智慧 馮祥 張宇星 李武 艾坤 黃文韜 李江山

〔摘要〕 目的 觀察直推督脈對(duì)孤獨(dú)癥譜系障礙（autism spectrum disorder， ASD）模型鼠室旁核（paraventricular nucleus， PVN）區(qū)催產(chǎn)素（oxytocin， OXT）神經(jīng)元活性及認(rèn)知功能的影響，探討直推督脈對(duì)ASD的作用及潛在機(jī)制。方法 采用腹腔注射丙戊酸鈉的方法構(gòu)建ASD模型。隨機(jī)取7只孕12.5 d的SD大鼠腹腔注射丙戊酸鈉，3只腹腔注射生理鹽水。孕鼠產(chǎn)仔后第21天，剔除雌性幼鼠，將剩余雄性幼鼠分為空白組、模型組、直推督脈組、藥物注射組，每組5只?？瞻捉M、模型組給予腹腔注射同等劑量生理鹽水；直推督脈組予以直推督脈的干預(yù)方式，20 min/次，一日2次，并予以腹腔注射同等劑量生理鹽水；藥物注射組以每日0.1 mg/kg的劑量腹腔注射OXT，以上干預(yù)均連續(xù)14 d。第35天進(jìn)行高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)以判斷其焦慮情緒和認(rèn)知能力；通過免疫熒光染色法標(biāo)記PVN區(qū)OXT與c-Fos蛋白、海馬區(qū)OXT與催產(chǎn)素受體（oxytocin receptor， OXTR）；Western blot法檢測(cè)海馬區(qū)OXTR蛋白表達(dá)水平；ELISA法檢測(cè)幼鼠海馬區(qū)與下丘腦中的OXT含量。結(jié)果 與空白組相比，模型組開放臂活動(dòng)時(shí)間縮短、開放臂進(jìn)入次數(shù)減少（P＜0.01）；逃避潛伏期增加、平臺(tái)所在區(qū)域活動(dòng)路程減少（P＜0.05，P＜0.01）；PVN區(qū)OXT神經(jīng)元與c-Fos陽性表達(dá)、海馬區(qū)OXT與OXTR結(jié)合的陽性表達(dá)、海馬區(qū)OXTR蛋白表達(dá)均減少（P＜0.01）；下丘腦與海馬區(qū)OXT含量下降（P＜0.01）。與模型組相比，直推督脈組、藥物注射組的開放臂活動(dòng)時(shí)間增長、開放臂進(jìn)入次數(shù)增加（P＜0.05，P＜0.01）；逃避潛伏期縮短、平臺(tái)所在區(qū)域活動(dòng)路程增加（P＜0.05，P＜0.01）；PVN區(qū)OXT神經(jīng)元與c-Fos陽性表達(dá)、海馬區(qū)OXT與OXTR結(jié)合的陽性表達(dá)、海馬區(qū)OXTR的蛋白表達(dá)水平均增加（P＜0.01）；下丘腦、海馬區(qū)OXT含量上升（P＜0.01）。結(jié)論 直推督脈可以改善ASD模型鼠的認(rèn)知功能，其機(jī)制可能與PVN區(qū)OXT神經(jīng)元被激活，OXT水平升高，從而增加其與海馬區(qū)OXTR結(jié)合相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 孤獨(dú)癥譜系障礙；推拿；督脈；認(rèn)知功能；催產(chǎn)素神經(jīng)元

〔中圖分類號(hào)〕R244.1? ? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.06.014

Effects of straight pushing the Du meridian on the oxytocin

neurons in the PVN region and the cognitive function of

autism spectrum disorder model rats

ZHI Hui1， FENG Xiang1， ZHANG Yuxing1， LI Wu1， AI Kun1， HUANG Wentao2*， LI Jiangshan1*

1. College of Acupuncture， Tuina， and Rehabilitation， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

2. The Second Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the effects of straight pushing the Du meridian （SPDM） on the activity of oxytocin （OXT） neurons in the paraventricular nucleus （PVN） region and the cognitive function of autism spectrum disorder （ASD） model rats， and to explore the effects and potential mechanism of SPDM on ASD. Methods The ASD model was established by intraperitoneal injection of sodium valproate. Seven SD rats at 12.5 days of pregnancy were randomly selected and sodium valproate was then injected into the abdominal cavity， while three other rats were injected with physiological saline into the abdominal cavity. On the 21st day after birth， female young rats were excluded and the remaining male young rats were divided into blank group， model group， SPDM group， and drug injection group， with five rats in each group. The blank group and model group were given intraperitoneal injection of the same dose of physiological saline; the SPDM group was intervened by SPDM for 20 minutes per time， twice a day， and the same dose of physiological saline was injected into the abdominal cavity; the drug injection group received intraperitoneal injection of OXT at a daily dose of 0.1 mg/kg， and the above interventions were continuous for 14 d. On the 35th day， elevated cross maze and Morris water maze experiments were conducted to assess the rats' anxiety and cognitive abilities; immunofluorescence staining was used to label OXT and c-Fos proteins in the PVN region， as well as OXT and oxytocin receptor （OXTR） in the hippocampus; Western blot was used to check the expression levels of OXTR protein in the hippocampus; ELISA method was used to determine the content of OXT in the hippocampus and hypothalamus of young rats. Results Compared with the blank group， the model group had shorter open arm activity time and fewer open arm entry times （P<0.01）; increased escape latency （P<0.05） and decreased distance of the platform's quadrant （P<0.01）; reduced positive expressions of OXT neurons and c-Fos in the PVN region， the positive expressions of OXT and OXTR binding in the hippocampus， and the OXTR protein expressions in the hippocampus （P<0.01）; and the lower OXT content in the hypothalamus and hippocampus regions （P<0.01）. Compared with those of model group， the open arm range of activity increased and the number of open arm entries increased in SPDM group and drug injection group （P<0.05， P<0.01）， while the escape latency shortened and the range of activity in the quadrant where the platform was located increased （P<0.05， P<0.01）; the positive expressions of OXT neurons and c-Fos in the PVN region， the positive expressions of OXT and OXTR binding in the hippocampus， and the expressions of OXTR in the hippocampus all increased （P<0.01）; the OXT content in the hypothalamus and hippocampus increased （P<0.01）. Conclusion SPDM can improve cognitive function of ASD model rats， and its mechanism may be related to the activation of OXT neurons in the PVN region， which in turn increases OXT levels and thus strengthens their binding with hippocampal OXTR.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 autism spectrum disorder; Tuina; the Du meridian; cognitive function; oxytocin neuron

孤獨(dú)癥譜系障礙（autism spectrum disorder， ASD），又稱自閉癥，屬于神經(jīng)發(fā)育障礙類疾病之一，常表現(xiàn)為社交障礙、認(rèn)知困難、刻板行為以及興趣狹隘等一系列癥狀[1]。目前，在全球范圍內(nèi)ASD已呈現(xiàn)出逐年增長的發(fā)病趨勢(shì)[2]，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量并加重家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。然而，ASD的發(fā)病原因至今尚未明確，導(dǎo)致暫未形成針對(duì)病因的治療方案。盡管美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)兩種可用于治療兒童ASD的藥物，即阿立哌唑與利培酮，但二者均存在嚴(yán)重不良反應(yīng)，如體質(zhì)量增加、睡眠問題、自傷行為等[4]。因此，當(dāng)前多以康復(fù)干預(yù)、針灸、推拿等輔助療法改善其臨床癥狀。

催產(chǎn)素（oxytocin， OXT）作為一種肽類激素，在室旁核（paraventricular nucleus， PVN）和視上核（supr？鄄aoptic nucleus，SON）中合成，并通過垂體儲(chǔ)存、釋放進(jìn)入血液，發(fā)揮外周效應(yīng)[5]。除刺激泌乳和收縮子宮的功能外，OXT還通過神經(jīng)投射與其受體結(jié)合的方式產(chǎn)生中樞效應(yīng)，在介導(dǎo)社會(huì)認(rèn)知、社會(huì)交流等方面具有重要作用[6]。近年來，OXT被認(rèn)為可能是參與ASD發(fā)病的因素之一。諸多研究表明[7-8]，ASD患者體內(nèi)的OXT含量異于正常健康人，可表現(xiàn)為OXT水平低下、催產(chǎn)素受體（oxytocin receptor， OXTR）結(jié)合異常等。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明[9]，敲除小鼠腦中的OXTR基因后，小鼠表現(xiàn)出低社會(huì)識(shí)別能力等ASD樣行為。而經(jīng)外源補(bǔ)充或者內(nèi)源刺激可提升ASD患者的認(rèn)知能力，并改善ASD患者的社交缺陷、面部表情識(shí)別困難等癥狀[10-11]。故提升OXT水平可能是改善ASD患者認(rèn)知障礙的一種有效干預(yù)方式。

推拿作為中醫(yī)學(xué)中外治法的重要組成部分，具有無痛、無不良反應(yīng)的特點(diǎn)?，F(xiàn)已證明，推拿可以促進(jìn)OXT的釋放[12]，這可能與推拿可激活C類觸覺傳入纖維有關(guān)[13]。MT等[14]對(duì)20名4～7歲的ASD患兒進(jìn)行長達(dá)2年的推拿干預(yù)發(fā)現(xiàn)，ASD患兒對(duì)面部表情的反應(yīng)能力得到提升，并有26%的患兒經(jīng)診斷已無ASD的核心癥狀。ASD患兒在接受推拿之后，其唾液中的OXT水平增加的同時(shí)，社交能力也有所改善[15-16]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，ASD的病位在腦，《靈樞·邪氣臟腑病形》中提到“病變?cè)谀X，首取督脈”，督脈素有“陽脈之?！敝Q，通過調(diào)節(jié)督脈之經(jīng)氣可達(dá)到調(diào)控體內(nèi)陽氣的目的。督脈入屬于腦，腦為髓海，陽氣充盛則髓海得養(yǎng)，從而推動(dòng)腦的生理功能正常運(yùn)轉(zhuǎn)。目前，研究人員以針刺或推拿為施術(shù)方法，以督脈為切入點(diǎn)建立的干預(yù)方案可有效緩解ASD患者的認(rèn)知、社交障礙和焦慮情緒，提高語言交流能力以及眼神接觸能力[17-18]。但直推督脈能否通過促進(jìn)OXT的釋放并對(duì)認(rèn)知功能產(chǎn)生影響尚未可知。因此，本研究以ASD模型鼠為研究對(duì)象，以直推督脈為施術(shù)方式，探究直推督脈對(duì)ASD模型鼠OXT水平及認(rèn)知功能的影響，為臨床干預(yù)提供科學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1? 動(dòng)物來源與模型制備

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)SD孕鼠10只，孕12.5 d，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證編號(hào)：SYXK（湘）2019-0004，單籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)溫度為24～26 ℃，濕度為50%～70%，晝夜各半。本次實(shí)驗(yàn)方案已通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（倫理編號(hào)：LL202201180002）。本研究將10只孕鼠隨機(jī)分成兩組，7只以600 mg/kg的劑量腹腔注射丙戊酸鈉，以構(gòu)建ASD模型[19]，根據(jù)幼鼠行為學(xué)檢測(cè)（高架十字迷宮、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)）結(jié)果，以存在焦慮情緒和認(rèn)知障礙作為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)[20]。3只孕鼠腹腔注射同等劑量生理鹽水，作為ASD對(duì)照組。在幼鼠出生后的第21天從ASD對(duì)照組產(chǎn)下的子代雄鼠中，隨機(jī)選取5只為空白組；剔除ASD模型產(chǎn)下的子代雌鼠，剩余子代雄鼠15只，隨機(jī)分為模型組、直推督脈組、藥物注射組，每組5只。

1.2? 主要儀器與試劑

高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)（北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司，型號(hào)：ZS-DSG）；Morris水迷宮（上海欣軟信息技術(shù)有限公司，型號(hào)：XR-XM101）；正置熒光顯微鏡、成像系統(tǒng)（日本尼康儀器有限公司，型號(hào)：NikonEclipseC1、NikonDS-U3）；推法刺激器（自制研發(fā)，專利號(hào)：ZL202121852010.X）。

丙戊酸鈉、OXT（美國MedChem express公司，批號(hào)：HY-10585A、HY-17571A）；OXTR抗兔抗體（成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：R389033）；OXT神經(jīng)毒素1、c-Fos多克隆抗體（6A3）（湖南艾方生物科技有限公司，批號(hào)：AF02963、AF11092）。

1.3? 實(shí)驗(yàn)方法

直推督脈組的幼鼠予以推法刺激器順督脈循行方向進(jìn)行直推的操作。督脈定位參照2014年版《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸手冊(cè)》[21]，操作范圍為尾根沿后正中線上至百會(huì)穴，施術(shù)寬度為0.8 cm。將直推督脈組的幼鼠俯臥位放置，推法頻率100次/min，壓力100 g，操作距離100 mm，操作20 min，每日2次，分別于上午10：00與下午4：00時(shí)進(jìn)行操作，并給予腹腔注射同等劑量生理鹽水，每日1次，連續(xù)14 d。藥物注射組每日以0.1 mg/kg的劑量腹腔注射OXT，每日1次，共14 d，空白組、模型組幼鼠均正常飼養(yǎng)，并給予腹腔注射同等劑量生理鹽水，每日1次，共14 d。。

1.4? 行為學(xué)檢測(cè)

1.4.1? 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)? 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)[22]是針對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象焦慮狀態(tài)的檢測(cè)。分別由兩個(gè)開放臂、閉合臂交叉組成，臂長50 cm、臂寬10 cm、臂高30 cm，兩者重合區(qū)域?yàn)橹行膮^(qū)。實(shí)驗(yàn)開始之前將幼鼠放置于迷宮之中，使其熟悉環(huán)境。實(shí)驗(yàn)正式開始時(shí)，以中心區(qū)作為起始點(diǎn)，將幼鼠放至中心區(qū)后計(jì)時(shí)10 min，觀察其在設(shè)定時(shí)間內(nèi)，在高架十字迷宮中的運(yùn)動(dòng)軌跡，以及在開放臂的運(yùn)動(dòng)時(shí)間和路程。一次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用75%乙醇擦拭開放臂、閉合臂以消除氣味，待儀器干燥后放入下一只待測(cè)幼鼠。

1.4.2? Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)? Morris水迷宮[23]是檢測(cè)認(rèn)知能力的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)之一，主要檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)能力和空間記憶能力。迷宮由直徑1 200 cm的圓柱形水池及可固定平臺(tái)組成。將水池平分成4個(gè)象限，分別記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限。將平臺(tái)固定放置于某一象限，并放水沒過平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行6 d。第1、2天為訓(xùn)練期，將幼鼠從Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限放入水中，記錄其在120 s內(nèi)到達(dá)平臺(tái)的時(shí)間。若120 s未找到平臺(tái)，在計(jì)時(shí)結(jié)束之后，將幼鼠引導(dǎo)至平臺(tái)并停留20 s。分別記錄第3、4、5天從Ⅰ～Ⅳ象限入水的平均逃避潛伏期，即120 s內(nèi)幼鼠從入水到登上平臺(tái)的時(shí)間，以觀察其學(xué)習(xí)認(rèn)知能力，如未登上平臺(tái)則記為120 s。第6天將平臺(tái)撤去，將4組幼鼠從Ⅱ象限放入水中，記錄幼鼠在原平臺(tái)所在象限的路程，檢測(cè)空間記憶能力。

1.5? 樣本采集

14 d干預(yù)結(jié)束并進(jìn)行動(dòng)物行為學(xué)檢測(cè)之后，將各組幼鼠以戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，充分暴露心臟，剪去心耳，進(jìn)行灌注。使用高溫滅菌手術(shù)器械將一側(cè)腦組織的海馬取出，放至液氮中，后轉(zhuǎn)運(yùn)至-80 ℃冰箱，用以Western blot檢測(cè)；另一側(cè)取腦組織放入4%多聚甲醛中固定48 h，以進(jìn)行免疫熒光染色。

1.6? 免疫熒光雙標(biāo)染色觀察PVN區(qū)OXT、c-Fos和海馬區(qū)OXT、OXTR共表達(dá)情況

將包含海馬區(qū)、下丘腦的腦組織固定48 h，梯度乙醇脫水后，進(jìn)行石蠟包埋。隨后以4 μm的厚度連續(xù)切片。石蠟切片在經(jīng)過脫蠟、抗原修復(fù)后加入自發(fā)熒光淬滅劑。處理完成后滴加BSA孵育，孵育結(jié)束后分別滴加一抗、二抗，并用DAPI復(fù)染細(xì)胞核，最終封片、鏡檢拍照。

1.7? Western blot檢測(cè)海馬區(qū)OXTR表達(dá)量

將海馬區(qū)放入離心管中，加入裂解液與蛋白酶抑制劑后，充分勻漿。4 ℃，5 000 r/min，離心15 min（離心半徑9.81 cm），收集上清液。利用BCA蛋白測(cè)定法檢測(cè)蛋白濃度。使用蛋白上樣緩沖液將蛋白定量為4 μg/mL，放于-20 ℃冰箱保存。使用10%的SDS-PAGE分離膠、5%的濃縮膠，經(jīng)過電泳之后，將PVDF膜覆蓋于凝膠上，利用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。脫脂牛奶封閉2 h后，TBST沖洗3次，每次10 min。將一抗OXTR抗兔抗體（1∶1 000）倒入孵育盒中，以覆蓋PVDF膜為準(zhǔn)，4 ℃過夜。第二天TSBT洗膜3次，孵育二抗（1∶10 000）1 h后再次將PVDF膜沖洗3次，曝光顯影。最終結(jié)果以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值呈現(xiàn)。

1.8? ELISA法檢測(cè)下丘腦、海馬區(qū)OXT濃度

使用PBS將下丘腦、海馬區(qū)的殘留血液沖洗干凈后進(jìn)行稱重，并將其充分剪碎。按照1∶9的比例將剪碎的組織與PBS放入離心管中，每管分別加入蛋白酶抑制劑。將離心管置于提前預(yù)冷的高速研磨機(jī)中使其充分研磨。將離心管取出，放入4 ℃的離心機(jī)中，5 300 r/min離心5 min（離心半徑9.81 cm），提取上清液，用ELISA試劑盒檢測(cè)其OXT含量。

1.9? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“ｘ±s”表示。滿足正態(tài)性和方差齊性則用單因素方差分析并結(jié)合LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較；當(dāng)方差不齊時(shí)則用韋爾奇方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與空白組相比，模型組幼鼠在開放臂的活動(dòng)時(shí)間縮短、進(jìn)入開放臂的次數(shù)減少（P＜0.01）。與模型組相比，直推督脈組、藥物注射組在開放臂的活動(dòng)時(shí)間均延長（P＜0.01），開放臂進(jìn)入的次數(shù)增加（P＜0.05，P＜0.01）。詳見圖1。

2.2? Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與空白組相比，模型組幼鼠的平均逃避潛伏期延長（P＜0.01），平臺(tái)所在區(qū)域的活動(dòng)路程縮短（P＜0.05）。與模型組相比，直推督脈組和藥物注射組幼鼠的平均逃避潛伏期縮短（P＜0.01），平臺(tái)區(qū)域活動(dòng)路程增長（P＜0.01）。詳見圖2。

2.3? 下丘腦PVN區(qū)OXT神經(jīng)元表達(dá)結(jié)果

與空白組相比，模型組共定位的陽性細(xì)胞數(shù)量占比減少（P＜0.01）。與模型組相比，直推督脈組與藥物注射組共定位的陽性細(xì)胞數(shù)量占比增加（P＜0.01）。詳見圖3。

2.4? 海馬區(qū)OXT與OXTR熒光染色結(jié)果比較

與空白組相比，模型組海馬區(qū)OXT與OXTR雙染的陽性細(xì)胞數(shù)量占比減少（P＜0.01）。與模型組相比，直推督脈組與藥物注射組OXT與OXTR雙染的陽性細(xì)胞數(shù)量占比增多（P＜0.01）。詳見圖4。

2.5? 海馬區(qū)OXTR蛋白表達(dá)結(jié)果比較

與空白組相比，模型組的OXTR的表達(dá)量下降（P＜0.01）。與模型組相比，直推督脈組與藥物注射組的OXTR表達(dá)水平升高（P＜0.01）。詳見圖5。

2.6? 下丘腦、海馬區(qū)OXT表達(dá)水平比較

與空白組相比，模型組下丘腦、海馬區(qū)OXT水平均降低（P＜0.01）。與模型組相比，直推督脈組和藥物注射組下丘腦、海馬區(qū)OXT水平均升高（P＜0.01）。詳見圖6。

3 討論

中醫(yī)學(xué)并無關(guān)于ASD的名稱記載，但其中所描述的“語遲”“胎弱”“童昏”的癥狀與ASD發(fā)育遲緩、認(rèn)知缺陷、表情淡漠等臨床表現(xiàn)相似，均由生長發(fā)育和精神思維異常導(dǎo)致，屬神之病變[24]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病的病位在腦，腦為元神之府，主宰人體的生命活動(dòng)，元神神機(jī)失養(yǎng)則出現(xiàn)發(fā)育遲緩、認(rèn)知異常、語言混亂的表現(xiàn)[25]。從中醫(yī)的經(jīng)絡(luò)理論出發(fā)，腦與督脈密切聯(lián)系[26]?！岸矫}者，起于下極之俞……入屬于腦”，說明督脈通過循行以入腦，從而參與調(diào)節(jié)腦的生理功能[27]。督脈為“陽脈之海”，手足三陽經(jīng)均通過大椎穴匯入督脈而入腦。督脈陽氣不足，無力上充腦竅將導(dǎo)致ASD患者出現(xiàn)沉默不語、反應(yīng)遲緩或自言自語的癥狀。現(xiàn)代研究表明，督脈是交感神經(jīng)與副交感神經(jīng)中樞所在之處，其循行范圍、作用與皮質(zhì)脊髓束的走向和功能大致相同，可以維持大腦正常的生理功能[28]。前期研究發(fā)現(xiàn)，以督脈為核心制定的推拿方案可有效改善ASD患兒的社交障礙、刻板行為以及縮短與他人眼神接觸的反映時(shí)間等[29-30]。因而，治療ASD可從督脈入手。本研究結(jié)果顯示，干預(yù)后，直推督脈組、藥物注射組開放臂的活動(dòng)時(shí)間與進(jìn)入次數(shù)、水迷宮平臺(tái)所在象限的活動(dòng)路程均增加，平均逃避潛伏期縮短。表明通過直推督脈，可改善ASD幼鼠的焦慮和認(rèn)知情況，而焦慮情況的緩解有利于認(rèn)知能力的提升，兩者之間存在相互影響的關(guān)系[31]。

OXT在促進(jìn)社會(huì)交流、社會(huì)認(rèn)知以及共情能力等方面發(fā)揮著重要的作用[32-33]。OXT在下丘腦PVN區(qū)分泌，并通過神經(jīng)纖維投射等方式傳遞至海馬區(qū)、杏仁核、前額葉等相關(guān)腦區(qū)，與其中的OXTR結(jié)合以發(fā)揮作用[34]。下丘腦PVN區(qū)的OXT系統(tǒng)受損，將會(huì)影響OXT的分泌[35]。研究人員發(fā)現(xiàn)，ASD患者下丘腦分泌OXT的能力不及正常健康人[36]。因此，提高ASD患者下丘腦OXT神經(jīng)元的興奮性，促進(jìn)OXT的分泌是改善ASD患者臨床癥狀的潛在干預(yù)方式。c-Fos蛋白是PVN區(qū)OXT神經(jīng)元激活的標(biāo)志，輕柔體表刺激可激發(fā)大鼠PVN區(qū)OXT神經(jīng)元c-Fos蛋白的表達(dá)[37-38]。本研究通過免疫熒光雙標(biāo)染色法對(duì)4組幼鼠PVN區(qū)OXT神經(jīng)元與c-Fos蛋白共同標(biāo)記，結(jié)果顯示模型組幼鼠PVN區(qū)共定位的陽性細(xì)胞占比均少于空白組、直推督脈組、藥物注射組。下丘腦的OXT含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組OXT含量明顯低于其余3組，說明直推督脈可激活A(yù)SD模型鼠PVN區(qū)OXT神經(jīng)元，刺激OXT含量的升高，為其投射至遠(yuǎn)隔腦區(qū)提供了基礎(chǔ)。

下丘腦PVN區(qū)OXT神經(jīng)元以神經(jīng)投射的方式傳遞至廣泛的腦區(qū)，其中包括海馬區(qū)[39-40]。海馬區(qū)為調(diào)控機(jī)體認(rèn)知、學(xué)習(xí)功能的關(guān)鍵腦區(qū)。有證據(jù)表明，OXT可以調(diào)控海馬CA2區(qū)神經(jīng)元的放電模式以調(diào)控海馬區(qū)內(nèi)部的信息傳遞，且海馬CA2區(qū)正是影響社會(huì)記憶與認(rèn)知的重要結(jié)構(gòu)[41]。海馬區(qū)OXTR的表達(dá)在調(diào)控學(xué)習(xí)認(rèn)知功能方面發(fā)揮了重要作用[42]。因此，上述研究共同表明OXT、OXTR兩者相互協(xié)作共同參與海馬區(qū)調(diào)控認(rèn)知的功能。研究證實(shí)，ASD患者的海馬區(qū)功能受損，且通過功能磁共振成像發(fā)現(xiàn)，ASD患者海馬區(qū)中與調(diào)控情景記憶的網(wǎng)絡(luò)連接減弱[43]。然而，有證據(jù)顯示，通過補(bǔ)充OXT可以改善ASD小鼠的社會(huì)功能并重塑海馬回路，提升學(xué)習(xí)記憶能力[44]。長期鼻飼OXT可部分改變ASD模型鼠海馬區(qū)中與ASD樣行為相關(guān)的分子途徑，下調(diào)差異基因[45]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，直推督脈組、藥物注射組海馬區(qū)OXT的含量均高于模型組，提示直推督脈可以升高海馬區(qū)OXT的含量；模型組海馬區(qū)的OXTR蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，而直推督脈組幼鼠的OXTR蛋白表達(dá)水平上調(diào)；模型組海馬區(qū)OXT與OXTR共表達(dá)的陽性細(xì)胞占比少于直推督脈組、藥物注射組。因而推斷直推督脈可以改善ASD模型鼠OXT神經(jīng)元的投射異常，增加海馬區(qū)OXT與OXTR的結(jié)合，改善ASD模型鼠的認(rèn)知能力。

綜上所述，直推督脈能夠改善ASD模型鼠的認(rèn)知功能，其機(jī)制可能與PVN區(qū)OXT神經(jīng)元被激活，從而促進(jìn)OXT分泌并使其與海馬區(qū)OXTR結(jié)合相關(guān)。

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