摘要 利用硫磺素T（ThT）作為置換型熒光探針，分別構(gòu)建了3 種核酸適配體生物傳感器，用于赭曲霉毒素A（OTA）、黃曲霉毒素B1（AFB1）和腺苷（Adenosine）3 種生物小分子的快速檢測(cè)。當(dāng)靶標(biāo)分子不存在時(shí)， ThT 與核酸適配體結(jié)合形成復(fù)合物，具有較強(qiáng)的熒光響應(yīng)；加入靶標(biāo)分子后， ThT 的熒光強(qiáng)度減弱，通過監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)分子的定量檢測(cè)。詳細(xì)探究了檢測(cè)機(jī)理，圓二色光譜分析結(jié)果表明，加入ThT 和靶標(biāo)分子后，核酸適配體的構(gòu)象沒有明顯變化，只是此構(gòu)象比例增加，因此系統(tǒng)的熒光強(qiáng)度的降低并非由于靶標(biāo)誘導(dǎo)核酸適配體結(jié)構(gòu)變化，而是因?yàn)榉肿又脫Q作用所致；通過等摩爾連續(xù)變化法測(cè)定ThT 與OTA、AFB1、腺苷的核酸適配體的化學(xué)計(jì)量比分別為1∶1、1∶1 和2∶1，并且解離常數(shù)均大于靶標(biāo)分子與核酸適配體的解離常數(shù)。因此，本方法的檢測(cè)原理是靶標(biāo)分子置換與核酸適配體結(jié)合的熒光探針（ThT），通過測(cè)定被靶標(biāo)分子置換出的ThT 熒光強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)分子的定量檢測(cè)。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下， 3 種小分子的檢出限分別為0.8 nmol/L （OTA）、1.3 nmol/L （AFB1）和0.1 μmol/L （腺苷）。本方法無需標(biāo)記、操作簡單、檢測(cè)成本低，具有良好的選擇性和較低的檢出限。進(jìn)一步開發(fā)了基于本方法的檢測(cè)試劑盒，可用于實(shí)際樣品中3 種生物小分子的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 核酸適配體傳感器；置換型熒光探針；硫磺素T；赭曲霉毒素A；黃曲霉毒素B1；腺苷

生物小分子包括氨基酸、核苷酸、糖類、脂質(zhì)以及代謝產(chǎn)物等，其分布與含量變化與生命健康息息相關(guān)。例如，與食品安全相關(guān)的霉菌次生代謝產(chǎn)物霉菌毒素[1]，包括黃曲霉毒素和赭曲霉毒素等，其中，黃曲霉毒素B1（Afatoxin B1， AFB1）的毒性是氰化鉀的10 倍、砒霜的68 倍，因此，發(fā)展快速便捷的生物小分子檢測(cè)方法對(duì)食品安全、一些重大疾病的預(yù)防和治療具有重要的指導(dǎo)意義。由于生物小分子抗原表位少且可結(jié)合位點(diǎn)少，采用抗體實(shí)現(xiàn)生物識(shí)別較為困難。核酸適配體的出現(xiàn)為生物小分子的識(shí)別與檢測(cè)提供了新的生物傳感識(shí)別元件[2]。核酸適配體（Aptamer）是一類經(jīng)體外篩選技術(shù)（指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)， SELEX）得到的寡核苷酸序列（RNA 或DNA）[3-4]，可與靶標(biāo)分子以高親和力和高特異性結(jié)合[5]。與傳統(tǒng)抗體相比，核酸適配體具有易于化學(xué)合成和修飾、合成成本低、穩(wěn)定性好以及不同批次之間差異小等優(yōu)勢(shì)[6]。作為生物傳感器的識(shí)別元件，核酸適配體在疾病診斷和治療、蛋白質(zhì)組學(xué)研究以及微生物、毒素檢測(cè)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[7]。盡管基于核酸適配體構(gòu)建的傳感器已被應(yīng)用于生物小分子檢測(cè)，但仍然存在以下兩方面的困難。首先，提高識(shí)別單元與靶標(biāo)小分子的親和性較難。常見的傳感方法是通過競爭反應(yīng)獲得傳感響應(yīng)，例如免標(biāo)記納米金顯色型核酸適配體傳感器[8]和鏈置換型核酸適配體傳感器[9]等。由于核酸適配體與競爭物的親和性較強(qiáng)，抑制其與靶標(biāo)分子的相互作用，使得所設(shè)計(jì)的傳感方法靈敏度較低，檢出限較高[10]。其次，核酸適配體常被標(biāo)記有機(jī)熒光基團(tuán)和有機(jī)猝滅基團(tuán)等[11]，使傳感過程復(fù)雜，并且成本較高。因此，迫切需要開發(fā)操作簡便、選擇性好、靈敏度高且檢測(cè)成本低的傳感方法用于生物小分子的檢測(cè)。

熒光探針置換型核酸適配體傳感器利用靶標(biāo)分子將熒光探針從核酸適配體-熒光探針復(fù)合物中競爭置換出來，通過熒光探針的熒光強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)分子的定量檢測(cè)。該方案的優(yōu)勢(shì)是無需對(duì)核酸適配體進(jìn)行共價(jià)標(biāo)記，從而簡化了核酸適配體繁雜的合成及純化步驟[12-14]，降低了檢測(cè)成本，因此在生物小分子檢測(cè)方面具有優(yōu)勢(shì)。此外，相比于常見的競爭物（核酸互補(bǔ)鏈和納米粒子等），置換型熒光探針與核酸適配體的親和力較弱，熒光探針對(duì)于核酸適配體識(shí)別靶標(biāo)分子過程的抑制作用小得多，其熱力學(xué)反應(yīng)和動(dòng)力學(xué)過程更容易實(shí)現(xiàn)[13，15-16]。因此，熒光探針置換型核酸適配體傳感器比其它競爭型適配體傳感器具有更低的檢出限[17-18]。Yang 研究組[17]以結(jié)晶紫染料（CV）作為置換型熒光探針，構(gòu)建了用于檢測(cè)赭曲霉毒素A（OTA）的核酸適配體傳感器。隨著OTA 濃度增加，體系熒光強(qiáng)度顯著減弱，依據(jù)熒光強(qiáng)度變化實(shí)現(xiàn)了對(duì)OTA 的定量檢測(cè)，檢出限為0.56 nmol/L， 遠(yuǎn)低于其它熒光傳感方案（5.7 nmol/L）[19]。

硫磺素T（ThT）是一種潛在的置換型熒光探針。ThT 由苯并噻唑和二甲基苯胺組成，并圍繞C—C 鍵自由旋轉(zhuǎn)，導(dǎo)致ThT 的熒光響應(yīng)較低。當(dāng)ThT 與淀粉樣蛋白原纖維結(jié)合時(shí)，呈現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光，因此常用于體外診斷淀粉樣蛋白原纖維[20]。ThT 具有諸多優(yōu)點(diǎn)，包括水溶性好、熒光背景低、化學(xué)穩(wěn)定性好、成本低等，作為熒光探針已被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)研究[21]。Ranjan 研究組[20]總結(jié)了ThT 作為核酸配體在基于核酸的生物傳感器中的應(yīng)用研究進(jìn)展， ThT 作為一種分子轉(zhuǎn)子型熒光探針能夠識(shí)別多種核酸構(gòu)象，包括G-四鏈體、G-三鏈體和雙鏈等[22]。ThT 通常以外部結(jié)合、插層結(jié)合和空腔內(nèi)結(jié)合（如堿基缺失或錯(cuò)配）3 種模式與核酸相互作用，從而影響ThT 的熒光發(fā)射[23]。目前，對(duì)ThT 作為熒光探針的研究和應(yīng)用多集中在其與G-四鏈體結(jié)構(gòu)的相互作用[24]，例如， Mohanty 等[25]首次證明了ThT 能夠與人類端粒DNA（22AG）相互作用，在含K+的Tris 緩沖液中， ThT 的熒光發(fā)射增強(qiáng)約2100 倍；分子模擬結(jié)果表明， ThT 可堆疊在G-四分體的外平面上，限制苯并噻唑和氨基苯胺環(huán)的旋轉(zhuǎn)，使得ThT 染料的熒光發(fā)射強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。Li 研究組[26]的研究表明，以ThT 為置換型熒光探針可實(shí)現(xiàn)ATP 的檢測(cè)。這些研究顯示了ThT 作為一種新型免標(biāo)記核酸熒光探針的應(yīng)用潛力。

本研究利用ThT 染料作為免標(biāo)記置換型熒光探針，構(gòu)建了3 種核酸適配體傳感器，用于檢測(cè)小分子物質(zhì)OTA、AFB1 和腺苷（Adenosine）。當(dāng)靶標(biāo)分子不存在時(shí)， ThT 可與不同靶標(biāo)分子的核酸適配體形成復(fù)合物，并產(chǎn)生顯著的熒光響應(yīng)；加入靶標(biāo)分子后，由于ThT 與適配體的作用較弱，靶標(biāo)分子將核酸適配體-ThT 復(fù)合物中的ThT 置換出來，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度減弱。通過測(cè)量傳感體系的熒光強(qiáng)度變化，可實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)分子的定量檢測(cè)。本方法具有操作簡單、檢測(cè)速度快、靈敏度高且檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)，基于此原理開發(fā)的試劑盒可用于實(shí)際樣品中OTA、AFB1 和腺苷的高靈敏檢測(cè)。