［摘 要］ 目的：分析外泌體（Exo）微小RNA-761（miR-761）通過(guò)調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）極化對(duì)骨肉瘤（OS）細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）進(jìn)程的影響，闡明其相關(guān)的作用機(jī)制。方法：miR-761質(zhì)粒和陰性對(duì)照（miR-NC） 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HEK239 細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)不轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為對(duì)照組，實(shí)時(shí)熒光定量PCR （RT-qPCR） 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。分離含miR-761 的Exo，采用透射電鏡觀察Exo 形態(tài)，采用納米顆粒分析儀檢測(cè)Exo 樣品濃度和粒徑分布，Western blotting 法檢測(cè)Exo 表面標(biāo)志蛋白表達(dá)情況。采用佛波酯（PMA） 刺激人單核細(xì)胞白血病THP-1 細(xì)胞成為M0 巨噬細(xì)胞，采用含miR-761 的Exo 處理M0 巨噬細(xì)胞并與OS MG63 細(xì)胞建立共培養(yǎng)體系， 實(shí)驗(yàn)分組為M0 組、TAM 組、miR-761NC 組和miR-761 Exo 組，收集各組M0 巨噬細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中M1 巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD86 和M2 巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206 陽(yáng)性率，Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中M1 巨噬細(xì)胞分泌因子白細(xì)胞介素1β （IL-1β） 及腫瘤壞死因子α （TNF-α） 和M2 巨噬細(xì)胞分泌因子白細(xì)胞介素10 （IL-10）及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 （TGF-β1） 蛋白表達(dá)水平；采用含miR-761 的Exo 處理M0 巨噬細(xì)胞并與MG63 細(xì)胞建立共培養(yǎng)體系，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、TAM 組、miR-NC Exo+TAM 組和miR-761 Exo+TAM 組，收集各組MG63 細(xì)胞，免疫熒光染色法觀察各組MG63 細(xì)胞中E-鈣黏附蛋白（E-cadherin） 和波形蛋白（Vimentin） 熒光強(qiáng)度，Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin 及EMT 調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Twist1、Snail 和Slug 蛋白表達(dá)水平，Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組MG63 細(xì)胞中侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)。結(jié)果：通過(guò)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)成功獲得含miR-761的HEK239細(xì)胞，并分離得到Exo。與M0組比較，TAM 組巨噬細(xì)胞中CD86 陽(yáng)性率降低（Plt;0. 05）， CD206 陽(yáng)性率升高（Plt;0. 05）， IL-1β 和TNF-α蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0. 05）， IL-10 和TGF-β1 蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 05）； 與TAM 組比較，miR-761 Exo 組巨噬細(xì)胞中CD86 陽(yáng)性率升高（Plt;0. 05）， CD206 陽(yáng)性率降低（Plt;0. 05）， IL-1β 和TNF-α 蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 05），IL-10 和TGF-β1 蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0. 05）。與對(duì)照組比較，TAM 組MG63 細(xì)胞中E-cadherin 熒光表達(dá)強(qiáng)度減弱而Vimentin 熒光表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)，E-cadherin 蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0. 05），Vimentin、Twist1、Snail 和Slug 蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 05），遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)增加（Plt;0. 05）； 與 TAM 組比較， miR-761 Exo+TAM 組 MG63 細(xì)胞中E-cadherin 熒光表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)而Vimentin 熒光表達(dá)強(qiáng)度減弱， E-cadherin 蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 05），Vimentin、Twist1、Snail 和Slug 蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0. 05），遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)減少 （Plt;0. 05）。結(jié)論：Exo傳遞miR-761能夠抑制OS細(xì)胞EMT進(jìn)程，進(jìn)而抑制細(xì)胞的遷移和侵襲，其作用機(jī)制可能與調(diào)控TAM 極化作用有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］ 骨肉瘤； 微小RNA-761； 外泌體； 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化； 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞極化

［中圖分類號(hào)］ R738. 1 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

骨肉瘤（osteosarcoma，OS） 是常見(jiàn)的原發(fā)性骨惡性腫瘤，主要累及長(zhǎng)骨的干骺端［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球 OS 的新發(fā)病例約為每年每百萬(wàn)人中 1～3 例［2］。雖然OS 患者通?？梢圆捎檬中g(shù)和輔助化療進(jìn)行治療，但由于OS 具有高度異質(zhì)性，治療后易出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，且該部分OS 患者的5 年生存率低于20% ［3-4］。OS 的腫瘤微環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜且高度動(dòng)態(tài)的環(huán)境，由骨細(xì)胞、間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞、血管細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)等多種成分組成，OS 微環(huán)境的免疫細(xì)胞主要是腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor associated macrophage，TAM），TAM 通過(guò)多種途徑促進(jìn)OS 的發(fā)生和進(jìn)展，并具有保護(hù)腫瘤干細(xì)胞樣表型和促進(jìn)血管生成的作用［5］。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）是腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的初始階段，在腫瘤轉(zhuǎn)移期間，TAM 通過(guò)上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶水平來(lái)降解細(xì)胞外基質(zhì)， 并通過(guò)激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)刺激EMT［6］。

微小RNA （microRNA， miRNA） 是一組短的單鏈非編碼RNA，通過(guò)與mRNA 的3'非翻譯區(qū)（3' untranslated region， 3' UTR） 結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)［7］。研究［8-9］ 顯示：miRNA 表達(dá)變化與OS 細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等行為有密切關(guān)聯(lián)。miR-761 位于1p2 號(hào)染色體，通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因表達(dá)參與腫瘤進(jìn)展， 有研究［10］ 表明： miR-761通過(guò)靶向人CXC 趨化因子受體1 （C-X-Cchemokine receptor 1， CXCR1） 抑制OS 細(xì)胞增殖和侵襲，提示miR-761 在OS 中發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用。外泌體（exosome， Exo） 是直徑為40～100 nm 的囊泡， 其產(chǎn)生、組成、運(yùn)輸和遞送的機(jī)制已被廣泛研究， 并可作為內(nèi)源性信息載體［11］。本研究通過(guò)構(gòu)建Exo 傳遞miR-761 體系，探討其對(duì)OS 細(xì)胞中TAM 極化的影響， 并利用細(xì)胞共培養(yǎng)模型來(lái)驗(yàn)證Exo 傳遞miR-761 調(diào)控TAM 極化進(jìn)而介導(dǎo) EMT 的機(jī)制，以期為研究以Exo 為載體遞送miRNA 靶向調(diào)節(jié)OS 細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移進(jìn)而減緩OS 進(jìn)展提供一種新途徑。

1 材料與方法

1. 1 細(xì)胞和主要試劑

人源胚胎腎HEK239細(xì)胞、人單核細(xì)胞白血病THP-1 細(xì)胞和人OS MG63 細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（American TypeCulture Collection， ATCC）。DMEM 培養(yǎng)基、RPMI-1640 培養(yǎng)基、青-鏈霉素溶液和消化用胰酶（美國(guó)Gibco 公司），胎牛血清（美國(guó)Sigma 公司），LipofectamineTM 2000 Reagent 試劑盒（美國(guó)Thermo公司）， TRIzol 試劑盒（日本TaKaRa 公司），miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和miRcute 增強(qiáng)型miRNA 熒光定量檢測(cè)試劑盒［北京天根生化科技（北京） 有限公司］， Exo 提取試劑盒（北京百奧博萊科技有限公司）， RIPA 裂解液、 增強(qiáng)型 ECL 試劑液、DAPI 染料和結(jié)晶紫染料（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），BCA 蛋白定量試劑盒（北京凱詩(shī)源生物科技有限公司），0. 4 μm Transwell 小室和12. 0 μmTranswell 小室（美國(guó)iCell 公司）， Triton X-100（瑞士 Roche 公司）， Matrigel 膠（美國(guó) Corning 公司）， 流式抗體 FITC-CD206 和 PE-CD86 （美 國(guó)BD 公司），兔抗人 E-鈣黏蛋白（E-cadherin） 單克隆抗體、兔抗人波形蛋白（Vimentin） 單克隆抗體、兔抗人Snail 多克隆抗體、兔抗Slug 多克隆抗體、兔抗人GAPDH 多克隆抗體和Alexa Fluor 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體（英國(guó)Abcam 公司），兔抗人Twist1 單克隆抗體（美國(guó)Proteintech 公司）。miR-761 質(zhì)粒和陰性對(duì)照（miR-NC） 質(zhì)粒由生工生物工程（上海） 股份有限公司設(shè)計(jì)構(gòu)建。

1. 2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

HEK239細(xì)胞和 MG63細(xì)胞分別接種于DMEM 培養(yǎng)基中，THP-1 細(xì)胞接種于RPMI-1640 培養(yǎng)基中， 各培養(yǎng)基均含有10% 胎牛血清和1% 青-鏈霉素溶液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育， 0. 25% 胰酶消化，常規(guī)傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HEK239 細(xì)胞，PBS 緩沖液洗滌，調(diào)整密度后按照每孔1×105 個(gè)細(xì)胞的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板過(guò)夜培養(yǎng)，將miR-761 質(zhì)粒和miR-NC質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HEK239 細(xì)胞中，為miR-761 組和miR-NC 組，同時(shí)設(shè)未轉(zhuǎn)染的HEK239 細(xì)胞為對(duì)照組， 按照LipofectamineTM 2000 Reagent 試劑盒說(shuō)明書步驟操作，采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR （real-timefluorescence quantitative PCR， RT-qPCR） 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中miR-761 表達(dá)水平，以確定轉(zhuǎn)染是否成功。

1. 3 含miR-761的Exo提取和鑒定

將轉(zhuǎn)染后的HEK239 細(xì)胞收集于無(wú)菌離心管中， 4 ℃、4 500 r·min-1 離心15 min， 獲取上清， 移至新離心管， 4 ℃ 、12 000 r·min-1 離心20 min， 獲取上清，移至另一新離心管。在上清中加入等體積提取液A，渦 旋 混 勻， 4 ℃ 靜 置 過(guò) 夜。 次 日， 4 ℃ 、12 000 r·min-1 離心60 min， 棄上清， 保留沉淀物，吸取適量保存液B 重懸沉淀物，即獲得 Exo 懸液，－20 ℃保存?zhèn)溆?。取適量Exo，滴入載樣銅網(wǎng)，2%醋酸雙氧乙鈾溶液染色，雙蒸水清洗后晾干， 透射電鏡觀察Exo 形態(tài)表現(xiàn)。將Exo 懸液緩慢注入納米顆粒分析儀中，根據(jù)納米微粒的布朗運(yùn)動(dòng)成像測(cè)定樣品濃度和粒徑分布。

1. 4 RT-qPCR 法檢測(cè)HEK239 細(xì)胞中和 Exo 中miR-761表達(dá)水平

收集轉(zhuǎn)染后的 HEK239細(xì)胞，TRIzol 法提取各組細(xì)胞或Exo 樣本總RNA， 核酸微量測(cè)定儀檢測(cè)總 RNA 的濃度和純度。取A （260） /A （280） 值范圍為1. 8～2. 0 的RNA，設(shè)計(jì)特異性反轉(zhuǎn)錄引物，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以合成cDNA。以U6 為內(nèi)參， 定量檢測(cè)各樣本中miR-761 表達(dá)水平， 嚴(yán)格按照miRcute 增強(qiáng)型miRNA 熒光定量試劑盒操作， 將配制好的反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至Bio-RadCFX96 系統(tǒng)內(nèi)， 反應(yīng)程序： 95 ℃ 起始模板變性15 min；94 ℃變性20 s、60 ℃退火延伸34 s，循環(huán)45 次。擴(kuò)增結(jié)束后， 分析溶解曲線， 采用2-ΔΔCt 法計(jì)算細(xì)胞或Exo 中miR-761 表達(dá)水平。引物序列：miR-761，上游引物5'-ACAGCAGGCACAGAC- 3'，下游引物5'-GAGCAGGCTGGAGAA-3'； U6， 上游引物5'-TCCGATCGTGAAGCGTTC-3'， 下游引物5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。

1. 5 Western blotting 法 檢 測(cè) Exo 標(biāo) 志 蛋 白 和MG63細(xì)胞中相關(guān)目的蛋白表達(dá)水平

采用 RIPA蛋白裂解液提取Exo 或不同分組處理THP-1 細(xì)胞和MG63 細(xì)胞的總蛋白， BCA 法對(duì)蛋白定量。蛋白通過(guò)沸水浴變性，制備10%SDS-PAGE 凝膠，每孔上樣等量40 μg 蛋白進(jìn)行垂直電泳，結(jié)束后將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，恒流轉(zhuǎn)膜2 h。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，以兔抗CD9、CD63、CD81、腫瘤易感基因101 （tumor susceptibility gene 101，TSG101）、白細(xì)胞介素1β （interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素10 （interleukin-10， IL-10）、 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 （transforming growth factor- β1， TGF- β1）、E-cadherin、Vimentin、Twist1、Snail 和Slug 多克隆抗體（1∶ 1 000） 作為一抗加至膜上， 4 ℃ 過(guò)夜。次日取膜復(fù)溫， TBST 洗膜， 加入對(duì)應(yīng)二抗（1∶ 5 000）， 常溫孵育2 h， TBST 洗膜， 增強(qiáng)型ECL 液顯影， 紫外凝膠儀上進(jìn)行圖像掃描， 觀察各蛋白條帶。以GAPDH 作為內(nèi)參， 采用Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1. 6 含 miR-761 的 Exo 處 理 THP-1 細(xì) 胞 及 與MG63細(xì)胞共培養(yǎng)體系的制備

采用THP-1細(xì)胞模擬巨噬細(xì)胞形成，將細(xì)胞按照每孔5×105個(gè)的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 加入終濃度150 μg·L-1PMA 刺激 THP-1 細(xì)胞， 24 h 后得到未活化的M0 巨噬細(xì)胞。以M0 巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，將OSMG63 細(xì)胞按照每孔5×105 個(gè)細(xì)胞的密度接種于孔徑為0. 4 μm 的Transwell 小室上層，將不同處理的M0 巨噬細(xì)胞按照每孔5×105 個(gè)細(xì)胞的密度分別接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中；二者均置于37 ℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中，分開(kāi)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，將貼有MG63 細(xì)胞的上室移至含M0 巨噬細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板中，建立上下雙層細(xì)胞共培養(yǎng)體系［12］。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、TAM 組、miR-NC Exo組和miR-761 Exo組。M0組：上室僅有培養(yǎng)基無(wú)MG63 細(xì)胞，下層為M0 巨噬細(xì)胞； TAM 組： 上室為MG63 細(xì)胞， 下層為M0 巨噬細(xì)胞；miR-NC Exo 組：上室為MG63 細(xì)胞，下層為含終濃度20 mg·L-1 miR-NC Exo 的M0 巨噬細(xì)胞；miR-761 Exo 組： 上室為MG63 細(xì)胞， 下層為含終濃度20 mg·L-1 miR-761 Exo 的M0 巨噬細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集各組下室細(xì)胞檢測(cè)其極化狀態(tài)。

1. 7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組M0巨噬細(xì)胞中CD86和CD206 陽(yáng)性率

收集“1. 6”中獲得的各組下室細(xì)胞， 0. 25% 胰酶消化， PBS 緩沖液洗滌， 4 ℃、4 000 r·min-1 離心10 min 后， 4% 多聚甲醛固定；PBS 緩沖液洗滌，4 ℃、4 000 r·min-1 離心10 min，采用0. 1% Triton X-100 通透處理5 min；PBS 緩沖液洗滌， 再次離心后， 添加100 μL PBS 緩沖液重懸沉淀，加入FITC-CD206 抗體和PE-CD86 抗體，常溫避光孵育60 min，PBS 緩沖液洗滌，添加流式緩沖液重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組M0 巨噬細(xì)胞中CD86 和CD206 陽(yáng)性率，可反映巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)。

1. 8 MG63 細(xì)胞分組和處理方法

MG63 細(xì)胞分為對(duì)照組、TAM 組、miR-NC Exo+TAM 組和miR-761 Exo+TAM 組。按照“1. 6” 中方法建立雙層細(xì)胞共培養(yǎng)體系： 對(duì)照組， 在孔徑為0. 4 μm的Transwell 上室接種MG63 細(xì)胞， 下室僅有培養(yǎng)基；TAM 組，上室接種MG63 細(xì)胞，下層細(xì)胞培養(yǎng)板接種M0 巨噬細(xì)胞； miR-NC Exo+TAM 組，上室接種MG63 細(xì)胞，下層細(xì)胞培養(yǎng)板接種含終濃度20 mg·L-1 miR-NC Exo 處理的M0 巨噬細(xì)胞；miR-761 Exo+TAM 組，上室接種MG63 細(xì)胞，下層細(xì)胞培養(yǎng)板接種含終濃度20 mg·L-1 miR-761Exo 處理的M0 巨噬細(xì)胞。處理結(jié)束后，收集各組MG63 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1. 9 免 疫 熒 光 染 色 法 檢 測(cè) 各 組 MG63 細(xì) 胞 中E-cadherin和Vimentin熒光強(qiáng)度

將處理后的各組MG63 細(xì)胞接種至防脫載玻片上， 37 ℃ 、5%CO2條件下培養(yǎng)12 h。PBS 緩沖液洗滌，4% 多聚甲醛固定， 0. 1%Triton X-100 通透處理10 min， 采用10% 山羊血清常溫孵育 2 h， 加入稀釋的兔抗人E-cadherin 單克隆抗體（1∶ 200） 和兔抗人Vimentin 單克隆抗體（1∶200），4 ℃過(guò)夜。次日，PBS 緩沖液洗滌， 加入稀釋的Alexa Fluor 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體（1∶500），常溫孵育1 h。PBS緩沖液洗滌， DAPI 避光染核， 清洗多余染料后，防淬滅封片劑封固，自然晾干，采用熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞中蛋白表達(dá)熒光強(qiáng)度。

1. 10 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組 MG63細(xì)胞中侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)

細(xì)胞分組同上。在孔徑為12. 0 μm 的Transwell 小室上層加入適量Matrigel膠， 置于37 ℃恒溫箱內(nèi)待膠凝固。0. 25% 胰酶消化處理后的MG63 細(xì)胞，按照每孔2×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于含24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的Transwell 小室上層，下層加入500 μL 含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液。將Transwell 小室體系置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后取出，棄培養(yǎng)液，棉簽擦去上室未穿孔細(xì)胞， PBS 緩沖液洗滌， 4% 多聚甲醛固定， 0. 1% 結(jié)晶紫染色10 min， PBS 緩沖液洗滌，中性樹(shù)膠封固，自然晾干，采用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞穿過(guò)小室情況，隨機(jī)選擇6 個(gè)視野統(tǒng)計(jì)侵襲細(xì)胞數(shù)，結(jié)果取平均數(shù)。檢測(cè)遷移細(xì)胞數(shù)時(shí)除不在上層鋪Matrigel 膠外，其余操作均與上述方法一致。

1. 11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 GraphPad Prism 8. 30 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組HEK239 細(xì)胞中miR-761 表達(dá)水平，各組巨噬細(xì)胞中CD86 和CD206陽(yáng)性表達(dá)率及IL-1β、TNF-α、IL-10 和TGF-β1 蛋白表達(dá)水平， 各組 MG63 細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin、Twist1、Snail 和Slug 蛋白表達(dá)水平，各組MG63 細(xì)胞中侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)均符合正態(tài)分布， 以-x±s 表示， 多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 轉(zhuǎn)染后 HEK239 細(xì)胞中 miR-761 表達(dá)水平

與 對(duì) 照 組 和 miR-NC 組 比 較， miR-761 組HEK239 細(xì)胞中miR-761 表達(dá)水平均升高（Plt;0. 05）。見(jiàn)圖1。

2. 2 含 miR-761的 Exo提取和鑒定結(jié)果

透射電鏡下觀察： 提取的顆粒物呈圓形或橢圓形囊泡結(jié)構(gòu)， 大多徑粒分布在100 nm 左右（圖2A～2D）。Exo 標(biāo)志蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示： 轉(zhuǎn)染 miR-NC 和miR-761 的HEK239 細(xì)胞中CD9、CD63、CD81 和TSG101 蛋白表達(dá)水平均明顯低于轉(zhuǎn)染miR-NC 和miR-761 的HEK239 細(xì)胞來(lái)源Exo （圖2E）。轉(zhuǎn)染miR-761 細(xì)胞來(lái)源的Exo 中miR-761 表達(dá)水平高于轉(zhuǎn)染miR-NC 細(xì)胞來(lái)源的Exo （Plt;0. 05）（圖2F）。以上結(jié)果表明：成功分離到含miR-761 的Exo。

2. 3 各組巨噬細(xì)胞中極化相關(guān)蛋白陽(yáng)性率和極化相關(guān)細(xì)胞因子蛋白表達(dá)水平

與M0組比較，TAM組巨噬細(xì)胞中M1 巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD86 陽(yáng)性率降低（Plt;0. 05）， M2 巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206 陽(yáng)性率升高（Plt;0. 05）； 與TAM 組比較， miR-761 Exo 組細(xì)胞中CD86 陽(yáng)性率升高（Plt;0. 05），CD206 陽(yáng)性率降低（Plt;0. 05）， miR-NC Exo 組細(xì)胞中CD86和CD206 陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見(jiàn)圖3 和表1。

與M0 組比較， TAM 組巨噬細(xì)胞中IL-1β 和TNF- α 蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0. 05）， IL-10 和TGF-β1 蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 05）；與TAM 組比較，miR-761 Exo 組細(xì)胞中IL-1β 和TNF-α 蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 05）， IL-10 和TGF-β1 蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0. 05），miR-NC Exo 組上述各蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見(jiàn)圖4。

2. 4 各組 MG63細(xì)胞中 E-cadherin和 Vimentin熒光強(qiáng)度

與對(duì)照組比較，TAM 組 MG63 細(xì)胞中E-cadherin 熒光強(qiáng)度減弱，Vimentin 熒光強(qiáng)度增強(qiáng)；與TAM 組比較，miR-761 Exo+TAM 組MG63 細(xì)胞中E-cadherin 熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，Vimentin 熒光強(qiáng)度減弱，miR-NC Exo+TAM 組MG63細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin 熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化。見(jiàn)圖5。

2. 5 各 組 MG63 細(xì) 胞 中 E-cadherin、Vimentin、Twist1、Snail和 Slug 蛋白表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，TAM 組MG63 細(xì)胞中E-cadherin 蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0. 05），Vimentin、Twist1、Snail 和Slug蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 05）； 與TAM 組比較，miR-761 Exo+TAM 組MG63 細(xì)胞中E-cadherin 蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 05）， Vimentin、Twist1、Snail 和 Slug 蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0. 05），miR-NC Exo+TAM 組MG63 細(xì)胞中上述各蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見(jiàn)圖6。

2. 6 各組 MG63細(xì)胞中侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)

與對(duì)照組比較，TAM 組MG63 細(xì)胞中侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)增加（Plt;0. 05）； 與 TAM 組比較， miR-761Exo+TAM 組MG63 細(xì)胞中侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)減少（Plt;0. 05）， miR-NC Exo+TAM 組MG63 細(xì)胞中侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見(jiàn)圖7 和8。

3 討 論

TAM 通過(guò)特異性分化可以進(jìn)化成2 種不同的極化狀態(tài)：經(jīng)典活化的M1 型和替代活化的M2 型。在腫瘤微環(huán)境中， M1 型 TAM 可由干擾素 γ（interferon-γ，IFN-γ）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 和TNF- α 等細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生， M1 型TAM 表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗原呈遞能力，具有促進(jìn)輔助性T 細(xì)胞（T helper cell，Th1） 免疫反應(yīng)、吞噬細(xì)菌及病毒和殺死腫瘤細(xì)胞的作用， 并分泌白細(xì)胞介素6 （interleukin-6， IL-6）、白細(xì)胞介素 23（interleukin-23， IL-23）、活性氧（reactive oxygenspecies，ROS） 及其他參與炎癥反應(yīng)并發(fā)揮抗腫瘤免疫作用的炎癥介質(zhì)， 進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［13］。在白細(xì)胞介素4 （interleukin-4，IL-4）、IL-10、白細(xì)胞介素13 （interleukin-13， IL-13） 和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)下可以促進(jìn)TAM 向M2 型極化， M2 型TAM 分泌IL-10 和TGF-β1 等抗炎細(xì)胞因子，促進(jìn)血管生成、組織重塑、組織損傷修復(fù)和腫瘤生長(zhǎng)［14］。在腫瘤微環(huán)境中，TAM 主要具有M2 樣巨噬細(xì)胞的表型，通過(guò)促進(jìn)腫瘤血管生成或間接誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞之間的相互作用來(lái)促進(jìn)腫瘤免疫抑制。已有研究［15］ 表明： M1 型TAM 抑制OS 轉(zhuǎn)移，而M2 型TAM 通過(guò)分泌相關(guān)細(xì)胞因子促進(jìn)OS 轉(zhuǎn)移。TAM 極化是一種高度可塑性的生理過(guò)程，因此使用藥物或天然免疫制劑通過(guò)改變其表型甚至抑制TAM 向M2 型極化，有望成為OS 新的治療方式。

作為一種通用調(diào)節(jié)因子， miRNA 在功能上參與多種關(guān)鍵的細(xì)胞過(guò)程， 包括 TAM 極化。miR-195-5p 通過(guò)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞中GATA 結(jié)合蛋白3 （GATA binding protein 3， GATA3） 介導(dǎo)的IL-4 分泌途徑來(lái)抑制TAM 向M2 型極化，并有助于TAM 向M1 型極化，起到了抑制結(jié)直腸癌體內(nèi)外生長(zhǎng)的作用［16］； miR-498 可抑制鼠雙微體2（murine double minute 2， MDM2） 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活因子3 （activating transcription factor 3， ATF3）降解，進(jìn)而抑制食管癌中TAM 自噬和向M2 表型極化， 對(duì)食管癌進(jìn)展起到抑制作用［17］； 巨噬細(xì)胞中的miR-182 誘導(dǎo)其向M2 型極化，在乳腺癌小鼠模型和巨噬細(xì)胞中敲除 miR-182 會(huì)抑制 TAM 向M2 型極化，從而抑制M2 型TAM 發(fā)揮的促腫瘤作用［18］。由于Exo 體積小、穩(wěn)定性強(qiáng)、免疫原性低和生物相容性高等特點(diǎn)，已被作為納米級(jí)載體在研究中廣泛使用［19-20］。將調(diào)控TAM 極化的miRNA通過(guò)Exo 遞送至腫瘤微環(huán)境中，可影響腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。本研究中，采用PMA 刺激THP-1 細(xì)胞產(chǎn)生M0 型巨噬細(xì)胞， 并與OS MG63 細(xì)胞建立共培養(yǎng)體系，結(jié)果顯示：巨噬細(xì)胞中M1 巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD86 陽(yáng)性率降低， M2 巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206 陽(yáng)性率升高， M1 巨噬細(xì)胞分泌因子IL-1β 和TNF-α蛋白表達(dá)下調(diào)， M2 巨噬細(xì)胞分泌因子 IL-10 和TGF-β1 蛋白表達(dá)上調(diào)， 表明OS MG63 細(xì)胞可誘導(dǎo)TAM 向M2 型極化；含miR-761 Exo 的M0 型巨噬細(xì)胞與OS MG63 細(xì)胞建立共培養(yǎng)體系培養(yǎng)后，巨噬細(xì)胞中M1 巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD86 陽(yáng)性率升高，M2 巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206 陽(yáng)性率降低， M1 巨噬細(xì)胞分泌因子IL-1β 和TNF- α 蛋白表達(dá)上調(diào)而M2 巨噬細(xì)胞分泌因子IL-10 和TGF-β1 蛋白表達(dá)下調(diào)， 表明Exo 傳遞的miR-761 可能抑制TAM 向M2 型極化并促進(jìn)TAM 向M1 型極化。

EMT 是細(xì)胞失去上皮特征并獲得間充質(zhì)特性的過(guò)程，可觸發(fā)癌細(xì)胞與原發(fā)部位的解離，使癌細(xì)胞侵入鄰近組織并隨后擴(kuò)散至遠(yuǎn)處器官，有助于腫瘤惡性生物學(xué)特性， 包括細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。研究［21］ 表明：TAM 極化參與不同類型癌癥的EMT進(jìn)程調(diào)節(jié)。在三陰性乳腺癌中不僅檢測(cè)到M2 型TAM 高度浸潤(rùn)， 且與患者的不良預(yù)后有關(guān)； 與M2 型 TAM 共培養(yǎng)的三陰性乳腺癌 BT549 和HCC1937 細(xì)胞中間充質(zhì)標(biāo)志物 N- 鈣黏蛋白（N-cadherin）、Vimentin 和轉(zhuǎn)錄因子Snail 表達(dá)明顯增加， 而上皮標(biāo)志物E-cadherin 表達(dá)受到抑制［22］；M2 型TAM 與肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞共培養(yǎng)后可促進(jìn)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的EMT，增強(qiáng)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力；此外， M2 型TAM 通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子如細(xì)胞間黏附分子1 （intercellular cell adhesion molecule-1、ICAM-1）、IL-6、CC 趨化因子配體 1 （C-Cchemokine ligand 1，CCL1） 和CC 趨化因子配體3（C-C chemokine ligand 3，CCL3） 等分泌來(lái)調(diào)節(jié)肝內(nèi)膽管癌微環(huán)境［23］。推測(cè)打破TAM 和EMT 之間的信號(hào)通路或串?dāng)_循環(huán)能夠?qū)鼓[瘤轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示： 與M0 巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的OS MG63 細(xì)胞中E-cadherin 熒光強(qiáng)度減弱、Vimentin 熒光強(qiáng)度增強(qiáng)， E-cadherin 蛋白表達(dá)水平下調(diào)， Vimentin、Twist1、Snail 和Slug 蛋白表達(dá)水平上調(diào)， 侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)均增加，表明MG63 細(xì)胞誘導(dǎo)TAM 向M2 型極化后促進(jìn)了EMT，同時(shí)提高了細(xì)胞遷移和侵襲能力； 而與含miR-761 Exo 的M0 型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的OS MG63 細(xì)胞中E-cadherin 熒光強(qiáng)度增強(qiáng)、Vimentin 熒光強(qiáng)度減弱， E-cadherin 蛋白表達(dá)水平上調(diào)而Vimentin、Twist1、Snail 和Slug 蛋白表達(dá)水平下調(diào)， 侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)均減少， 表明Exo 傳遞的miR-761 抑制TAM 向M2 型極化及其介導(dǎo)的EMT，進(jìn)而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

綜上所述， Exo 傳遞的miR-761 能夠調(diào)節(jié)OS微環(huán)境下TAM 極化，通過(guò)抑制TAM 向M2 型極化進(jìn)而抑制EMT 進(jìn)程可抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，本研究結(jié)果為OS 的臨床治療提供了新思路。但本研究只在體外進(jìn)行了初步研究，關(guān)于miR-761 作用的具體機(jī)制及在體內(nèi)是否發(fā)揮同樣作用尚有待進(jìn)一步探討。

利益沖突聲明：

所有作者聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明：

高世磊參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和論文撰寫， 王家強(qiáng)、田志超、李超和梁瀟瀟參與數(shù)據(jù)收集、數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，姚偉濤和王鑫參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)指導(dǎo)和論文審閱。

[參考文獻(xiàn)]

［1］ BELAYNEH R， FOURMAN M S， BHOGAL S，et al. Update on osteosarcoma［J］. Curr Oncol Rep，2021， 23（6）： 71.

［2］ COLE S， GIANFERANTE D M， ZHU B， et al.Osteosarcoma： a Surveillance， Epidemiology， and EndResults program-based analysis from 1975 to 2017［J］.Cancer， 2022， 128（11）： 2107-2118.

［3］ SUN C N， LI S L. PTHR1 in osteosarcoma： specificmolecular mechanisms and comprehensive functionalperspective［J］. J Cell Mol Med， 2021， 25（7）： 3175-3181.

［4］ SHOAIB Z， FAN T M， IRUDAYARAJ J M K.Osteosarcoma mechanobiology and therapeutictargets［J］. Br J Pharmacol， 2022， 179（2）： 201-217.

［5］ ANAND N， PEH K H， KOLESAR J M. Macrophagerepolarization as a therapeutic strategy forosteosarcoma［J］. Int J Mol Sci， 2023， 24（3）： 2858.

［6］ GAZZILLO A， POLIDORO M A， SOLDANI C，et al. Relationship between epithelial-to-mesenchymaltransition and tumor-associated macrophages incolorectal liver metastases［J］. Int J Mol Sci， 2022，23（24）： 16197.

［7］ DIENER C， KELLER A， MEESE E. Emergingconcepts of miRNA therapeutics： from cells to clinic［J］.Trends Genet， 2022， 38（6）： 613-626.

［8］ CHEN D F， ZHANG B W， CAO J J， et al. Preparationof polycation with hydroxyls for enhanced delivery ofmiRNA in osteosarcoma therapy［J］. Biomater Sci，2022， 10（11）： 2844-2856.

［9］ HAN G， GUO Q Y， LI N， et al. Screening and analysisof biomarkers in the miRNA-mRNA regulatory networkof osteosarcoma ［J］. J Healthc Eng， 2022， 2022：8055052.

［10］WANG S Y， ZHANG J Y， CHEN G P， et al.MiR-761 inhibits human osteosarcoma progression bytargeting CXCR1［J］. Int J Clin Exp Pathol， 2018，11（11）： 5327-5334.

［11］LAI J J， CHAU Z L， CHEN S Y， et al. Exosomeprocessing and characterization approaches for researchand technology development［J］. Adv Sci， 2022，9（15）： e2103222.

［12］靳 鑫， 倪田根， 王 寧， 等. PGC-1α通過(guò)線粒體介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的機(jī)制研究［J］. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2019， 41（1）： 56-62.

［13］GAO J， LIANG Y Z， WANG L. Shaping polarizationof tumor-associated macrophages in cancerimmunotherapy［J］. Front Immunol， 2022， 13： 888713.

［14］LI C X， XU X F， WEI S H， et al. Tumor-associatedmacrophages： potential therapeutic strategies and futureprospects in cancer［J］. J Immunother Cancer， 2021，9（1）： e001341.

［15］DUMARS C， NGYUEN J M， GAULTIER A， et al.Dysregulation of macrophage polarization is associatedwith the metastatic process in osteosarcoma ［J］.Oncotarget， 2016， 7（48）： 78343-78354.

［16］LIN X B， WANG S Y， SUN M， et al. MiR-195-5p/NOTCH2-mediated EMT modulates IL-4 secretion incolorectal cancer to affect M2-like TAM polarization［J］.J Hematol Oncol， 2019， 12（1）： 20.

［17］LI D Z， YAN M， SUN F F， et al. MiR-498 inhibitsautophagy and M2-like polarization of tumor-associatedmacrophages in esophageal cancer via MDM2/ATF3［J］.Epigenomics， 2021， 13（13）： 1013-1030.

［18］MA C X， HE D S， TIAN P， et al. MiR-182 targetingreprograms tumor-associated macrophages and limitsbreast cancer progression［J］. Proc Natl Acad SciU S A， 2022， 119（6）： e2114006119.

［19］SHAO J T， ZARO J， SHEN Y X. Advances inexosome-based drug delivery and tumor targeting： fromtissue distribution to intracellular fate ［J］. Int JNanomedicine， 2020， 15： 9355-9371.

［20］陳瑞婧， 馮韜錦， 程 實(shí)， 等. 3D 培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)成骨細(xì)胞分化的作用［J］. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志， 2023， 48（4）： 411-419.

［21］LIN Y X， XU J X， LAN H Y. Tumor-associatedmacrophages in tumor metastasis： biological roles andclinical therapeutic applications［J］. J Hematol Oncol，2019， 12（1）： 76.

［22］CHEN X Z， YANG M Q， YIN J， et al. Tumorassociatedmacrophages promote epithelial-mesenchymaltransition and the cancer stem cell properties in triplenegativebreast cancer through CCL2/AKT/β-cateninsignaling［J］. Cell Commun Signal， 2022， 20（1）： 92.

［23］SUN D L， LUO T C， DONG P P， et al. M2-polarizedtumor-associated macrophages promote epithelialmesenchymaltransition via activation of the AKT3/PRAS40 signaling pathway in intrahepaticcholangiocarcinoma［J］. J Cell Biochem， 2020， 121（4）：2828-2838.

[基金項(xiàng)目] 河南省科技廳科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（222102310131）