陳琳玲， 高漢林， 廖端芳， 李凱. 國際遺傳學(xué)雜志， 2006， 29（5）： 372-374.

[16] GARBER K. Nat. Biotechnol. ， 2020， 38（8）： 909-912.

[17] JIANG Rui， Lü Ke-Nao， PAN Xue-Feng， CUI Xin-Xia， SHEN Shi-Gang， DING Liang. Biotechnol. Bull. ， 2019， 35（8）： 213-225.

江芮， 呂柯孬， 潘學(xué)峰， 崔新霞， 申世剛， 丁良. 生物技術(shù)通報， 2019， 35（8）： 213-225.

[18] BATES S E. N. Engl. J. Med. ， 2020， 383（7）： 650-663.

[19] HOY S M. Drugs， 2020， 80（5）： 513-521.

[20] MUNDADE R， OZER H G， WEI H， PRABHU L， LU T. Cell Cycle， 2014， 13（18）： 2847-2852.

[21] LI S， XIA M. Arch. Toxicol. ， 2019， 93（12）： 3387-3396.

[22] BRADBURY A， PLüCKTHUN A. Nature， 2015， 518（7537）： 27-29.

[23] XU Wen-Yan， CHEN Hui-Yu， YU Xi-Yong， LIANG Lu. Chin. J. Clin. Pharmacol. ， 2022， 38（20）： 2502-2505.

徐文艷， 岑慧裕， 余細勇， 梁璐. 中國臨床藥理學(xué)雜志， 2022， 38（20）： 2502-2505.

[24] GEFFEN Y， ANAND S， AKIYAMA Y， YARON T M， SONG Y， JOHNSON J L， GOVINDAN A， BABUR ?， LI Y，HUNTSMAN E， WANG L B， BIRGER C， HEIMAN D I， ZHANG Q， MILLER M， MARUVKA Y E， HARADHVALA N J，CALINAWAN A， BELKIN S， KERELSKY A， CLAUSER K R， KRUG K， SATPATHY S， PAYNE S H， MANI D R，GILLETTE M A， DHANASEKARAN S M， THIAGARAJAN M， MESRI M， RODRIGUEZ H， ROBLES A I， CARR S A，LAZAR A J， AGUET F， CANTLEY L C， DING L， GETZ G. Cell， 2023， 186（18）： 3945-3967.e26.

[25] SHECHTER D， DORMANN H L， ALLIS C D， HAKE S B. Nat. Protoc. ， 2007， 2（6）： 1445-1457.

[26] GARCIA B A， MOLLAH S， UEBERHEIDE B M， BUSBY S A， MURATORE T L， SHABANOWITZ J， HUNT D F. Nat.Protoc. ， 2007， 2（4）： 933-938.

[27] RAPPSILBER J， ISHIHAMA Y， MANN M. Anal. Chem. ， 2003， 75（3）： 663-670.

[28] DAI X J， LIU Y， XUE L P， XIONG X P， ZHOU Y， ZHENG Y C， LIU H M. J. Med. Chem. ， 2021， 64（5）： 2466-2488.

[29] SOLDI R， GHOSH HALDER T， WESTON A， THODE T， DRENNER K， LEWIS R， KAADIGE M R， SRIVASTAVA S，DANIEL AMPANATTU S， RODRIGUEZ DEL VILLAR R， LANG J， VANKAYALAPATI H， WEISSMAN B， TRENT J M，HENDRICKS W P D， SHARMA S， SALADI S. PLoS One， 2020， 15（7）： e0235705.

[30] YOO K H， HENNIGHAUSEN L. Int. J. Biol. Sci. ， 2012， 8（1）： 59-65.

[31] MARSOLIER J， PROMPSY P， DURAND A， LYNE A M， LANDRAGIN C， TROUCHET A， BENTO S T， EISELE A，F(xiàn)OULON S， BAUDRE L， GROSSELIN K， BOHEC M， BAULANDE S， DAHMANI A， SOURD L， LETOUZé E， SALOMONA V， MARANGONI E， PERIé L， VALLOT C. Nat. Genet. ， 2022， 54（4）： 459-468.

[32] KATZ L M， HIELSCHER T， LIECHTY B， SILVERMAN J， ZAGZAG D， SEN R， WU P， GOLFINOS J G， REUSS D，NEIDERT M C， WIRSCHING H G， BAUMGARTEN P， HEROLD-MENDE C， WICK W， HARTER P N， WELLER M，VON DEIMLING A， SNUDERL M， SEN C， SAHM F. Acta Neuropathol. ， 2018， 135（6）： 955-963.

[33] WANG Q， CHEN X， JIANG Y， LIU S， LIU H， SUN X， ZHANG H， LIU Z， TAO Y， LI C， HU Y， LIU D， YE D， LIU Y，WANG M， ZHANG X， SHEN Z. J. Mol. Cell. Biol. ， 2020， 12（2）： 125-137.

[34] CAO Z， SHI X， TIAN F， FANG Y， WU J B， MRDENOVIC S， NIAN X， JI J， XU H， KONG C， XU Y， CHEN X， HUANG Y，WEI X， YU Y， YANG B， CHUNG L W K， WANG F. Cell Death Dis. ， 2021， 12（1）： 2.

[35] LI K L， ZHANG L， YANG X M， FANG Q， YIN X F， WEI H M， ZHOU T， LI Y B， CHEN X L， TANG F， LI Y H， CHANG JF， LI W， SUN F. BMC Dev. Biol. ， 2018， 18： 20.

[36] RAI R， VERMA S K， KIM D， RAMIREZ V， LUX E， LI C， SAHOO S， WILSBACHER L D， VAUGHAN D E， QUAGGIN SE， GHOSH A K. Epigenetics， 2017， 12（11）： 1004-1013.

[37] RAI R， SUN T， RAMIREZ V， LUX E， EREN M， VAUGHAN D E， GHOSH A K. J. Cell. Mol. Med. ， 2019， 23（4）： 3026-3031.

[38] GREER E L， SHI Y. Nat. Rev. Genet. ， 2012， 13（5）： 343-357.