［摘 要］ 目的：探討肌源性分化蛋白1（Myod1） 對(duì)氧糖剝奪 （OGD） 誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞增殖抑制和凋亡的影響，并闡明其作用機(jī)制。方法：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR） 法檢測(cè)正常對(duì)照組研究對(duì)象和缺血性腦梗死組患者外周血及正常培養(yǎng)的SH-SY5Y 細(xì)胞（對(duì)照組） 和OGD 細(xì)胞模型（OGD 組） 細(xì)胞中Myod1 和長(zhǎng)鏈非編碼RNA （lncRNA） 小核仁RNA 宿主基因15 （SNHG15）mRNA 表達(dá)水平。分別采用si-Myod1、pcDNA3. 0-Myod1、si-SNHG15、pcDNA3. 0-SNHG15、si-NC、空載質(zhì)粒（Vector）、miR-NC 和miR-24-3p模擬物（miR-mimics） 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y 細(xì)胞后，進(jìn)行OGD處理，將SH-SY5Y 細(xì)胞分為對(duì)照組、OGD 組、OGD+Vector 組、OGD+Myod1 組、OGD+si-NC 組、OGD+si-Myod1 組、OGD+si-SNHG15 組、OGD+si-SNHG15+Vector 組、OGD+si-SNHG15+Myod1 組、OGD+miR-NC 組、OGD+miR-mimics 組、OGD+miR-mimics+Vector 組和OGD+miR-mimics+SNHG15 組。采用CCK-8 法檢測(cè)各組細(xì)胞活性，采用5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（EdU） 染色法檢測(cè)各組EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率，采用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記（TUNEL） 法檢測(cè)各組TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞率， 采用Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中裂解的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 （cleavedcaspase-3）、裂解的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9 （cleaved caspase-9）、B 細(xì)胞淋巴瘤2 （Bcl-2）和Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax） 蛋白表達(dá)水平。染色質(zhì)免疫共沉淀（CHIP） 法評(píng)估Myod1 和SNHG15 之間的關(guān)聯(lián)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)評(píng)估Myod1 與SNHG15 及SNHG15 與miR-24-3p 的靶向關(guān)系。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，缺血性腦梗死組患者外周血中Myod1和SNHG15 mRNA表達(dá)水平均升高（Plt;0. 05）。與對(duì)照組比較， OGD 組細(xì)胞中Myod1 和SNHG15 mRNA 表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05）。與OGD 組比較， 48 和72 h 時(shí)OGD+Myod1 組細(xì)胞活性和EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率均降低（Plt;0. 01），TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞率升高（Plt;0. 01）；OGD+si-Myod1 組細(xì)胞活性和EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率均升高（Plt;0. 01）， TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞率降低（Plt;0. 01）。Myod1 可與SNHG15 的啟動(dòng)子序列結(jié)合。SNHG15 可吸附miR-24-3p，Myod1 與SNHG15 及SNHG15 與miR-24-3p 存在靶關(guān)系。敲低SNHG15后， 與OGD 組比較， 48 和72 h 時(shí)OGD+si-SNHG15 組細(xì)胞活性和EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率均升高（Plt;0. 01），TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞率降低（Plt;0. 01），細(xì)胞中Bax、cleaved caspase-3 和cleaved caspase-9 蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0. 01），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 01）；與OGD+si-SNHG15 組比較，48 和72 h 時(shí)OGD+si-SNHG15+Myod1 組細(xì)胞活性和EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率降低（Plt;0. 05）， TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞率升高（Plt;0. 05）， 細(xì)胞中Bax、cleaved caspase-3 和cleaved caspase-9 蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 05）， Bcl-2 的蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0. 05）。過(guò)表達(dá)miR-24-3p 和SNHG15 后， 與OGD 組比較，48 和72 h 時(shí)OGD+miR-mimics 組細(xì)胞活性和EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率升高（Plt;0. 01），TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞率降低（Plt;0. 01）， 細(xì)胞中Bax、cleaved caspase-3 和cleaved caspase-9 蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0. 01），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 01）；與OGD+miR-mimics 組比較，48 和72 h 時(shí)OGD+miR-mimics+SNHG15 組細(xì)胞活性和EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率降低（Plt;0. 05），TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞率升高（Plt;0. 05），細(xì)胞中Bax、cleaved caspase-3 和 cleaved caspase-9 蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 05），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平降低 （Plt;0. 05）。結(jié)論：Myod1可通過(guò)與SNHG15啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合進(jìn)而吸附miRNA-24，促進(jìn)OGD誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞的增殖抑制和細(xì)胞凋亡。

［關(guān)鍵詞］ 肌源性分化蛋白1； 小核仁RNA 宿主基因15； 微小RNA-24-3p； SH-SY5Y 細(xì)胞； 腦梗死

［中圖分類(lèi)號(hào)］ R743; R363. 2 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

腦血管病是與心肌梗死和惡性腫瘤并列的三大疾病，目前其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)［1］。在所有腦血管病患者中，腦梗死最為常見(jiàn)，約占陳舊性血管病的60%～70% ［2-3］。缺氧缺血不僅是腦梗死的主要原因，也是導(dǎo)致腦損傷的病理生理過(guò)程［4］。肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1 （metastasis-associated lungadenocarcinoma transcript 1， MALAT1）、HOX 轉(zhuǎn)錄反義RNA （HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）、H19 和小核仁RNA 宿主基因14（small nuclear RNA host gene 14， SNHG14） 等多種長(zhǎng)鏈非編碼RNAs （long non-coding RNAs，lncRNAs） 在缺血性腦損傷過(guò)程中異常表達(dá)［5-10］。近期研究［11-13］ 表明： 小核仁RNA 宿主基因15（small nuclear RNA host gene 15， SNHG15） 可作為微小RNA （microRNA， miRNAs） 的“ 分子海綿”在脊柱結(jié)核、缺血性中風(fēng)和心力衰竭中發(fā)揮作用。此外， 急性腦缺血患者外周血中SNHG15 表達(dá)上調(diào)［14］。盡管上述研究提示SNHG15 可能在腦梗死中發(fā)揮作用，但其確切的生物學(xué)效應(yīng)和機(jī)制尚未明確， 同時(shí)Myod1 在腦梗死患者腦組織中的表達(dá)水平和功能尚不清楚。本研究通過(guò)對(duì)比腦梗死患者和正常對(duì)照者外周血中Myod1 和SNHG15 mRNA表達(dá)水平的差異， 并分析其在氧糖剝奪（oxygenglucosedeprivation， OGD） 細(xì)胞模型中的作用，旨在揭示Myod1 和SNHG15 在腦梗死中的作用及其分子機(jī)制，為腦梗死患者的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1. 1 外周血標(biāo)本來(lái)源

收集來(lái)自齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院19 例缺血性腦梗死患者（缺血性腦梗死組） 的外周血樣本， 同時(shí)收集19 例同期參加體檢的健康人外周血樣本作為正常對(duì)照組。本研究已獲得齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書(shū)。

1. 2 細(xì)胞、主要試劑和儀器

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y 細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。胎牛血清、MEM 培養(yǎng)基和F-12 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，RNAiso 試劑和實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-timefluorescence quantitative PCR， RT-qPCR） 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司， 靶向Myod1 和SNHG15 的小干擾RNA （small interfering RNA，siRNA） 質(zhì)粒（si-Myod1 和si-SNHG15） 及陰性對(duì)照質(zhì)粒（si-NC）、miR-24-3p 模擬物（miR-mimics）和miR-NC 質(zhì)粒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建，Lipofectamine 2000 試劑和引物購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，pGL3-Basic 和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Promega 公司， CCK-8 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒購(gòu)自日本Dojindo 公司， 5- 乙炔基-2'- 脫氧尿苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU） 增殖檢測(cè)試劑盒、原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法（TdT-mediated dUTP nickend labeling， TUNEL） 染色試劑盒和染色質(zhì)免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation， CHIP）分析試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，裂解的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 （cleavedcysteinyl aspartate specific proteinase-3， cleavedcaspase-3）、裂解的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9 （cleaved cysteinyl aspartate specificproteinase-9， cleaved caspase-9）、B 細(xì)胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2， Bcl-2） 和Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein， Bax） 抗體購(gòu)自美國(guó)CST 公司， GAPDH 抗體和HRP-羊抗兔IgG 購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。Mx3000P 定量PCR 儀（美國(guó)Agilent 公司）， Infinite F50 酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）， BX51 熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）， Microtek 中晶BIO-6000 平板式凝膠成像掃描儀（上海中晶科技有限公司）。

1. 3 OGD細(xì)胞模型制備

將 SH-SY5Y細(xì)胞接種于含10% 胎牛血清和1% 鏈霉素- 青霉素的45%MEM 培養(yǎng)基和45%F-12 培養(yǎng)基中，于常規(guī)條件（95% 大氣， 5%CO2， 37 ℃） 下培養(yǎng)。按參考文獻(xiàn)［15］ 中的方法構(gòu)建OGD 細(xì)胞模型：生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SH-SY5Y 細(xì)胞置于缺糖培養(yǎng)基中并轉(zhuǎn)移至無(wú)氧環(huán)境（5%CO2，95%N2，37 ℃） 中孵育6 h，作為OGD 組。同時(shí)設(shè)正常培養(yǎng)的SH-SY5Y 細(xì)胞為對(duì)照組。

1. 4 RT-qPCR法檢測(cè)外周血和 SH-SY5Y細(xì)胞中Myod1和SNHG15 mRNA表達(dá)水平

采用RNAiso試劑從外周血中和SH-SY5Y 細(xì)胞中提取總RNA。將 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。 加模板和引物，采用RT-qPCR 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。引物序列： Myod1，正向引物5'-CGG-CATGATGGACTACAGCG-3'，反向引物5'-CAGGC-AGTCTAGGCTCGAC-3'；SNHG15， 正向引物5'- GGTCTTCGGCAGTCTAGTCA-3'， 反向引物5'-CAGGAACTGGCAGCTAACAC-3'； GAPDH， 正向引物5'-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3'，反向引物5'-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3'。反應(yīng)條件：95 ℃、2 min；94 ℃、20 s， 58 ℃、20 s， 72 ℃ 20 s， 40 個(gè)循環(huán)。以 GAPDH 為內(nèi)參， 采用 2-△△Ct 法計(jì)算目的基因mRNA 表達(dá)水平。

1. 5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組

將Myod1編碼序列克隆至pcDNA3. 0 質(zhì)粒中（pcDNA3. 0-Myod1） ， 以pcDNA3. 0 空載體質(zhì)粒（Vector） 作為陰性對(duì)照。按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)操作步驟，用Lipofectamine 2000試劑將si-Myod1、pcDNA3. 0-Myod1、si-SNHG15、pcDNA3. 0-SNHG15、si-NC、Vector、miR-mimics和miR-NC 分別轉(zhuǎn)染入SH-SY5Y 細(xì)胞， 48 h后收集各組細(xì)胞經(jīng) Western blotting 法驗(yàn)證SH-SY5Y 細(xì)胞中Myod1 過(guò)表達(dá)和敲低效率。將上述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行OGD 處理， 分為對(duì)照組、OGD 組、OGD+Vector 組、 OGD+Myod1 組、OGD+si-NC 組、 OGD+si-Myod1 組、OGD+si-SNHG15 組、OGD+si-SNHG15+Vector 組、OGD+si-SNHG15+Myod1 組、OGD+miR-NC 組、OGD+miR-mimics組、OGD+miR-mimics+Vector組和OGD+miR-mimics+SNHG15 組。

1. 6 雙 熒 光 素 酶 報(bào) 告 基 因 實(shí) 驗(yàn) 驗(yàn) 證 Myod1 與SNHG15及SNHG15與miR-24-3p的靶向關(guān)系

由Starbase 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//starbase. sysu. edu. cn/）預(yù)測(cè) miR-24-3p 與 SNHG15 的結(jié)合區(qū)域。 將SNHG15 的野生型啟動(dòng)子區(qū)域片段及預(yù)測(cè)的SNHG15-3'非翻譯區(qū)（untranslated regions，UTR）區(qū)域片段分別克隆至pGL3-Basic 中構(gòu)建各自的pGL3-SNHG15 野生型（pGL3-SNHG15-WT） 載體質(zhì)粒。將SNHG15 的突變啟動(dòng)子區(qū)域片段和突變SNHG15-3' UTR 片段克隆至pGL3-Basic 中，分別構(gòu)建pGL3-SNHG15 突變型（pGL3-SNHG15-MUT） 載體質(zhì)粒。將 pGL3-SNHG15-WT 和pGL3-SNHG15-MUT （100 ng） 分別與pcDNA3. 0-Myod1 （1 mg·L-1）、 pcDNA3. 0（Vector， 1 mg·L-1） 質(zhì)粒及miR-NC、miR-mimics共同轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y 細(xì)胞（6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，密度為1. 0×106 cm-2） 中。48 h 后，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)并分析各組SH-SY5Y 細(xì)胞熒光素酶活性。

1. 7 CHIP 法評(píng)估 Myod1 與 SNHG15 之間的關(guān)聯(lián)

由美國(guó)Invitrogen 公司根據(jù)JASPAR 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//jaspar. genereg. net/） 預(yù)測(cè)的Myod1 與SNHG15 結(jié)合區(qū)域設(shè)計(jì)引物。按照CHIP 分析試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將SH-SY5Y 細(xì)胞交聯(lián)后進(jìn)行胞核制備和核染色質(zhì)消化，留取部分染色質(zhì)制備物稀釋后作為input 組，再分別設(shè)置IgG 組和Myod1 組；染色質(zhì)洗脫解交聯(lián)后進(jìn)行DNA 回收純化，分別將上述3 組DNA 純化產(chǎn)物用結(jié)合位點(diǎn)的引物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為電壓110 V 和電流 40 mA，待電泳條帶到達(dá)凝膠合適位置時(shí)停止電泳，在凝膠成像掃描儀中曝光拍照并對(duì)灰度值進(jìn)行分析。

1. 8 CCK-8法和EdU染色法檢測(cè)各組細(xì)胞活性和EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率

采用 CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞活性：按說(shuō)明書(shū)中方法，各組細(xì)胞培養(yǎng)24、48 和72 h 后， 加入CCK-8 試劑， 采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)處吸光度（A） 值，以A 值代表各組細(xì)胞活性。采用EdU 增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞中EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率： 按說(shuō)明書(shū)中方法， 各組細(xì)胞加入EdU 試劑孵育2 h， 用DAPI 染色標(biāo)記細(xì)胞核， 熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)EdU 陽(yáng)性細(xì)胞， 并計(jì)算每個(gè)視野中EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率。EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率=EdU 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1. 9 TUNEL 染色法檢測(cè)各組細(xì)胞 TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞率

各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后加入TUNEL檢測(cè)試劑，在室溫避光條件下染色30 min，用DAPI 染色標(biāo)記細(xì)胞核， 熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算每個(gè)視野中TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞率，代表細(xì)胞凋亡情況。TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞率=TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1. 10 Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞中Myod1、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bax 和Bcl-2蛋白表達(dá)水平

提取各組細(xì)胞總蛋白，在 10%SDS-PAGE 中進(jìn)行分離并將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上， 用5% 脫脂奶的封閉處理。加一抗（Myod1、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bax 和Bcl-2，1∶1 000） 和兔抗-GAPDH 單克隆抗體（1∶10 000）孵育過(guò)夜，TBST洗滌（共3次，每次5 min）。加HRP羊抗兔IgG （1∶2 000） 孵育2 h，洗滌。用ECL 發(fā)光底物使條帶曝光， 用凝膠成像掃描儀成像。采用Image J 軟件計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平= 目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 蛋白條帶灰度值；驗(yàn)證SH-SY5Y 細(xì)胞中Myod1 過(guò)表達(dá)和敲低效率時(shí)， Myod1 蛋白表達(dá)水平=Myod1 蛋白條帶灰度值/GAPDH 蛋白條帶灰度值×100%。

1. 11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。缺血性正常對(duì)照組研究對(duì)象和腦梗死組患者外周血中Myod1 和SNHG15 mRNA 表達(dá)水平，各組細(xì)胞活性、EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率、TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞率、熒光素酶活性和Myod1 及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以-x±s 表示，2 組間樣本均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析， 組間樣本均數(shù)兩兩比較采用Bonferroni 法。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 正常對(duì)照組研究對(duì)象和缺血性腦梗死組患者外周血中及2組SH-SY5Y細(xì)胞中Myod1和SNHG15mRNA 表達(dá)水平

與正常對(duì)照組 （1. 18±0. 80和1. 21±0. 89） 比較，腦梗死組患者外周血中Myod1和SNHG15 mRNA 表達(dá)水平（2. 19±0. 93 和3. 43±1. 40） 均升高（Plt;0. 05）。采用OGD 細(xì)胞模型模擬體外腦缺血模型，與對(duì)照組（1. 01±0. 13和1. 00±0. 11） 比較， OGD 組SH-SY5Y 細(xì)胞中Myod1 和SNHG15 mRNA 表達(dá)水平（9. 57±0. 69和5. 88±0. 37） 均升高（Plt;0. 05）。

2. 2 各組 SH-SY5Y 細(xì)胞中 Myod1蛋白表達(dá)水平

與Vector 組（102. 65% ± 14. 05%） 比較，pcDNA3. 0-Myod1 組SH-SY5Y 細(xì)胞中Myod1 蛋白表達(dá)水平（406. 53%±36. 28%） 升高（t=9. 732，Plt;0. 05）。與si-NC 組（99. 79%±10. 12%） 比較，si-Myod1 組SH-SY5Y 細(xì)胞中Myod1 蛋白表達(dá)水平（21. 36%±3. 41%） 降低（t=13. 124， Plt;0. 05）。見(jiàn)圖1。

2. 3 過(guò)表達(dá)和敲低 Myod1后各組細(xì)胞活性、EdU陽(yáng)性細(xì)胞率和 TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞率

與對(duì)照組比較，48 和72 h 時(shí)OGD 組細(xì)胞活性及EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率降低（Plt;0. 05），TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞率升高（Plt;0. 05）。與OGD 組比較， 48 和72 h 時(shí)OGD+Myod1 組細(xì)胞活性和EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率降低（Plt;0. 05）， TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞率升高（Plt;0. 05）；OGD+si-Myod1 組細(xì)胞活性和EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率升高（Plt;0. 05）， TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞率降低（Plt;0. 05）。見(jiàn)圖2、3 和表1～3。

2. 4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和 CHIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Myod1 與 SNHG15 之 間 的 關(guān) 聯(lián)

與 pcDNA3. 0-vector 組（1. 03±0. 09） 比較， pcDNA3. 0-Myod1組細(xì)胞中SNHG15 mRNA 表達(dá)水平（16. 98±0. 96） 升高（Plt;0. 05）。與si-NC 組（1. 00±0. 06）比較， si-Myod1 組細(xì)胞中 SNHG15 mRNA 表達(dá)水平（0. 43±0. 03） 降低（Plt;0. 05）。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)： SNHG15 的啟動(dòng)子區(qū)域有Myod1 的結(jié)合位點(diǎn)（圖4A）。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示： 與pcDNA3. 0-Vector+pGL3-SNHG15-WT 組（1. 02±0. 10） 比較， pcDNA3. 0-Myod1+pGL3-SNHG1515-WT 組細(xì)胞熒光素酶活性（1. 98±0. 05） 升 高（Plt;0. 05）；與 pcDNA3. 0-Vector+pGL3-SNHG15-MUT 組（0. 97 ± 0. 16） 比 較，pcDNA3. 0-Myod1+pGL3-SNHG15-MUT 組細(xì)胞熒光素酶活性（0. 98±0. 05） 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。CHIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Myod1在SNHG15啟動(dòng)子區(qū)域上調(diào)（圖4B）。

2. 5 敲低SNHG15和過(guò)表達(dá)Myod1后各組細(xì)胞活性、EdU陽(yáng)性細(xì)胞率、TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率和細(xì)胞中凋 亡 相 關(guān) 蛋 白 表 達(dá) 水 平

與 si-NC 組 （1. 03±0. 06） 比較，si-SNHG15 組細(xì)胞中SNHG15 mRNA表達(dá)水平（0. 25±0. 04） 降低（t=10. 496， Plt;0. 05）。與對(duì)照組比較， 48 和72 h 時(shí)OGD 組細(xì)胞活性和EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率降低（Plt;0. 05），TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率升高（Plt;0. 05），細(xì)胞中Bax、cleavedcaspase-3 和cleaved caspase-9 蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 05），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0. 05）；與OGD 組比較，48 和72 h 時(shí)OGD+si-SNHG15 組SH-SY5Y 細(xì)胞活性和EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率升高（Plt;0. 01），TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞率降低（Plt;0. 01），細(xì)胞中Bax、cleaved caspase-3 和cleaved caspase-9 蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0. 01），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 01）； 與OGD+si-SNHG15 組比較，48 和72 h 時(shí)OGD+si-SNHG15+Myod1 組細(xì)胞活性和EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率降低（Plt;0. 05）， TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率升高（Plt;0. 05），細(xì)胞中Bax、cleavedcaspase-3 和 cleaved caspase-9 蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 05），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0. 05）。見(jiàn)表4～6 和圖5。

2. 6 SNHG15與 miR-24-3p的靶向關(guān)系

Starbase軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：SNHG15 與miR-24-3p 具有靶向關(guān)系， SNHG15 可吸附miR-24-3p （圖6A）。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示： 與miR-NC+SNHG15-3'UTR-W T 組 比 較， miR-mimics+SNHG15-3'UTR-WT 組細(xì)胞熒光素酶活性降低（Plt;0. 05）； 與 miR-NC+SNHG15-3'UTR-MUT組比較，miR-mimics+SNHG15-3'UTR-MUT 組細(xì)胞熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）（圖6B）。

2. 7 過(guò)表達(dá) miR-24-3p和 SNHG15后各組細(xì)胞活性、EdU陽(yáng)性細(xì)胞率、TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率和細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，48和72 h時(shí)OGD 組細(xì)胞活性和EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率降低（Plt;0. 05）， TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞率升高（Plt;0. 05）， 細(xì)胞中Bax、cleaved caspase-3 和cleaved caspase-9 蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 05），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平降低 （Plt;0. 05）；與 OGD 組比較，48 和72 h 時(shí)OGD+miR-mimics 組細(xì)胞活性和EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率升高（Plt;0. 01）， TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞率降低（Plt;0. 01）， 細(xì)胞中Bax、cleaved caspase-3 和cleavedcaspase-9 蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0. 01）， Bcl-2 蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 01）；與OGD+miR-mimics組比較，48 和72 h 時(shí)OGD+miR-mimics+SNHG15組細(xì)胞活性和EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率降低（Plt;0. 05），TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞率升高（Plt;0. 05），細(xì)胞中Bax、cleaved caspase-3 和cleaved caspase-9 蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 05）， Bcl-2 蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0. 05）。見(jiàn)表7～9 和圖7。

3 討 論

腦缺血已被證實(shí)是造成腦梗死相關(guān)疾病腦損傷的主要原因［4］，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)果顯示：在腦梗死患者外周血和OGD 模型SH-SY5Y細(xì)胞中Myod1 表達(dá)上調(diào)， 表明Myod1 可能參與調(diào)節(jié)缺血性腦損傷。已有研究［11， 16-17］ 顯示：在急性腦卒中患者外周血、腦缺血相關(guān)的動(dòng)物模型和細(xì)胞模型中SNHG15 表達(dá)水平均上調(diào)， 敲低SNHG15 可減輕腦缺血相關(guān)的腦損傷。本研究結(jié)果顯示：腦梗死患者外周血和OGD 模型SH-SY5Y 細(xì)胞中Myod1 表達(dá)上調(diào)，同時(shí)伴隨著SNHG15 表達(dá)上調(diào)，且Myod1 與SNHG15 啟動(dòng)子區(qū)域存在結(jié)合位點(diǎn)，可形成DNA 結(jié)合異二聚體，進(jìn)而促進(jìn)SNHG15 表達(dá)；此外，敲低SNHG15 可部分減輕OGD 誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞增殖抑制和凋亡，而過(guò)表達(dá)Myod1可部分逆轉(zhuǎn)敲低SNHG15 的作用。本研究結(jié)果提示： Myod1 可能通過(guò)與SNHG15 啟動(dòng)子結(jié)合上調(diào)SNHG15 表達(dá)， 進(jìn)而參與調(diào)節(jié)腦缺血造成的腦損傷。

lncRNAs 可作為競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA （competingendogenous RNAs， ceRNA） 通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNAs 來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)［18-19］。本研究通過(guò)Starbase預(yù)測(cè)軟件和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)：SNHG15 為miR-24-3p 的ceRNA。miR-24-3p 與腦血管相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)［20-21］。在缺血性卒中中， miR-24-3p 抑制劑通過(guò)調(diào)節(jié)Bax、caspase-3 和熱休克蛋白70 （heat shock protein 70，HSP70） 表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡［20］。本研究結(jié)果顯示： miR-24-3p 過(guò)表達(dá)可促進(jìn)OGD 模型SH-SY5Y細(xì)胞增殖，并抑制其凋亡。miR-24-3p 可通過(guò)調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2、caspase-3 和caspase-9 相關(guān)的凋亡信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡［22-24］。本研究結(jié)果顯示：miR-24-3p可降低OGD 模型SH-SY5Y 細(xì)胞中Bax、cleavedcaspase-3 和cleaved caspase-9 蛋白表達(dá)水平， 并上調(diào)Bcl-2 蛋白表達(dá)水平，即miR-24-3p 對(duì)OGD 誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞凋亡具有改善作用， 而過(guò)表達(dá)SNHG15 能削弱miRNA-24-3p 的作用， 表明SNHG15 和miR-24-3p 參與調(diào)節(jié)OGD 誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞凋亡。

綜上所述，腦梗死患者外周血和OGD 細(xì)胞中Myod1 和 SNHG15 表 達(dá) 上 調(diào)。 Myod1 可 與SNHG15 啟動(dòng)子區(qū)域交聯(lián)進(jìn)而促進(jìn)SNHG15 表達(dá)，而SNHG15 作為miRNA-24-3p 的ceRNA， 可促進(jìn)OGD 誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞凋亡。

利益沖突聲明：

所有作者聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明：

冀方超參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)操作和論文撰寫(xiě)，張晨昕和任占軍參與實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)收集整理，潘云志參與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，逯琦參與論文撰寫(xiě)， 孫興元參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和論文審校。

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