［摘 要］ 目的：探討小泛素樣修飾特異性蛋白酶 1（SENP-1）/低氧誘導(dǎo)因子 1α（HIF-1α） 通路對(duì)慢性間歇性低氧 （CIH） 誘導(dǎo)大鼠血管內(nèi)皮損傷的影響，闡明其相關(guān)作用機(jī)制。方法：SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和CIH 組，再將每組分為2、4 和6 周3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)亞組，每亞組8 只。CIH 組大鼠暴露于CIH 艙中進(jìn)行CIH 誘導(dǎo)，制備阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（OSAHS） 模型，對(duì)照組大鼠暴露于常氧環(huán)境中。于各時(shí)間點(diǎn)收集各組大鼠血清和胸主動(dòng)脈組織。HE 染色觀察各組大鼠胸主動(dòng)脈血管損傷情況， 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 法檢測(cè)各組大鼠血清中一氧化氮（NO）、內(nèi)皮素1（ET-1）、血管性血友病因子（vWF） 和血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM） 水平，Western blotting 法檢測(cè)各組大鼠胸主動(dòng)脈組織中SENP-1、HIF-1α 和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A （VEGFA） 蛋白表達(dá)水平。體外培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（rAECs），經(jīng)SENP-1 shRNA 腺病毒（sh-SENP-1） 感染構(gòu)建SENP-1 基因低表達(dá)的rAECs 細(xì)胞株，采用 CIH 誘導(dǎo)建立血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，分為 CIH 組、CIH+sh-NC 組和 CIH+sh-SENP-1 組，另設(shè)對(duì)照組。CCK-8 檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性，ELISA 法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中乳酸脫氫酶（LDH） 活性及細(xì)胞中NO、ET-1、丙二醛（MDA） 水平和超氧化物歧化酶（SOD） 活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中SENP-1、HIF-1α 和VEGFA 蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：隨著CIH誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，與對(duì)照組比較，CIH組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜逐漸粗糙并明顯增厚， 血清中NO 水平逐漸減低（Plt;0. 05）， 血清中ET-1、vWF 和TM 水平及胸主動(dòng)脈組織中SENP-1、HIF-1α 和VEGFA 蛋白表達(dá)水平逐漸升高（Plt;0. 05）。與對(duì)照組比較，CIH 組細(xì)胞增殖活性降低（Plt;0. 05），細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH 活性及細(xì)胞中ET-1、MDA 水平和細(xì)胞凋亡率升高（Plt;0. 05），細(xì)胞中NO 水平和SOD 活性降低（Plt;0. 05），SENP-1、HIF-1α 和VEGFA 蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 05）；與CIH 組比較，CIH+sh-SENP-1 組細(xì)胞增殖活性升高（Plt;0. 05），細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH 活性及細(xì)胞中ET-1、MDA 水平和細(xì)胞凋亡率降低（Plt;0. 05），細(xì)胞中NO 水平和SOD 活性升高 （Plt;0. 05），SENP-1、HIF-1α和 VEGFA蛋白表達(dá)水平降低 （Plt;0. 05）。結(jié)論：SENP-1/HIF-α通路在CIH 誘導(dǎo)的大鼠胸主動(dòng)脈損傷組織中高度活化，沉默SENP-1 表達(dá)可減輕CIH 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制可能與下調(diào)SENP-1/HIF-α 通路活化水平有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］ 慢性間歇性低氧； 胸主動(dòng)脈； 小泛素樣修飾特異性蛋白酶1； 低氧誘導(dǎo)因子1α； 血管內(nèi)皮損傷

［中圖分類號(hào)］ R364. 4 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS） 是一類睡眠時(shí)出現(xiàn)呼吸暫?；虻屯?，引起機(jī)體慢性間歇性低氧（chronic intermittenthypoxia，CIH） 進(jìn)而導(dǎo)致睡眠結(jié)構(gòu)紊亂的疾病，常誘發(fā)血管內(nèi)皮損傷［1］。OSAHS 是高血壓、腦卒中和冠心病等心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，OASHS 患者血管內(nèi)皮損傷引起的內(nèi)皮功能障礙與心腦血管疾病的發(fā)病有密切關(guān)聯(lián)［2］，但其作用機(jī)制尚不明確且缺乏有效的治療措施。CIH 是OSAHS的主要病理生理機(jī)制，其引起的氧化應(yīng)激和炎癥是內(nèi)皮損傷的主要危險(xiǎn)因素［3］。相關(guān)文獻(xiàn)［4］ 報(bào)道：CIH 可激活低氧誘導(dǎo)因子1α （hypoxic induciblefactor-1α， HIF-1α）， 加重主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和損傷。小泛素樣修飾（small ubiquitin-likemodifier，SUMO） 是一種翻譯后修飾，HIF-1α 被SUMO 化修飾后活性將受到抑制，而SUMO 特異性蛋白酶1 （SUMO specific protease-1， SENP-1）能夠通過(guò)去SUMO 化增強(qiáng)HIF-1α 的穩(wěn)定性［5］。SENP-1/HIF-1α 信號(hào)通路在大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞低氧性增殖［5］ 和人牙髓干細(xì)胞的血管生成中起重要作用［6］。 關(guān)于 SENP-1/HIF-1α 信號(hào)通路在 OSAHS 血管內(nèi)皮損傷中的研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討SENP-1/HIF-1α 信號(hào)通路在OSAHS 血管內(nèi)皮損傷的作用，為其臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí) SD大鼠 48只，雄性，鼠齡8 周，體質(zhì)量250～300 g，由武漢云克隆動(dòng)物有限公司提供， 動(dòng)物使用許可證號(hào)： SYXK （鄂）2018-0069。 于 飼 養(yǎng) 室 溫 度（23±1） ℃、 濕 度50%～55 % 和明暗光照各12 h 條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

1. 2 主要試劑和儀器

大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞 （rataortic endothelial cells， rAECs） 購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。SENP-1 短發(fā)夾RNA （shorthairpin RNA， shRNA） 腺病毒（pShuttle-CMVsh-SENP-1， sh-SENP-1） 及其陰性對(duì)照腺病毒（pShuttle-CMV-sh-NC， sh-NC） 由漢恒生物技術(shù)（上海） 有限公司提供， 其腺病毒滴度均為1×1012 PFU·mL?1。胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基和胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司， 一氧化氮（nitricoxide， NO） 含量檢測(cè)試劑盒（微量法）、大鼠內(nèi)皮素1 （endothelin-1， ET-1） 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 檢測(cè)試劑盒、大鼠血管性血友病因子（ vonWillebrand factor， vWF） ELISA 檢測(cè)試劑盒、大鼠血栓調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin，TM） ELISA 檢測(cè)試劑盒、大鼠乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH） ELISA 檢測(cè)試劑盒、 細(xì)胞丙二醛（malondialdehyde， MDA） 檢測(cè)試劑盒（微板法）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）檢測(cè)試劑盒（NBT 法） 購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司， SENP-1 抗體、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA） 抗體和GAPDH 抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司， HIF-1α抗體購(gòu)自美國(guó)Ramp;D Systems 公司，CCK-8 試劑盒、First Strand cDNA Synthesis Kit 購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司， 實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-timefluorescence quantitative PCR， RT-qPCR） 試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司。S1008 間歇氧濃度控制系統(tǒng)和1100-S7 型暴露艙購(gòu)自上海玉研科學(xué)儀器有限公司，RT-6100 酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Rayto 公司，CFXConnct 熒光定量 PCR 儀購(gòu)自美國(guó) Bio-rad 公司，C2 激光共聚焦顯微鏡和E100 顯微鏡購(gòu)自日本Nikon 公司， CytoFLEX 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter 公司， HeracellTM Vios 250i CO2 培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司，BV-2 垂直電泳儀購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司， MouseOx無(wú)創(chuàng)脈搏血氧儀購(gòu)自美國(guó)STARR Life Sciences公司。

1. 3 OSAHS大鼠模型制備

48只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和CIH 組，再將每組大鼠分為2、4 和6 周3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)亞組，每亞組8 只。按照參考文獻(xiàn)［7］中的方法，將CIH 組大鼠放入間歇性低氧艙中，關(guān)閉艙門(mén)，向艙內(nèi)充入氮?dú)夂脱鯕?，緩沖4 min，使艙內(nèi)氧濃度達(dá)到8. 5%，維持1 min；隨后2 min 調(diào)節(jié)艙內(nèi)空氣，使艙內(nèi)恢復(fù)正常空氣（氧濃度恢復(fù)至21%） 并維持1 min， 每次循環(huán)8 min， 每天持續(xù)8 h。對(duì)照組大鼠置于常氧暴露艙中， 常規(guī)飼養(yǎng)。分別于CIH 誘導(dǎo)2、4 和6 周時(shí)，采用3% 戊巴比妥鈉過(guò)量麻醉處死各組大鼠，收集外周血和胸主動(dòng)脈組織，按照實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行保存。

1. 4 HE 染色觀察各組大鼠胸主動(dòng)脈組織病理形態(tài)表現(xiàn)

取出已固定24 h的大鼠胸主動(dòng)脈組織，乙醇脫水， 石蠟包埋， 切片； 石蠟切片（4 μm） 進(jìn)行梯度乙醇脫蠟至水后， 行HE 染色， 脫水封片，于顯微鏡下觀察大鼠胸主動(dòng)脈組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1. 5 細(xì)胞培養(yǎng)和腺病毒感染

將 rAECs 培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱條件為37 ℃和5 %CO2。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90 % 時(shí)進(jìn)行傳代， 取第2 代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 rAECs 以每孔 1×105 個(gè)細(xì)胞的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入感染復(fù)數(shù)為 100 的sh-NC和sh-SENP-1 腺病毒載體進(jìn)行腺病毒感染，將細(xì)胞分為sh-NC 組和sh-SENP-1 組，另設(shè)不進(jìn)行處理的rAECs 為空白組。孵育30 min 后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用RT-qPCR 法和Western blotting 法檢測(cè)病毒感染后rAECs 中SENP-1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平，驗(yàn)證感染效率。

1. 6 血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型制備及分組

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期rAECs，采用CIH 誘導(dǎo)建立血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型［8］。 調(diào)整細(xì)胞培養(yǎng)箱 O2 濃度， CIH 條件：20% O2 培養(yǎng)15 min， 1 % O2 培養(yǎng)5 min 為1 個(gè)循環(huán)，每小時(shí)3 個(gè)循環(huán)，培養(yǎng)24 h。將rAECs 分為對(duì)照組（未經(jīng)任何處理）、CIH 組（CIH 誘導(dǎo)24 h）、CIH+sh-NC 組（感染 sh-NC 腺病毒后 CIH 誘導(dǎo)24 h） 和CIH+sh-SENP-1 組（感染sh-SENP-1 腺病毒后CIH 誘導(dǎo)24 h）。

1. 7 RT-qPCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中SENP-1 mRNA表達(dá)水平

收集各組細(xì)胞沉淀，提取總 RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系生成 cDNA， 逆轉(zhuǎn)錄程序：25 ℃ 、5 min， 42 ℃ 、30 min， 85 ℃ 、5 s。以cDNA 為模板， GAPDH 為內(nèi)參， 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增參數(shù)如下： 95 ℃、30 s； 95 ℃、15 s， 60 ℃、30 s，40 個(gè)循環(huán)；65 ℃→95 ℃，每升溫0. 5 ℃，采集一次熒光信號(hào)。采用2-△△Ct 法計(jì)算各組細(xì)胞中SENP-1 mRNA 表達(dá)水平。引物序列： SENP-1，F(xiàn) 5'-CCAGCATTTTAACTAACCAGGAAC-3'，R 5'-GCTAAGTTATCTGGCTGATGTGG-3'；GAPDH，F(xiàn) 5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，R 5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。

1. 8 CCK-8 法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性

取各組rAECs，按照每孔1×103個(gè)細(xì)胞的密度接種至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，同時(shí)設(shè)置空白孔，每組3 個(gè)復(fù)孔，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至70% 融合時(shí)進(jìn)行CIH 誘導(dǎo)24 h。提前4 h 向每孔中加入10 μLCCK-8 溶液， 孵育4 h 后， 用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光度（A） 值。細(xì)胞增殖活性= （實(shí)驗(yàn)組A 值? 空白孔A 值） / （對(duì)照組A 值? 空白孔A 值） ×100%。

1. 9 ELISA 法檢測(cè)各組大鼠血清中 NO、ET-1、vWF、TM水平及細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH活性和細(xì)胞中NO、ET-1、MDA水平及SOD活性

取各組大鼠血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清并收集各組細(xì)胞樣本， 按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作， 采用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔A 值， 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組大鼠血清中NO、ET-1、vWF 和TM 水平， 細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH 活性，細(xì)胞中NO、ET-1、MDA 水平和SOD活性。

1. 10 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率

分組處理后收集各組細(xì)胞， 重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為2×104 mL-1， 取500 μL 重懸細(xì)胞， 加入195 μLAnnexin Ⅴ-FITC 結(jié)合液，再依次加入5 μL AnnexinⅤ-FITC 和10 μL 碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色液輕輕混勻，室溫避光孵育10 min，上機(jī)檢測(cè)。在散點(diǎn)圖上， Q2-1 象限為機(jī)械性損傷的細(xì)胞，Q2-2 象限為晚期凋亡或者壞死細(xì)胞，Q2-3 象限為正常細(xì)胞， Q2-4 象限為早期凋亡細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率（%） =Q2-2 象限細(xì)胞百分率+Q2-4 象限細(xì)胞百分率。

1. 11 Western blotting 法檢測(cè)各組大鼠胸主動(dòng)脈組織和細(xì)胞中 SENP-1、HIF-1α 和 VEGFA 蛋白表達(dá)水平

收集各組大鼠胸主動(dòng)脈組織和各組細(xì)胞沉淀，提取總蛋白，進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。上樣已沸水浴變性的蛋白， 經(jīng)聚丙烯氨酰胺凝膠電泳， 轉(zhuǎn)PVDF 膜， 5% 脫脂牛奶封閉， 分別加入一抗SENP-1 抗體（1∶1 000）、HIF-1α 抗體（1∶1 000）、VEGFA抗體（1∶1 000） 和GAPDH抗體（1∶1 000）稀釋緩沖液孵育， 加入辣酸根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP） 標(biāo)記 IgG 二抗（1∶10 000） 再次孵育，洗滌，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。采用Alpha 灰度分析軟件分析目的蛋白條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1. 12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠血清中NO、ET-1、vWF和TM 水平及胸主動(dòng)脈組織中SENP-1、HIF-1α 和VEGFA 蛋白表達(dá)水平，各組細(xì)胞增殖活性，各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH 活性，各組細(xì)胞中NO、ET-1、MDA 水平和SOD 活性，各組細(xì)胞凋亡率，各組細(xì)胞中SENP-1、HIF-1α 和VEGFA 蛋白表達(dá)水平，均符合正態(tài)分布， 以-x±s 表示， 兩組間樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析， 組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 各組大鼠胸主動(dòng)脈組織病理形態(tài)表現(xiàn)

CIH誘導(dǎo)2、4 和6 周時(shí)，對(duì)照組大鼠胸主動(dòng)脈組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整， 管壁無(wú)增厚， 內(nèi)皮光滑， 無(wú)剝脫和缺失；與對(duì)照組比較，CIH 組大鼠胸主動(dòng)脈組織內(nèi)皮粗糙，內(nèi)皮細(xì)胞排列無(wú)序，管壁明顯增厚，且隨著CIH 誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，CIH 組大鼠胸主動(dòng)脈組織損傷逐漸加重。見(jiàn)圖1。

2. 2 各組大鼠血清中 NO、ET-1、vWF 和 TM 水平

CIH 誘導(dǎo)2 周時(shí)，與對(duì)照組比較，CIH 組大鼠血清中NO、ET-1、vWF 和TM 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）；CIH 誘導(dǎo)4 和6 周時(shí)，與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組和CIH 組2 周時(shí)比較，CIH 組大鼠血清中NO 水平降低（Plt;0. 05）， 而ET-1、vWF 和TM 水平升高（Plt;0. 05）。見(jiàn)表1。

2. 3 各組大鼠胸主動(dòng)脈組織中SENP-1、HIF-1α和VEGFA 蛋白表達(dá)水平

CIH 誘導(dǎo) 2、4和 6周時(shí)，對(duì)照組大鼠胸主動(dòng)脈組織中SENP-1、HIF-1α 和VEGFA 蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）； 與對(duì)照組比較， 隨CIH 誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，CIH 組大鼠胸主動(dòng)脈組織中SENP-1、HIF-1α 和VEGFA 蛋白表達(dá)水平逐漸升高（Plt;0. 05）。見(jiàn)圖2。

2. 4 SENP-1感染效率和各組細(xì)胞增殖活性

與空白組和sh-NC 組比較， sh-SENP-1 組細(xì)胞中SENP-1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0. 05）（圖3A～3C）。CCK-8 法檢測(cè)， 與對(duì)照組比較，CIH 組細(xì)胞增殖活性降低（Plt;0. 05）； 與CIH 組比較，CIH+sh-SENP-1 組細(xì)胞增殖活性升高（Plt;0. 05）， CIH+sh-NC 組細(xì)胞增殖活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）（圖3D）。

2. 5 各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中 LDH 活性及細(xì)胞中NO、ET-1、MDA 水平和 SOD 活性

與對(duì)照組比較， CIH 組細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH 活性及細(xì)胞中ET-1 和 MDA 水平升高（Plt;0. 05）， 細(xì)胞中NO 水平和SOD 活性降低（Plt;0. 05）；與CIH 組比較，CIH+sh-SENP-1 組細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH 活性及細(xì)胞中 ET-1 和 MDA 水平降低（Plt;0. 05），細(xì)胞中 NO 水平和 SOD 活性升高（Plt;0. 05），CIH+sh-NC組細(xì)胞中上述各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見(jiàn)表2。

2. 6 各 組 細(xì) 胞 凋 亡 率

與 對(duì) 照 組 （7. 30%±0. 98%） 比較， CIH 組細(xì)胞凋亡率（39. 21%±4. 94%） 升高（Plt;0. 05）；與CIH 組比較，CIH+sh-SENP-1 組細(xì)胞凋亡率（21. 62%±3. 53%） 降低（Plt;0. 05）， CIH+sh-NC 組細(xì)胞凋亡率（37. 60%±3. 92%） 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見(jiàn)圖4。

2. 7 各組細(xì)胞中SENP-1、HIF-1α和VEGFA蛋白表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，CIH組細(xì)胞中SENP-1、HIF-1α 和VEGFA 蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 05）；與 CIH 組 比 較， CIH+sh-SENP-1 組 細(xì) 胞 中SENP-1、HIF-1α 和VEGFA 蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0. 05）， CIH+sh-NC 組細(xì)胞中上述各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見(jiàn)圖5。

3 討 論

近年來(lái)， OSAHS 引起的心血管疾病逐年上升，已成為國(guó)內(nèi)外公共健康問(wèn)題［9］。OSAHS 引起的CIH 可造成血流動(dòng)力學(xué)改變，引起血管損傷，是導(dǎo)致心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［10］。本研究采用CIH 誘導(dǎo)法成功構(gòu)建OSAHS大鼠模型。NO、ET-1、vWF 和TM 是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷標(biāo)志物， 本研究結(jié)果顯示：隨著CIH 誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，OSAHS 大鼠血清中NO 水平持續(xù)降低， ET-1、vWF 和TM水平持續(xù)升高，且組織病理染色結(jié)果顯示大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮損傷加重，提示CIH 可造成OSAHS 大鼠的血管內(nèi)皮損傷，與王海娟等［11］ 研究結(jié)果一致。

CIH 可模擬睡眠中缺氧-復(fù)氧合過(guò)程， 極大程度還原OSAHS 的發(fā)病過(guò)程。研究［12-16］ 顯示：OSAHS 的發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激通路激活和炎癥反應(yīng)有關(guān)。在間歇低氧激活的氧化應(yīng)激及炎癥通路中， HIF-1α 依賴的適應(yīng)性通路可被間歇低氧誘導(dǎo)［17-19］， 在OSAHS 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。HIF-1α 是參與機(jī)體低氧相關(guān)性基因表達(dá)調(diào)控的重要轉(zhuǎn)錄因子。研究［20-21］ 顯示：SENP-1 可影響HIF-1α 信號(hào)通路的活性，并參與HIF-1α 所介導(dǎo)的生理病理過(guò)程，具有正反饋?zhàn)饔?。在低氧時(shí)，SENP-1被激活，SENP-1 基因的啟動(dòng)子上2 個(gè)缺氧反應(yīng)元件（hypoxia response element，HRE） 與HIF-1α 結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)SENP-1 基因的錄。轉(zhuǎn)錄后的SENP-1對(duì)低氧誘導(dǎo)的SUMO 化HIF-1α 進(jìn)行去SUMO 化，從而使HIF-1α 穩(wěn)定表達(dá)，發(fā)生核轉(zhuǎn)位，轉(zhuǎn)錄激活，調(diào)節(jié)多種靶基因， 如血管內(nèi)皮損傷標(biāo)志物VEGF和促紅細(xì)胞生成素等，基因產(chǎn)物在細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和新生血管生成等方面發(fā)揮重要作用［22］。本研究結(jié)果顯示：CIH 可誘導(dǎo)OSAHS大鼠胸主動(dòng)脈組織和rAECs 中SENP-1、HIF-1α 及VEGFA 蛋白表達(dá)升高； 同時(shí)CIH 還可提高rAECs 凋亡率、LDH活性及ET-1 和MDA 水平，降低大鼠血清中NO 水平和SOD 活性， 并抑制rAECs 增殖活性， 推測(cè)CIH 引起的血管內(nèi)皮損傷可高度活化SENP-1/HIF-α 信號(hào)通路并提高氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡水平。為了進(jìn)一步研究SENP-1/HIF-α 信號(hào)通路對(duì)血管內(nèi)皮損傷的影響，本研究采用sh-SENP-1 腺病毒感染CIH 誘導(dǎo)下的rAECs，通過(guò)沉默SENP-1 表達(dá)抑制HIF-α 蛋白SUMO 化降解，結(jié)果顯示：SENP-1 基因沉默可降低 CIH 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激水平， 提高 rAECs 增殖活性， 說(shuō)明抑制 SENP-1/HIF-α 通路活化對(duì)OSAHS 引起的血管內(nèi)皮損傷中氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡具有減輕作用。

綜上所述，SENP-1/HIF-α 通路在CIH 誘導(dǎo)的大鼠胸主動(dòng)脈損傷組織中高度活化，沉默SENP-1表達(dá)可減輕CIH 誘導(dǎo)的大鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制可能與下調(diào)SENP-1/HIF-α 通路活化有關(guān)。針對(duì)目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究存在的不足，本研究從動(dòng)物和細(xì)胞水平研究SENP-1/HIF-1α 信號(hào)通路在OSAHS 引起的血管內(nèi)皮損傷中的作用，為后期將SENP-1/HIF-1α 信號(hào)通路作為心血管疾病的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

利益沖突聲明：

所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：

賈遠(yuǎn)航參與實(shí)驗(yàn)過(guò)程和論文撰寫(xiě)，江義霞參與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集和整理，何振華參與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和論文修改，陳林參與論文初稿審校和數(shù)據(jù)核查，周芳參與實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)和論文審校。

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[基金項(xiàng)目] 湖南省衛(wèi)健委科研基金項(xiàng)目（202203024555）