【關(guān)鍵詞】脂質(zhì)體；小膠質(zhì)細(xì)胞膜；全氟己烷；缺血性腦卒中

【中圖分類號(hào)】R743.3 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2024-01-18

缺血性腦卒中是一類常見的疾病，是全球第二大死因和第三大致殘性疾病，嚴(yán)重危害了全球公共衛(wèi)生健康[1-2]。目前藥物溶栓是主要的血管再通治療方式[3]，然而這些藥物存在藥物靶向能力差，累計(jì)效率低[4]，可能會(huì)引發(fā)不必要的出血[5]，甚至可能誘發(fā)其他的疾病[6]，因此更準(zhǔn)確高效地輸送藥物和新的血管再通方式就顯得尤為重要。近些年來，納米醫(yī)學(xué)因?yàn)槠錈o創(chuàng)、便捷、可編輯性，被廣泛用于多種疾病的診斷與治療，這種新方式對(duì)腦卒中治療是有希望的[7]。

脂質(zhì)體是一種由脂質(zhì)分子構(gòu)成的微小囊泡，由于與生物膜相似的結(jié)構(gòu)構(gòu)成，這有助于脂質(zhì)體與生物膜相融合，從而在脂質(zhì)體表面引入生物膜特異性配體，而表面配體的存在有助于實(shí)現(xiàn)對(duì)特定細(xì)胞或組織的靶向傳遞[8]。此外，由于主要由生物體內(nèi)天然存在的脂質(zhì)構(gòu)成，故具有良好的生物安全性，從而降低了免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)[9]。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞，作為“保衛(wèi)者”可以在疾病發(fā)生時(shí)做出最迅速的響應(yīng)[10]。近些年來提出“ 血管相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞（Vesselassociatedmicroglia，VAM）”的概念，用高表達(dá)CX3CR1來描述這一類細(xì)胞，并用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了腦血管受損后VAM 向損傷部位延伸，介導(dǎo)血腦屏障（blood brain barrier，BBB）關(guān)閉，證實(shí)了小膠質(zhì)細(xì)胞向腦缺血損傷部位遷移的能力[11-12]。全氟己烷（per?fluorohexane，PFH）是一種具有相變能力的液態(tài)氟碳，其可以在聲波等多種條件的改變下發(fā)生“液態(tài)-氣態(tài)”的改變，這種由于形態(tài)改變帶來的體積變化可以使其破壞血栓，實(shí)驗(yàn)證實(shí)超聲溶栓增加了血管再通的可能性，并且未增加明顯的風(fēng)險(xiǎn)[13-14]。

因此，本研究通過小膠質(zhì)細(xì)胞膜（microglia cellmembrane，MiCM）靶向，脂質(zhì)體作為載體，攜帶PFH，制備納米粒MiCM@PFH@Lipid。該納米材料可以通過仿生細(xì)胞膜靶向缺血損傷部位，利用PFH聲致相變的特性實(shí)現(xiàn)血管再通，并通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其表征、靶向能力、血管再通能力，有希望為缺血性腦卒中的治療提供一種新方式。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮，中國）；低強(qiáng)度聚焦超聲（[ low intensity focused ultrasound，LIFU），重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像研究所，中國]；電子分析天秤（mettler to?ledo，瑞士）；ZS90激光粒度分析儀（馬爾文公司，英國）；JEM2100透射電鏡（捷歐路科貿(mào)有限公司，日本）；酶標(biāo)儀（Bio-Tek儀器公司，美國）。

1.1.2 試劑 PFH（北京科技有限公司，中國）；二棕櫚酰磷脂酰膽堿（1，2-dimpalmiyristoyl-sn-glycero-3-phosphocho?line，DPPC，西安瑞禧，中國）；磷脂酰乙醇胺（1，2-distearoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy（polyethyleneglycol）-2000]，DSPE-PEG2000，西安瑞禧，中國）；膽固醇（西安瑞禧，中國）；三氯甲烷（CHCl3，重慶川東化工，中國）；anti-TMEM119、anti-CX3CR1抗體（三鷹生物技術(shù)有限公司，中國）；DIR（AAT Bioquest，美國）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2細(xì)胞來自重慶市神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57小鼠，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量18～25 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，動(dòng)物飼養(yǎng)及操作均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的3R原則，并獲得重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)通過（許可編號(hào)：IACUC-CQMU-2023-0144）。

1.2 方法

1.2.1 小膠質(zhì)細(xì)胞膜MiCM提取 將小膠質(zhì)細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液，離心提取細(xì)胞后使用含有PMSF（1∶100）的NaCl溶液重懸，放入-80 ℃中30 min后取出，于37 ℃下解凍，反復(fù)3次得到破碎細(xì)胞。在4 ℃下，700 g離心5 min后，收集所得上清液，在15 000 g離心30 min后得到細(xì)胞膜MiCM。

1.2.2 MiCM@PFH@Lipid的制備 將DPPC、DSPE-PEG2000、膽固醇按照3∶1∶1的比例稱取20 mg加入圓底燒瓶，加入10 mL三氯甲烷至溶解后安裝至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，形成乳白色薄膜，旋蒸結(jié)束后用4 mL的PBS水化得到脂質(zhì)體。1 mL脂質(zhì)體溶液在冰浴條件下與200 μL的PFH進(jìn)行乳化反應(yīng)[100 W，6 min（on： 5 s，off： 5 s）]，在4 ℃下，6 000 r/min離心5 min 3次得到PFH@Lipid。隨后將提取的MiCM與PFH@Lipid 混合，在冰浴條件下超聲處理1 min（40 W）[15]，15 000 r/min離心15 min得到MiCM@PFH@Lipid。

1.2.3 MiCM@PFH@Lipid電鏡、粒徑、電位檢測 將MiCM@PFH@Lipid溶解在雙蒸餾水中后，使用透射電鏡觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。采用激光粒度分析儀在25 ℃環(huán)境下，對(duì)制作第1天的納米顆粒進(jìn)行粒徑分布檢測，對(duì)制作第1、3、5、7天的納米粒進(jìn)行電位檢測。

1.2.4 MiCM@PFH@Lipid 表面蛋白分析 采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphatepolyacrylamidegel electrophoresis，SDS-PAGE）SDS-PAGE 對(duì)MiCM、PFH@Lipid、MiCM@PFH@Lipid 進(jìn)行全蛋白分析。所有樣品在14000 r/min下離心10 min，用蛋白（600 mg/mL）與4X 上樣緩沖液混合制備，95 ℃加熱10 min，將蛋白（10 μL）上樣于10% 的bis-tris 蛋白凝膠上進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。為了進(jìn)行Western blot分析，將蛋白轉(zhuǎn)移到0.45 μm的PVDF 膜上，用anti-TMEM119 和anti-CX3CR1 的一抗以及HRP偶聯(lián)的抗小鼠/兔IgG二抗進(jìn)行處理。

1.2.5 動(dòng)物模型建立 造模組與干預(yù)組均采用小鼠血栓栓塞大腦中動(dòng)脈腦梗死（embolic middle cerebral artery occlu?sion，eMCAO）動(dòng)物模型[16]。首先制作血栓，采集小鼠血液轉(zhuǎn)入PE-50管，試管在室溫下保存2 h以凝血，然后在4 ℃下保存22 h。小鼠戊巴比妥（50 mg/kg）麻醉后，顯露頸總動(dòng)脈（common carotid artery，CCA）、頸外動(dòng)脈（external carotid ar?tery，ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA，internal carotid artery）。將含有血塊的改良PE-8導(dǎo)管插入切口，并通過ECA進(jìn)入ICA的管腔，直到它遇到大腦中動(dòng)脈（Middle Cerebral Artery，MCA）的起源，在3 min內(nèi)注射血凝塊和生理鹽水（10 μL），取出導(dǎo)管。在整個(gè)手術(shù)過程中，將小鼠置于加熱燈下，體溫保持在37 ℃。

1.2.6 MiCM@PFH@Lipid體內(nèi)靶向驗(yàn)證 將eMCAO小鼠分為PFH@Lipid組和MiCM@PFH@Lipid組，經(jīng)尾靜脈注射DIR標(biāo)記的納米粒（200 μL，1 mg/mL）。3組小鼠在注射后120 min注射過量戊巴比妥（160 mg/kg）處死，取腦進(jìn)行離體熒光成像。

1.2.7 小鼠行為學(xué)檢測與腦TTC染色 實(shí)驗(yàn)前根據(jù)改良神經(jīng)功能損害評(píng)分（modified neurological severity scores，mNss）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)驗(yàn)設(shè)備說明對(duì)小鼠進(jìn)行轉(zhuǎn)棒測試的訓(xùn)練。訓(xùn)練3 d 后，選擇訓(xùn)練成功的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分為sham 組、eMCAO 組、PFH@Lipid 組和MiCM@PFH@Lipid 組，每組3只。eMCAO 小鼠造模后，經(jīng)尾靜脈注射不同的藥物，在60 min后，以2 W/cm2的強(qiáng)度對(duì)小鼠患側(cè)腦部進(jìn)行LIFU刺激3 min（on： 2s，off： 2s），治療后第1、7天分別進(jìn)行mNss評(píng)分和行為測試。然后處死小鼠，采集大腦，在-20 ℃冷凍，并解剖成2 mm厚的切片。新鮮腦切片用TTC溶液在37 ℃下染色30 min，4%多聚甲醛浸泡24 h。圖像中的梗死區(qū)域（白色部分）用Image J軟件定量。

1.2.8 小鼠重要器官Hamp;E 染色 將MiCM@PFH@Lipid、PFH@Lipid（2 mg/mL，200 μL）和生理鹽水經(jīng)尾靜脈注射至正常C57小鼠體內(nèi)，14 d后取心、肝、脾、肺、腎進(jìn)行蘇木精－伊紅染色（hematoxylin and eosin staining，Hamp;E）染色。

1.2.9 小鼠血常規(guī)檢測 將MiCM@PFH@Lipid（2 mg/mL，200 μL）和生理鹽水經(jīng)尾靜脈注射至正常C57小鼠體內(nèi)，3 d后取小鼠血液進(jìn)行血常規(guī)檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0（Chicago，Illinois，USA）和GraphPad Prism7.0（San Diego，CA，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以至少3個(gè)獨(dú)立檢驗(yàn)的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。2組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。多組數(shù)據(jù)之間的比較，采用單因素方差分析和Turkey檢驗(yàn)法統(tǒng)計(jì)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MiCM@PFH@Lipid表征

使用旋蒸法成功制備了MiCM@PFH@Lipid 納米粒，透射電鏡呈球形（圖1A），馬爾文粒徑分析（圖1B）測得MiCM@PFH@Lipid 納米粒的粒徑為（234.800±3.143） nm，粒徑多分散指數(shù)（polymer dispersity index，PDI）為0.330±0.024。如圖1C、D所示，MiCM@PFH@Lipid納米粒在1、3、5、7 天內(nèi)的電位分別為（-33.433±1.550） mV、（-34.267±4.488） mV、（-34.633±2.316） mV、（-34.967±1.704） mV，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.169，P=0.914），說明該納米粒具有良好的穩(wěn)定性。特異性蛋白（TMEM119、CX3CR1）和考馬斯亮藍(lán)顯示（圖1E、F）PFH@Lipid沒有蛋白表達(dá)，而MiCM@PFH@Lipid與MiCM有相似的蛋白表達(dá)，提示小膠質(zhì)細(xì)胞膜成功轉(zhuǎn)移至PFH@Lipid。

2.2 MiCM@PFH@Lipid的靶向驗(yàn)證

將造模后的小鼠尾靜脈注射DIR標(biāo)記的PFH@Lipid和MiCM@PFH@Lipid納米粒，2 h后進(jìn)行離體熒光成像，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在造模后小鼠的栓塞區(qū)域，納米粒的聚集明顯高于非栓塞區(qū)域（圖2A、B）。

2.3 MiCM@PFH@Lipid的治療驗(yàn)證

首先驗(yàn)證了納米粒對(duì)小鼠行為的影響：小鼠轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)是對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)平衡能力和疲勞程度的檢測實(shí)驗(yàn)，mNss評(píng)分是對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)的綜合測試[17]。小鼠轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)顯示[F=5 023，Plt;0.001]（圖3A）MiCM@PFH@Lipid治療組（120.833±1.976） s與Model組（68.033±3.921） s、PFH@Lipid非靶向組（101.600±2.553） s相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.001）；mNss行為學(xué)評(píng)分[F=227.7，Plt;0.001]（圖3B）顯示MiCM@PFH@Lipid治療組（9.000±1.000） s與Model組（17.333±0.577） s相比有明顯差異（Plt;0.001），且與PFH@Lipid非靶向組（12.000±1.000） s也有明顯差異（P=0.009）；行為學(xué)的結(jié)果說明治療后小鼠的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能有所恢復(fù)。腦組織TTC染色（圖3C、D）顯示正常小鼠梗死體積為0%，Model 組梗死體積為（43.427±9.860）%，納米粒治療后梗死面積顯著減少，為（10.343±0.425）%，且治療效果優(yōu)于非靶向組（17.650±1.176）%。

2.4 MiCM@PFH@Lipid生物安全評(píng)估

生物安全性對(duì)于新的藥物以及材料的臨床轉(zhuǎn)化具有重要意義。在單次注射MiCM@PFH@Lipid和PFH@Lipid 14 d后，用HE染色（圖4A）評(píng)估了納米粒對(duì)小鼠不同實(shí)質(zhì)性器官（心臟、肝臟、脾臟、肺、腎）的毒性，可以看到，重要臟器并未出現(xiàn)細(xì)胞或組織的損傷、壞死、炎性反應(yīng)。隨后，對(duì)正常C57小鼠，在注射納米粒后3 d后的血液標(biāo)本進(jìn)行血常規(guī)的檢測，結(jié)果顯示，Sham組與MiCM-NPs組相比，小鼠血液中各細(xì)胞的數(shù)目沒有明顯差異（t=2.541，P=0.085），其中，白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)目分別為 （[ 4.000±1.587）×109/L vs（. 5.500±1.229）×10⁹/L（] t=1.415，P=0.293）、（[ 3.267±1.159）×10⁹/L vs. （4.167±1.185）×10⁹/L]（t=1.199，P=0.353）、[（0.067±0.058）×10⁹/L vs. （0.200±0.100）×10⁹/L]（t=1.512，P=0.270）、[（0.667±0.404）×109/L vs.（1.133±0.115）×109/L]（t=1.575，P=0.256）。此外，各細(xì)胞數(shù)目比例亦無明顯差異（tlt;0.000 1，Pgt;0.05），其中，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞比例分別為[（82.633±5.865）% vs.（75.000±6.851）%]（t=1.725，P=0.227）、（[ 2.100±0.721）% vs.（ 3.833±0.833）%（] t=2.726，P=0.112）、（[ 15.267±5.168）% vs. （21.167±6.144）%]（t=1.532，P=0.265），提示納米粒具有較好的生物安全性（圖4B、C）。

3討論

缺血性腦卒中作為嚴(yán)重危害全球公共衛(wèi)生健康的疾病之一，目前的治療方式主要為藥物溶栓，但是藥物的非特異性會(huì)帶來出血等不良反應(yīng)[18]。如今將配體綴合至脂質(zhì)體表面的方法在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用進(jìn)行了廣泛的研究，靶向配體可以提高合成的納米粒至患病組織和細(xì)胞的濃度并將其保留在配體在脂質(zhì)體中的特異性[19]。

本研究通過旋蒸法合成脂質(zhì)體，利用超聲技術(shù)裝載PFH 并融合小膠質(zhì)細(xì)胞膜，從而制備了MiCM@PFH@Lipid 納米粒。MiCM@PFH@Lipid 納米粒在透射電鏡下呈現(xiàn)球形，其粒徑為（234.800±3.143） nm，平均電位為（-33.433±1.550） mV，并具有良好的分散性。同時(shí)，MiCM@PFH@Lipid與小膠質(zhì)細(xì)胞膜具有相似的膜蛋白表達(dá)，其中CX3CR1是小膠質(zhì)細(xì)胞膜發(fā)揮遷移的重要表面蛋白[20]，這使得納米?？梢钥焖俚陌邢蛉毖獡p傷病灶區(qū)域，離體熒光實(shí)驗(yàn)證明包裹有小膠質(zhì)細(xì)胞膜的納米?？梢钥焖偬岣呷毖课坏乃幬餄舛取?/p>

本研究制備的納米粒同時(shí)裝載了相變材料PFH，其“液態(tài)-氣態(tài)”相變的能力可以機(jī)械破壞血栓，實(shí)現(xiàn)血管再通。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了對(duì)照組和干預(yù)組，小鼠行為學(xué)和腦TTC染色作為治療評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，2組干預(yù)組較對(duì)照組具有明顯的差異，在干預(yù)組中MiCM@PFH@Lipid 靶向組較PFH@Lipid非靶向組具有更好的行為學(xué)結(jié)果和更小的TTC梗死面積。

生物安全性對(duì)于新藥物的研究具有重要意義，在本研究中觀察了PFH@Lipid與MiCM@PFH@Lipid2種納米粒對(duì)重要器官的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明2種納米粒對(duì)小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟沒有明顯的損傷。

本研究證實(shí)了MiCM@PFH@Lipid 納米粒中小膠質(zhì)細(xì)胞膜靶向缺血性腦卒中病灶和超聲PFH血管再通的能力，這對(duì)于腦卒中治療研究具有重要的意義。此外，小膠質(zhì)細(xì)胞與中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種細(xì)胞的聯(lián)系或許可以成為“分級(jí)靶向”、從而實(shí)現(xiàn)“精準(zhǔn)釋藥”的可能。目前缺血性腦卒中治療提倡血管再通后快速地給予神經(jīng)保護(hù)治療[21]，而脂質(zhì)體作為一種載體或許可以實(shí)現(xiàn)血管再通與裝載神經(jīng)保護(hù)藥物相結(jié)合，這為腦卒中治療提供新策略。

（責(zé)任編輯：曾玲）