【關(guān)鍵詞】溴域蛋白亞家族4；核因子κB；鐵死亡；乳腺癌

【中圖分類號】R737.9 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2023-08-31

乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤之一，占全球女性癌癥新發(fā)病例的24%以上，約占癌癥相關(guān)死亡的15%[1]。三陰性乳腺癌（triple-negative breastcancer，TNBC）是乳腺癌的一個(gè)亞型，占所有浸潤性乳腺癌的15%～20%[2]。由于TNBC缺乏可用藥的分子驅(qū)動因素，化療仍然是TNBC患者全身治療的主要手段[3]。然而，內(nèi)在和獲得性耐藥性極大地限制了化療的效率，導(dǎo)致乳腺癌患者的高轉(zhuǎn)移率和不良預(yù)后[4]。因此，對化療耐藥性的潛在分子機(jī)制的表征將有助于開發(fā)新的治療策略，以增強(qiáng)乳腺癌患者的化療效果。

鐵死亡是最近發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞死亡形式，主要由過度的鐵依賴性脂質(zhì)過氧化引起，并導(dǎo)致鐵介導(dǎo)的細(xì)胞膜氧化損傷，細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygenspecies，ROS）水平增加[5-6]。積累的證據(jù)表明，鐵死亡在癌細(xì)胞的命運(yùn)和對各種癌癥治療（如化療、放療和免疫療法）的反應(yīng)中起著重要作用[7]。具有耐藥性和高轉(zhuǎn)移傾向的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出對鐵死亡的更高敏感性，表明靶向鐵死亡的負(fù)調(diào)節(jié)因子可能會進(jìn)一步使化學(xué)抗性癌細(xì)胞對鐵死亡敏感[8]。此外，鐵死亡癌細(xì)胞釋放的損傷相關(guān)分子模式可以通過作用于周圍細(xì)胞來增強(qiáng)炎癥和免疫反應(yīng)[9]。因此，需要進(jìn)一步的研究來闡明鐵死亡的分子機(jī)制，這將有助于實(shí)施新的方法來克服耐藥性。

腫瘤細(xì)胞具有明顯的表觀基因組特征，如DNA甲基化、組蛋白共價(jià)修飾和染色質(zhì)重塑，極大地影響了它們的發(fā)生或發(fā)展[10]。越來越多的證據(jù)表明，表觀遺傳調(diào)控與鐵死亡密切相關(guān)[11]。溴域蛋白亞家族（bromodomain protein subfamily，BRDs）是癌細(xì)胞中最重要的表觀遺傳轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子之一，其特征在于代表性的溴域和末端外結(jié)構(gòu)域[12]。BRDs的4個(gè)家族成員已被鑒定：BRD2、BRD3、BRD4 和BRDT；其中BRD4在癌癥中的作用被研究得最充分[13]。最近研究證實(shí)，BRD4作為鐵死亡的表觀遺傳調(diào)控因子，抑制其表達(dá)被認(rèn)為是對血液和固體惡性腫瘤的一種有前途的治療[14-15]。然而，很少數(shù)研究探討B(tài)RD4介導(dǎo)的鐵死亡在乳腺癌化療耐藥性調(diào)節(jié)中的作用。本研究中，探討了BRD4敲低對乳腺癌細(xì)胞增殖和鐵死亡的影響，并進(jìn)一步以多柔比星抗性MDA-MB-231細(xì)胞（MDA-MB-231/DOX細(xì)胞）為對象，體外、體內(nèi)分析BRD4敲除對細(xì)胞DOX耐藥的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和動物

1.1.1 細(xì)胞 人乳腺癌細(xì)胞系（MDA-MB-231和BT549）購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，將細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)充有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中（美國Gibco公司）。多柔比星（Doxorubicin，DOX）抗性MDA-MB-231細(xì)胞亞系，稱為MDA-MB-231/DOX 細(xì)胞，通過將親代細(xì)胞連續(xù)暴露于濃度從10 nmol/L 逐步增加至1 μmol/L的多柔比星達(dá)約半年的時(shí)間建立，具體操作詳見課題組前期研究成果[16]。將MDA-MB-231/DOX細(xì)胞分為對照（Con）組、DOX 組和si-BRD4+DOX 組。si-BRD4+DOX 組在用si-BRD4 轉(zhuǎn)染MDA-MB-231/DOX 細(xì)胞48 h 后，用1 μmol/L DOX處理細(xì)胞24 h。Con組、DOX組分別用載體或1 μmol/L DOX處理細(xì)胞24 h。

1.1.2 動物 SPF級4周齡雌性BALB/c-nu小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司。所有小鼠飼養(yǎng)在無病原體環(huán)境下。

1.2 方法

1.2.1 定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）分析 分別使用RNAiso Plus、PrimeScript RT 試劑盒和TB Green Premix ExTaq（Tli RNase H Plus）（日本Takara公司）對細(xì)胞進(jìn)行RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR分析。由上海Sangon Biotech 公司合成BRD4和GAPDH的引物。序列如下：GAPDH-F：5'-CCTCTGACTTCAACAGCGAC-3'和GAPDH-R：5'-TCCTTTGTGCTCTTGCTGGC-3' 和BRD4-F：5'-TGCCCAGATAGCATCGTCC-3'和BRD4-R：5'-TCTTCTTCTGGTACAACTTCCAGT-3'。

1.2.2 細(xì)胞亞鐵離子、脂質(zhì)過氧化和谷胱甘肽/GSSG定量 通過FerroOrange（日本dojindo公司）檢測細(xì)胞亞鐵離子濃度，和通過liperfloo（日本dojindo公司）測量細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平，并在Axiovert A1熒光顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）觀察。

使用GSSG/谷胱甘肽定量試劑盒Ⅱ（日本dojindo公司）測定氧化型谷胱甘肽（Oxidized glutathione，GSSG）/谷胱甘肽含量。

1.2.3 siRNA、慢病毒合成和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 廣州RiboBio公司設(shè)計(jì)并合成了針對BRD4的小干擾RNA（siRNA）。在敲除效率驗(yàn)證后，將si-BRD4#1包裝到pGLV-h1-GFP-puro載體中用于進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)（慢病毒購自上海Genomeditech 公司）。siRNAs的序列如下：si-NC：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'；si-BRD4# 1：5'-CCUCUCUAUAAGUAUAAU-3'；si-BRD4# 2：5'-GAACGUUAUACAUAAGGU-3'；si-BRD4#3：5'-CGACGACGAAAGUUACGU-3'。siRNA轉(zhuǎn)染試劑為Lipo?fectamine RNAiMax試劑，購自美國Thermo Fisher公司。

1.2.4 細(xì)胞增殖能力和EdU 分析 將用siRNA 轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231 和BT549 細(xì)胞或用DOX 處理DOX 抗性乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231/DOX）接種到平板中。通過集落形成試驗(yàn)評估細(xì)胞增殖能力，和5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（EdU）分析（廣州RiboBio公司）DNA復(fù)制能力。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡分析 使用RIPA裂解緩沖液（上海Beyo?time公司）從細(xì)胞組織中提取總蛋白。使用BCA蛋白檢測試劑盒（上海Beyotime公司）測定蛋白濃度。蛋白質(zhì)樣品通過10% SDS-PAGE凝膠分離，然后轉(zhuǎn)移到0.22 μm聚偏二氟乙烯膜（美國Millipore公司）上。在室溫下用5%脫脂乳封閉膜1 h，并在4 ℃下與IKβ-α（1∶1 000，美國Proteintech公司）、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）（1∶1 000，美國CellSignaling Technology公司）、BRD4（1∶1000，美國Cell Signal?ing Technology公司）和GAPDH（1∶2000，美國Proteintech公司）第一抗體溫育過夜。第２天，在室溫下與辣根過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體（美國Cell Signaling Technology 公司）一起溫育1 h后，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）觀察目標(biāo)蛋白。

1.2.6 體內(nèi)動物研究 將15只雌性BALB/c-nu小鼠隨機(jī)分為3組：對照組、DOX組、DOX+si-BRD4組，每組5只，用于建立皮下接種模型。將1×10⁷ MDA-MB-231/DOX細(xì)胞或穩(wěn)定敲低BRD4 的 MDA-MB-231/DOX 細(xì)胞重懸于200 μL PBS中，并皮下植入小鼠的右側(cè)區(qū)域。當(dāng)皮下腫瘤達(dá)到50 mm³的平均尺寸時(shí)，DOX組和DOX+si-BRD4組每3天通過靜脈注射用2 mg/kg的DOX，對照組給予等體積的載體治療，共治療7次。每隔5 d用卡尺測量腫瘤大小，計(jì)算腫瘤體積：長×（寬）² /2。最后1次治療后第2天處死小鼠，對皮下腫瘤稱重、拍照，并用于IHC分析。

1.2.7 免疫組織化學(xué)（IHC）和TUNEL 分析 參照文獻(xiàn)方法[17]進(jìn)行IHC分析。本研究中使用的初級抗體如下：NF-κB（1∶200）、BRD4（1∶200）、4-羥基壬烯醛（1∶150，美國Ramp;Dsystem 公司）和Ki-67（1∶200，美國Cell Signaling Technology公司）。染色強(qiáng)度估計(jì)如下：0=陰性；1=弱；2=中等；3=強(qiáng)。通過將染色強(qiáng)度乘以陽性細(xì)胞的百分比來計(jì)算染色分?jǐn)?shù)。通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）分析（上海Beyotime公司）腫瘤組織中的凋亡細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）形式表達(dá)。2組或2組以上的比較用t 檢驗(yàn)或單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 BRD4敲除抑制乳腺癌體外增殖

為了確定BRD4的生物學(xué)功能，設(shè)計(jì)了3個(gè)siRNA序列并轉(zhuǎn)染到MDA-MB-231、BT549 細(xì)胞中。蛋白質(zhì)印跡和qRT-PCR分析顯示序列#1和#2具有高敲除效率，并可用于隨后的實(shí)驗(yàn)（圖1A、B）。與si-NC組相比，si-BRD4#1和si-BRD4#2 組MDA-MB-231、BT549 細(xì)胞的細(xì)胞克隆數(shù)（F=14.510、15.020，Plt;0.001）和EDU陽性染色（F=22.630、19.840，Plt;0.001）均顯著降低（圖1C、D）。這些發(fā)現(xiàn)表明BRD4敲除可以抑制乳腺癌增殖。

2.2 BRD4敲除誘發(fā)乳腺癌細(xì)胞鐵死亡

使用鐵橙熒光探針、Liperfluo探針觀察到細(xì)胞內(nèi)亞鐵離子和ROS水平。與si-NC組相比，si-BRD4#1和si-BRD4#2組MDA-MB-231、BT549 細(xì)胞亞鐵離子水平（F=6.840、7.410，均Plt;0.001）和ROS水平（F=7.820、8.260，均Plt;0.001）顯著升高（圖2A、B）。此外，si-BRD4#1 和si-BRD4#2 組MDA-MB-231、BT549細(xì)胞中GSSG/GSH 比值較si-NC 組均升高（F=12.810、14.520，Plt;0.001），GSH水平降低（F=5.430、18.050，Plt;0.01）（圖2C、D）。

2.3 BRD4/NF-κB信號通路參與乳腺癌細(xì)胞體外DOX耐藥

與親代細(xì)胞（MDA-MB-231）相比，在DOX抗性乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231/DOX）中檢測到BRD4 的mRNA（t=3.840，P=0.013）和蛋白質(zhì)表達(dá)水平升高（圖3A、B），表明其在DOX耐藥中的促進(jìn)作用。此外，DOX治療以劑量依賴和時(shí)間依賴的方式導(dǎo)致BRD4表達(dá)增加（圖3C）。

先前研究證實(shí)，BRD4/NF-κB信號通路參與介導(dǎo)乳腺癌進(jìn)展[18]。為了確定BRD4/NF-κB信號通路是否參與乳腺癌細(xì)胞體外DOX 耐藥，研究以MDA-MB-231/DOX 細(xì)胞作為研究對象，用siRNA 敲低BRD4表達(dá)。結(jié)果顯示，與Con組相比，DOX 組細(xì)胞中IKβ-α、NF-κB、BRD4 表達(dá)增加（Plt;0.05），相反，si-BRD4+DOX組細(xì)胞中IKβ-α、NF-κB、BRD4表達(dá)較DOX 組降低（F=21.860、45.370、25.630，均Plt;0.001）（圖3D、E）。

2.4 BRD4 敲除體外降低MDA-MB-231/DOX 細(xì)胞的DOX耐藥

與Con組相比，DOX組MDA-MB-231/DOX細(xì)胞的細(xì)胞克隆數(shù)和EDU 陽性染色均降低（Plt;0.05），ROS 水平升高（Plt;0.05）。與DOX 組相比，DOX+si-BRD4 組MDA-MB-231/DOX 細(xì)胞的細(xì)胞克隆數(shù)和EDU 陽性染色進(jìn)一步降低（F=21.030、26.680，均Plt;0.001），ROS 水平進(jìn)一步升高（F=35.760，Plt;0.001）（圖4）。

2.5 BRD4敲除增強(qiáng)了DOX的體內(nèi)抗腫瘤作用為了研究體內(nèi)鐵死亡，將用si-BRD4 轉(zhuǎn)導(dǎo)MDA-MB-231/DOX細(xì)胞注射入BALB/c-nu小鼠，隨后接受DOX治療。

與對照組相比，DOX組腫瘤重量和體積均減少（Plt;0.05），并且腫瘤組織中TUNEL染色細(xì)胞增加（Plt;0.05）。此外，BRD4+DOX 組腫瘤重量和體積較DOX 組進(jìn)一步降低（F=19.130、21.740，均Plt;0.001），和TUNEL 染色細(xì)胞進(jìn)一步增加（F=32.050，Plt;0.001）（圖5A～D）。IHC分析了異種移植物，BRD4+DOX組腫瘤組織中Ki-67、BRD4、NF-κB較DOX組下調(diào)（F=15.620、32.150、18.090，均Plt;0.001），4-HNE上調(diào)（F=11.240，Plt;0.01）（圖5E）。4-HNE是代表脂質(zhì)過氧化活化和鐵死亡的重要指標(biāo)。這些發(fā)現(xiàn)表明，BRD4敲除在體內(nèi)誘導(dǎo)鐵死亡。

3 討 論

由于缺乏ER、PR和HER2受體，沒有理想的目標(biāo)可用于有效治療TNBC[19]。化療仍然是大多數(shù)TNBC患者的一線治療方案[20]。然而，TNBC是一種侵襲性表型，通常對化療耐藥，導(dǎo)致疾病進(jìn)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，這是超過90%的TNBC患者死亡的原因[21]。

因此，尋找能夠闡明潛在機(jī)制并用于克服耐藥性的新靶點(diǎn)對于改善乳腺癌患者的預(yù)后至關(guān)重要。在目前的研究中，本研究證實(shí)BRD4可以防止乳腺癌細(xì)胞化療誘導(dǎo)的鐵死亡，并在介導(dǎo)乳腺癌化療耐藥中發(fā)揮重要作用。

鐵死亡是一種程序性細(xì)胞死亡的非凋亡形式，其特征是磷脂的鐵依賴性過氧化積累，由細(xì)胞代謝、氧化還原穩(wěn)態(tài)和各種癌癥相關(guān)信號通路調(diào)節(jié)[6]。

據(jù)報(bào)道，鐵死亡通過調(diào)節(jié)各種腫瘤特性在抑制乳腺癌生長中起著關(guān)鍵作用[22-23]。因此，通過靶向鐵死亡相關(guān)基因誘導(dǎo)鐵死亡已成為對抗腫瘤進(jìn)展和化療耐藥的治療策略。新出現(xiàn)的證據(jù)表明，鐵死亡相關(guān)基因（如ACSL4、GPX4）可以作為患者預(yù)后和治療效果的指標(biāo)[24]。然而，許多分子可能在鐵死亡的整個(gè)過程中起重要作用。因此，需要更多的研究來揭示鐵死亡在乳腺癌進(jìn)展和化療耐藥中的作用和機(jī)制。表觀遺傳讀碼器BRD4是溴域和末端外蛋白家族的成員，其特征在于2個(gè)保守的N-末端溴域和一個(gè)末端外域[25]。全基因組研究表明，BRD4存在于相當(dāng)大比例的活性啟動子和增強(qiáng)子區(qū)域，包括超級增強(qiáng)子[26]。最近研究發(fā)現(xiàn)BRD4在基因表達(dá)調(diào)節(jié)中的作用涉及鐵死亡相關(guān)基因GPX4、BRD4和SLC3A2的表達(dá)，并且BRD4敲除可以在各種癌細(xì)胞系和小鼠腫瘤異種移植物中增加鐵水平，導(dǎo)致ROS積累，并最終誘導(dǎo)鐵死亡[27]。與先前研究一致，發(fā)現(xiàn)BRD4敲除通過誘導(dǎo)鐵死亡抑制乳腺癌細(xì)胞的體外增殖。這些發(fā)現(xiàn)有助于在TNBC治療中靶向BRD4。

DOX是一種細(xì)胞毒性蒽環(huán)類抗生素，廣泛用于治療多種癌癥，被認(rèn)為是乳腺癌化療的基礎(chǔ)。越來越多的研究表明，DOX 通過抑制DNA 復(fù)制和產(chǎn)生H2O2來促進(jìn)癌細(xì)胞死亡，H2O2是導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增加的芬頓反應(yīng)底物[28]。因此，DOX可能通過間接誘導(dǎo)鐵死亡來殺死癌細(xì)胞。最近研究報(bào)道，DOX治療顯著增加了乳腺癌細(xì)胞中的ROS和MDA水平，乳腺癌細(xì)胞是鐵死亡的關(guān)鍵執(zhí)行者[7]。本研究結(jié)果揭示了乳腺癌中DOX 介導(dǎo)的BRD4的上調(diào)，表明BRD4可能參與了DOX 誘導(dǎo)的鐵死亡的調(diào)節(jié)，并與DOX耐藥性相關(guān)。考慮到鐵死亡以ROS水平升高和脂質(zhì)過氧化為特征，研究將DOX和BRD4抑制誘導(dǎo)的鐵死亡結(jié)合起來，并發(fā)現(xiàn)BRD4敲除體外、體內(nèi)降低了MDA-MB-231/DOX細(xì)胞的DOX耐藥。

NF-κB在人類癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥中起著重要作用。由于炎癥微環(huán)境和各種致癌突變，許多人類癌癥表現(xiàn)出組成型NF-κB活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，增加血管生成，抑制凋亡，還誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[17]。NF-κB在賴氨酸-310（AcLys310）的乙?；龠M(jìn)NF-κB靶基因表達(dá)，并有助于在癌癥中維持組成型NF-κB活性[29]。BRD4與AcLys310結(jié)合，作為一種調(diào)節(jié)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的共激活因子。此外，最近研究發(fā)現(xiàn)BRD4可以與IKβ-α結(jié)合，并促進(jìn)泛素化介導(dǎo)的IKβ-α降解，從而導(dǎo)致骨髓細(xì)胞中核轉(zhuǎn)位和NF-κB活性增強(qiáng)[30]。在進(jìn)一步研究中，發(fā)現(xiàn)在DOX處理的MDA-MB-231/DOX細(xì)胞和異種移植腫瘤中IKβ-α、NF-κB、BRD4表達(dá)增加，用siRNA敲低BRD4表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞中IKβ-α、NF-κB表達(dá)降低，并且細(xì)胞增殖和腫瘤進(jìn)展速度較單用DOX組進(jìn)一步減緩，表明BRD4/NF-κB信號通路可能與乳腺癌細(xì)胞耐藥相關(guān)。因此，靶向BRD4可能體現(xiàn)了一種治療具有組成型活性NF-κB的癌癥新策略。

總之，本課題組的研究結(jié)果揭示了BRD4是一個(gè)重要的耐藥因子，它可以通過促進(jìn)NF-κB信號通路的激活來抑制乳腺癌化療誘導(dǎo)的鐵死亡。因此，靶向BRD4和聯(lián)合使用抗癌藥物誘導(dǎo)鐵死亡將是一種克服乳腺癌化療耐藥性的潛在治療策略。然而，本研究僅以三陰性乳腺癌細(xì)胞系作為研究模型，得出的結(jié)果結(jié)論僅能一定程度上代表三陰性乳腺癌相關(guān)特征與機(jī)制，其他分子分型是否相同尚未知，在未來的研究中旨在進(jìn)一步深入分子位點(diǎn)機(jī)制研究，并擴(kuò)大到其他分子分型乳腺癌。

（責(zé)任編輯：周一青）