【摘要】 目的 探討中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs）在兒童重癥肺炎支原體肺炎（SMPP）發(fā)生、發(fā)展中的作用，并評價其對 SMPP的預(yù)測價值。方法 選擇2023年10月至12月蘭州大學第二醫(yī)院收住院的肺炎支原體肺炎（MPP）患兒為研究對象，分為非重癥組（MPP組，n = 45例）和重癥組（SMPP組，n = 39）。采用ELISA檢測2組患兒血清中NETs質(zhì)量濃度。分別收集SMPP組患兒的患側(cè)肺及健側(cè)肺肺泡灌洗液（BALF），采用ELISA檢測BALF中NETs質(zhì)量濃度。結(jié)果 MPP與SMPP患兒血清中NETs質(zhì)量濃度比較差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.01）。SMPP組患側(cè)肺BALF中的NETs質(zhì)量濃度高于健側(cè)肺（P lt; 0.001）。SMPP組血清中NETs質(zhì)量濃度高于BALF（P lt; 0.001）。血清中NETs質(zhì)量濃度預(yù)測SMPP的受試者操作特征曲線下面積（ROC AUC）為0.892（95%CI 0.810～0.963，P lt; 0.001），靈敏度為 0.821，特異度為 0.875，截斷值為17.24 ng/mL；血清中 NETs聯(lián)合C-反應(yīng)蛋白（CRP）、乳酸脫氫酶（LDH）預(yù)測SMPP的ROC AUC為0.974 （95%CI 0.946～1.000，P lt; 0.001），靈敏度為0.923，特異度為0.950。結(jié)論 MPP患兒中過度激活的NETs可能與SMPP的發(fā)生及SMPP的局部肺損傷有關(guān)。檢測MPP患兒血清中NETs、CRP、LDH水平可有效預(yù)測 SMPP，其中以聯(lián)合預(yù)測的效能最優(yōu)。

【關(guān)鍵詞】 兒童；中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)；重癥肺炎支原體肺炎；肺泡灌洗液；C-反應(yīng)蛋白；乳酸脫氫酶

Significance of neutrophil extracellular traps in severe Mycoplasma pneumoniae pneumonia in children

DONG Qinghua1， YIN Jianyun1， SU Hang1， HUANG Li2， NI Qian3

（1.The Second Clinical Medical College， Lanzhou University， Lanzhou 730001， China； 2. Department of Pediatric Nephrology，

the Second Hospital of Lanzhou University， Lanzhou 730001， China； 3. Department of Pediatric Respiratory，

the Second Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 730001， China）

Corresponding author： NI Qian， E-mail： ery_niq@lzu.edu.cn

【Abstract】 Objective To investigate the pathogenic role of neutrophil extracellular traps （NETs） in the pathogenesis and progression of severe Mycoplasma pneumoniae pneumonia （SMPP） in children and to assess their predictive value for SMPP. Methods Children with Mycoplasma pneumoniae pneumonia （MPP） admitted to the Second Hospital of Lanzhou University from October to December 2023 were selected as the study subjects. They were divided into the non-severe group （MPP group， n = 45） and severe group （SMPP group， n = 39）. The levels of NETs in the serum and bronchoalveolar lavage fluid （BALF） of all children were measured using ELISA. Additionally， BALF from both the affected and contralateral sides was collected from children in the SMPP group， and the content of NETs in BALF was determined using ELISA. Results A significant difference was observed in the serum concentration of NETs between MPP and SMPP patients （P lt; 0.01）. In the SMPP group， the level of NETs in the BALF of the affected lung was significantly higher than those of the contralateral side （P lt; 0.001）. Serum NETs levels were significantly higher than those in BALF in SMPP group （P lt; 0.001）. The area under the ROC curve （AUC） for predicting SMPP based on serum NETs levels was 0.892 （95%CI 0.810-0.963， P lt; 0.001）， with a sensitivity of 0.821 and specificity of 0.875， and a cut-off value of 17.24 ng/mL，

respectively. The AUC of the combination of serum NETs with C-reactive protein （CRP） and lactate dehydrogenase （LDH） levels for predicting SMPP was 0.974 （95%CI 0.946-1.000， P lt; 0.001）， with a sensitivity of 0.923 and specificity of 0.950， respectively. Conclusions Excessive activation of NETs may contribute to the incidence of SMPP and localized lung injury in children with MPP. Monitoring the serum levels of NETs， CRP and LDH can effectively predict the incidence of SMPP. The combination of NETs， CRP， and LDH yields the best predictive performance.

【Key words】 Children； Neutrophil extracellular traps； Severe Mycoplasma pneumoniae pneumonia；

Bronchoalveolar lavage fluid； C-reactive protein； Lactate dehydrogenase

肺炎支原體肺炎（Mycoplasma pneumoniae pne-

umonia，MPP）是兒童常見社區(qū)獲得性肺炎。近兩年，伴隨著新型冠狀病毒感染（COVID-19）大流行的結(jié)束，MPP的患病率和門診患兒中耐藥肺炎支原體分離株的比例從最初的較低水平，到現(xiàn)在已經(jīng)出現(xiàn)反彈的趨勢［1］。門診患兒的大規(guī)模增加使得臨床醫(yī)師要對疾病的診斷和嚴重程度進行快速地識別。研究表明，隨著大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥的發(fā)展，重癥肺炎支原體肺炎（severe Mycoplasma pneumoniae pneumonia，SMPP）的發(fā)病率也在逐年攀升，而SMPP患兒容易合并多種肺外并發(fā)癥，更容易出現(xiàn)多器官功能障礙綜合征，從而危及患兒生命［1-2］。因此，臨床醫(yī)師需要尋找更多的診斷和分類診斷方法，避免對疾病的誤診和對疾病嚴重程度的誤判，從而減少藥物濫用和耐藥的發(fā)生。既往的研究顯示，中性粒細胞可以通過形成中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）的方式參與機體的抗菌機制，但越來越多的研究結(jié)果表明這種機制在參與抗菌的同時還可能參與機體多項炎癥反應(yīng)，在多種感染性和自身免疫性疾病甚至腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［3-4］。因此，本研究擬通過檢測MPP、SMPP 患兒血清及SMPP患兒肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中NETs，探討NETs與兒童MPP病情嚴重程度的關(guān)系，以期為臨床疾病監(jiān)測提供一定參考依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2023年10月至12月在蘭州大學第二醫(yī)院住院的MPP患兒為研究對象，分為非重癥組（MPP組，n = 45）和重癥組（SMPP組，n = 39）。MPP組未采集BALF標本；SMPP組采集到BALF標本共12例，且影像學檢查表現(xiàn)為單側(cè)肺受累，收集其患側(cè)肺和健側(cè)肺的BALF標本。本研究方案經(jīng)蘭州大學第二醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（批件號：2023A-440），入組患兒監(jiān)護人均已簽署知情同意書。

1.2 病例納入及排除標準

納入標準：①0～14歲；②符合MPP和SMPP診斷標準（參照《兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識（2023年版）》）；③病程在14 d以內(nèi)；④血培養(yǎng)或痰培養(yǎng)結(jié)果陰性、無明確病毒感染證據(jù)者［5］。排除標準：①有支氣管哮喘和慢性阻塞性肺疾病等病史的患兒；②有血液系統(tǒng)疾病、嚴重先天性心臟病、嚴重肝腎功能不全、先天性支氣管肺發(fā)育不良、遺傳代謝性疾病、免疫缺陷疾病等嚴重基礎(chǔ)疾病的患兒；③長期使用糖皮質(zhì)激素或免疫功能調(diào)節(jié)劑、免疫抑制劑治療的患兒。

1.3 方 法

1.3.1 臨床資料收集及血液、BALF標本采集

記錄入組患兒的性別、年齡。于患兒入院后次日清晨采集空腹靜脈血2 mL，在4 ℃以3 000轉(zhuǎn)/分離心10 min后，分離血清于-80 ℃冰箱保存?zhèn)錂z。按照文獻［6］的技術(shù)要求，根據(jù)先健側(cè)后患側(cè)的原則行支氣管肺泡灌洗，并收集BALF各5 mL；健側(cè)選擇右肺中葉或左上葉舌段，患側(cè)選擇病變段，總回收率≥30%，紅細胞比例低于 20%，且無大氣道分泌物混入為合格標本；將新鮮BALF移取至15 mL錐形離心管中，在相同條件下離心后，分離上清液置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)錂z。

1.3.2 標本檢測

采用全自動血細胞分析儀檢測血常規(guī)和C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP），記錄白細胞計數(shù)、中性粒細胞比例、CRP質(zhì)量濃度；全自動乳膠凝集免疫比濁法檢測D-二聚體，記錄其質(zhì)量濃度；ELISA法檢測乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH），記錄其水平。采用ELISA檢測血清及BALF中NETs的含量，試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行，檢測儀器為賽默飛世爾Mulltiskan FC酶標儀，在450 nm波長處依序測量各孔NETs的吸光度并記錄。

1.4 樣本量估計

根據(jù)文獻預(yù)計兒童社區(qū)獲得性肺炎非重癥組和重癥組的NETs與細胞游離DNA比值的均值分別為228、286，標準差分別為40、52［7］。要求雙側(cè)檢驗水準為0.05，把握度（檢驗效能）為90%。利用G*Power 15軟件計算得到每組至少需要納入12例患兒。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 8.0進行統(tǒng)計學分析。正態(tài)分布的計量資料以表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，血清與BALF組內(nèi)對比采用配對t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗；計數(shù)資料以n（%）表示，組間比較采用χ 2檢驗；SMPP組BALF與血清NETs的關(guān)系采用Pearson相關(guān)性分析。結(jié)合單因素分析結(jié)果篩選出具有統(tǒng)計學意義的指標，進行多因素Logistic回歸分析（逐步法）。采用GraphPad Prism 8.0繪制受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析血清中NETs質(zhì)量濃度以及聯(lián)合外周血常規(guī)指標在SMPP診斷預(yù)測中的價值，并用DeLong檢驗比較各ROC曲線的預(yù)測性能。雙側(cè)P lt; 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 MPP組和SMPP組患兒的一般人口學資料及實驗室指標比較

MPP 組、SMPP 組患兒的年齡、性別比較差異均無統(tǒng)計學意義（P均gt; 0.05），但SMPP組的白細胞計數(shù)、中性粒細胞比例、CRP質(zhì)量濃度、D-二聚體質(zhì)量濃度、LDH水平均高于MPP組（P均lt; 0.05）。見表1。

2.2 NETs質(zhì)量濃度在MPP組與SMPP組血清中的比較及在SMPP患兒健側(cè)肺、患側(cè)肺BALF中的比較

SMPP組血清NETs質(zhì)量濃度高于MPP組（t =

82.00，P lt; 0.001）；SMPP組患側(cè)肺BALF的NETs質(zhì)量濃度高于健側(cè)肺BALF（t = -2.79，P lt; 0.001）。

2.3 SMPP組患兒BALF與血清中的NETs質(zhì)量濃度差異及相關(guān)性分析

SMPP組患兒血清中NETs質(zhì)量濃度高于BALF中NETs質(zhì)量濃度（t = 25.546，P lt; 0.001）；兩者相關(guān)性弱（r = 0.192，P = 0.551）。

2.4 SMPP 影響因素的Logistic 回歸分析

將白細胞計數(shù)、中性粒細胞比例、CRP質(zhì)量濃度、D-二聚體質(zhì)量濃度、LDH水平、血清NETs質(zhì)量濃度的具體值納入多因素Logistic回歸分析（逐步法），結(jié)果顯示CRP、LDH、血清NETs是SMPP的影響因素。利用三者建立Logistic 回歸模型，得出回歸方程為：Logit P = -21.103+0.155×CRP+0.014×LDH+0.863×NETs。對上述模型行似然比檢驗，具有統(tǒng)計學意義（χ 2 = 2 662.44，P lt; 0.001），對各回歸系數(shù)的Wald χ 2檢驗顯示，CRP、LDH、血清NETs的P均lt; 0.05。

2.5 血清NETs質(zhì)量濃度對SMPP的預(yù)測價值分析

利用血清NETs、CRP、LDH建立預(yù)測SMPP的ROC曲線，3個單一參數(shù)及回歸模型的靈敏度、特異度、ROC 曲線下面積（area under curve， AUC）及鑒別臨界點見表3和圖3，血清NETs、CRP與LDH構(gòu)建的聯(lián)合預(yù)測模型ROC AUC大于血清NETs、CRP、LDH任一單獨指標，通過DeLong法兩兩比較發(fā)現(xiàn)聯(lián)合預(yù)測模型與單一數(shù)據(jù)ROC AUC比較差異均有統(tǒng)計學意義（P均lt; 0.05），見表4。

3 討 論

MPP是一種具有自限性的傳染性疾病，主要通過呼吸道傳播，潛伏期通常為2～4周。該病全年活躍，有證據(jù)顯示其可引起地方性流行，并在中國大部分地區(qū)每隔2～3年發(fā)生一次大規(guī)模流行［8］。肺炎支原體可引起上呼吸道和下呼吸道感染，大多數(shù)病例的臨床癥狀是非特異性的［2］。雖然大多數(shù)MPP病例的病情并不嚴重，但有些病例可能發(fā)展為重癥肺炎和難治性肺炎，伴有胸腔積液、多器官功能障礙綜合征和嚴重的長期后遺癥，包括閉塞性細支氣管炎和支氣管擴張；在嚴重情況下，SMPP患者可能會出現(xiàn)呼吸衰竭和低氧血癥，需使用機械通氣、體外膜肺氧合等技術(shù)進行生命支持，病情危重者甚至可能會死亡［6］。在SMPP高發(fā)生率的情況下，早期診斷和治療顯得尤為關(guān)鍵。

既往的研究表明，NETs在細菌、病毒、真菌早期感染過程中均具有一定積極作用，隨著研究的深入，這些疾病的炎癥進程中同樣發(fā)現(xiàn)NETs的參與［9］。針對COVID-19患者肺泡和內(nèi)皮損傷機制的研究表明，嚴重COVID-19 病例中IL-1β和NETs可能會形成前饋環(huán)直接激活和損傷內(nèi)皮細胞，削弱內(nèi)皮屏障完整性［10］。肺炎鏈球菌甚至可以通過促進中性粒細胞向NETs的轉(zhuǎn)換，從而實現(xiàn)對中性粒細胞的免疫逃避［11］。銅綠假單胞菌作為下呼吸道感染常見致病菌之一，其慢性感染患者的痰液中也發(fā)現(xiàn)了NETs，并且NETs與痰液黏稠度的增加以及肺功能的下降相關(guān)［12］。NETs作為一種肺部炎癥的促炎因子已被越來越多的研究者所認識，探究其在肺部感染性疾病中的作用可能為疾病的治療提供新的思路。

本研究結(jié)果顯示，SMPP組外周血中的多種因子水平以及血清NETs質(zhì)量濃度均高于MPP組，提示 MPP患兒病情加重可能與上述因素有關(guān)，進一步的Logistic回歸分析結(jié)果顯示，NETs、CRP、LDH均為MPP患兒疾病進展的影響因素。NETs是中性粒細胞的一種特殊形式，是最早到達損傷部位的炎癥因子，能同時調(diào)節(jié)先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，并具有較強的殺菌作用和促炎作用［13］。有研究表明，NETs可以激活漿細胞樣樹突狀細胞（plasmacytoid dendritic cell，pDC），以一種依賴于DNA和Toll樣受體9（toll like receptor 9，TLR9）的方式產(chǎn)生高水平的干擾素-α（interferon-α，IFN-α）［14］。NETs還可以通過調(diào)節(jié)核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）的去泛素化修飾，激活肺泡巨噬細胞的焦亡過程，加重膿毒癥引起的肺損傷［15］。本課題組之前發(fā)現(xiàn)，肺炎支原體可能通過pDC-TLR7/9-IFN-α和NLRP3/IL-1β、IL-18 通路參與SMPP的發(fā)病機制［16-18］。因此，本研究旨在探究對NETs在SMPP中的作用，為SMPP發(fā)病機制的研究提供參考依據(jù)。

眾所周知，MPP向SMPP轉(zhuǎn)變最主要的特征就是炎癥風暴的進一步發(fā)展，以及多種肺內(nèi)及肺外并發(fā)癥的發(fā)生。本研究顯示，CRP、LDH是影響MPP患兒疾病進展的因素，這與2023年更新的新版MPP診療指南中提出的CRP和LDH對于疾病嚴重程度診斷具有價值一致［6］。D-二聚體是交聯(lián)纖維蛋白的降解產(chǎn)物，與血液高凝及急性血栓密切相關(guān)［19］。但由于出現(xiàn)明顯血栓的病例極少，臨床缺乏對微血栓形成的檢驗及認識，筆者團隊收集到的相關(guān)血栓形成的臨床數(shù)據(jù)極少，無法對其進行驗證。隨著認識水平的提高，筆者團隊發(fā)現(xiàn)SMPP中的血栓形成并不罕見，北京兒童醫(yī)院的一項研究表明，D-二聚體質(zhì)量濃度的升高，即超過11.1 mg/L或者大于5.0 mg/L已可提示體內(nèi)血栓的形成［20］。Cesta等［21］提出，NETs是COVID-19免疫血栓形成的關(guān)鍵驅(qū)動因素，并證明通過監(jiān)測NETs可以早期預(yù)測患者體內(nèi)血栓的形成。因此，NETs與D-二聚體的聯(lián)合可能是監(jiān)測SMPP中的血栓甚至微血栓形成的新方向，希望后期隨著病例數(shù)的增加可以通過開展更多的臨床試驗來驗證這一觀點。

目前，對于肺局部損傷的機制仍無明確定論。本研究結(jié)果顯示，SMPP患兒患側(cè)肺BALF中NETs的質(zhì)量濃度高于健側(cè)肺，提示NETs的過度激活可能參與了 SMPP 患兒的局部肺損傷?？靛鹊龋?2］的研究提示，SMPP患兒BALF中存在嚴重的1型與2型輔助性T細胞（T helper cell， Th）比值失衡，結(jié)合Zheng等［23］所報道的NETs參與了Th2介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6（signal transducer and activator of transcription 6，STAT6）依賴性方式的補體C3高表達，提示了NETs參與介導(dǎo)的Th2-STAT6-C3-NETs的級聯(lián)反應(yīng)可能是SMPP 患兒局部肺損傷的重要致病通路。

本研究對BALF的收集嚴格遵循相關(guān)指南操作［6］。研究結(jié)果顯示，SMPP患兒血清NETs質(zhì)量濃度高于其在BALF中的質(zhì)量濃度。NETs的肺外高表達表明，患者正經(jīng)歷的感染過程可能是一種強烈的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，但肺炎支原體是否可入血形成肺炎支原體血癥尚未明確，普遍的觀點認為肺炎支原體感染后的肺外并發(fā)癥與異常的免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)，但對于異常的免疫炎癥反應(yīng)來源尚無定論［24-25］。SMPP患者血清NETs的高表達可能解釋了這一原因，這也與其較其他社區(qū)獲得性肺炎更易出現(xiàn)肺外并發(fā)癥相符［26］。因此，監(jiān)測NETs在血清與BALF中的含量，有利于臨床醫(yī)師對SMPP患兒全身炎癥反應(yīng)程度的評估以及病情嚴重程度的判斷，但由于收集的樣本量較少，本研究無法得出其與肺外并發(fā)癥的關(guān)聯(lián)，期望后續(xù)可以通過進一步擴大樣本量，闡明NETs在SMPP肺外炎癥中的作用。

本研究中，外周血NETs聯(lián)合CRP、LDH檢測對預(yù)測 MPP患兒疾病進展的ROC AUC為0.974，診斷效果優(yōu)于NETs、CRP這些指標的單獨檢測，提示聯(lián)合檢測對預(yù)測SMPP的發(fā)生具有較高的價值，其診斷的靈敏度和特異度分別為0.923、0.950。臨床醫(yī)師可根據(jù)該模型對MPP患兒進行預(yù)測，對于可能發(fā)生SMPP的患兒予以早期診斷并采取積極的治療及監(jiān)測方案，以改善患兒預(yù)后。

綜上所述，MPP 患兒中過度激活的 NETs可能與SMPP的發(fā)生及SMPP的局部肺損傷有關(guān)。外周血 NETs、CRP、LDH可作為MPP患兒疾病進展的預(yù)測因子，指導(dǎo)治療方案的制定。

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（責任編輯：林燕薇）