摘要：為探究低鹽條件下副溶血弧菌脅迫對蛤仔存活、消化腺組織及基因表達的影響，開展了不同鹽度和副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）雙因素互作脅迫對菲律賓蛤仔的影響研究。結(jié)果表明，在鹽度和副溶血弧菌濃度分別為16‰-108 CFU/mL、16‰-107 CFU/mL和16‰-106 CFU/mL條件下處理蛤仔48 h的死亡率為100%。對蛤仔消化腺組織的切片觀察發(fā)現(xiàn)，低鹽條件下，相對于對照組（0 h），弧菌感染組中消化腺組織隨時間的增加內(nèi)腺管結(jié)構(gòu)開始逐漸排列松散，大量的腺管出現(xiàn)上皮細胞脫落，管腔內(nèi)可見脫落的上皮細胞，炎癥細胞浸潤面積逐漸增多。利用熒光定量PCR檢測蛤仔消化腺中免疫基因時序表達發(fā)現(xiàn)基因在低鹽和弧菌雙重脅迫下Rho GTP、CD-MPR、Big Defensin、CfC1qDC、RpLysBp和PGRPs基因被顯著誘導(dǎo)表達，表明低鹽條件下這些免疫基因響應(yīng)了副溶血弧菌的侵染。

關(guān)鍵詞：菲律賓蛤仔；副溶血弧菌；鹽度；消化腺組織切片；免疫基因

中圖分類號：S966.2 Q178.1""" 文獻標識碼：A

基金項目：遼寧省自然科學(xué)基金聯(lián)合基金“博士科研啟動項目”（2023-BSBA-013）

作者簡介：陳俊影（1999—），女，碩士研究生，主要從事貝類遺傳育種與繁殖研究。E-mail：2298631811@qq.com

通訊作者：李東東（1994—），男，博士，講師，主要從事灘涂貝類先天免疫與病害防控研究。E-mail：lidongdong@dlou.edu.cn

弧菌屬（Vibrio）隸屬于弧菌科（Vibrionaceae）［1］，研究表明常見的弧菌屬會引起水產(chǎn)動物疾病的發(fā)生［2］。水體環(huán)境因子的變化對貝類的健康養(yǎng)殖具有重要意義［3］，作為條件致病菌，環(huán)境因子的變化會直接成為弧菌病害爆發(fā)的關(guān)鍵因素。相關(guān)研究表明，水體中的鹽度變化也可直接對貝類的生長發(fā)育、生理代謝、滲透調(diào)節(jié)和免疫防御等產(chǎn)生影響，進而對貝類的存活率造成影響［4］。菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum），在我國海水養(yǎng)殖貝類中占據(jù)重要地位，其健康狀態(tài)及免疫能力與環(huán)境因子之間存在密切關(guān)聯(lián)［5］。

本文探究了不同鹽度及弧菌脅迫雙因素互作下對蛤仔存活的影響，通過消化腺組織切片觀察低鹽弧菌下對該組織的影響，進而探討蛤仔消化腺組織的免疫基因，對其表達情況進行分析，旨在為蛤仔養(yǎng)殖中預(yù)防弧菌病害發(fā)生及其健康養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

在大連市金州市七頂山海購買到實驗用野生菲律賓蛤仔（下稱蛤仔），平均殼長3.87±0.2 cm，平均總重10.20±0.5 g。實驗開始前，將蛤仔暫養(yǎng)于水溫22 ℃，鹽度30的實驗室水槽中七天，連續(xù)充氣，每日更換沙濾海水，投喂小球藻一次。每日挑出死亡蛤仔，待蛤仔穩(wěn)定后，開始實驗。

實驗所用的副溶血弧菌（V.parahaemolyticus），來自大連海洋大學(xué)病害實驗室。菌種置于冰上解凍，用無菌接種環(huán)蘸取上層菌液，在TCBS固體平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，28 ℃控溫培養(yǎng)24 h，直至單個菌落清晰可見，重復(fù)劃線培養(yǎng)一次。在清晰觀察到單個菌落的重復(fù)培養(yǎng)后，挑取單一菌落然后在200 mL的2216E液體培養(yǎng)基進行28 ℃下孵育并在以180 r/min的轉(zhuǎn)速的搖床上連續(xù)培養(yǎng)24 h，于無菌海水中進行重懸，血細胞計數(shù)器計數(shù)重復(fù)3次并取平均值，每個瓶子中的細菌密度約為2.8×109 CFU/mL，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 感染實驗

采用正交實驗法，設(shè)計雙因素雙水平脅迫實驗，因素水平：鹽度（30‰、23‰、16‰）和副溶血弧菌濃度（106 CFU/mL、107 CFU/mL、108 CFU/mL），見表1。加熱棒控制實驗溫度為22 ℃，利用曝氣淡水進行不同鹽度梯度設(shè)置。采用浸泡法對蛤仔進行副溶血弧菌感染。將蛤仔分為9組，飼養(yǎng)在5 L水體的長方形水槽中，每組50只蛤仔，各組設(shè)置三個平行，根據(jù)實驗設(shè)計在各組中加入不同劑量的副溶血弧菌，使水體中的弧菌達到對應(yīng)的濃度。實驗開始后0 h、24 h、48 h、72 h和96 h統(tǒng)計各平行組死亡個數(shù)，累計死亡率用各平行組平均死亡率表示。采用SPSS 25.0單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05表示具有顯著差異，使用Excel處理數(shù)據(jù)并繪圖。

1.2.2 組織切片觀察

實驗組蛤仔在溫度22 ℃、鹽度23‰、水體弧菌濃度為108 CFU/mL條件下進行低鹽副溶血弧菌攻毒實驗，并取0 h對照組與24 h、48 h、72 h下實驗組的蛤仔的消化腺組織，制作成石蠟切片后進行HE染色，觀察感染后蛤仔消化腺組織器官的病理變化情況。

1.2.3 免疫基因表達分析

設(shè)置同1.2.2相同實驗條件的低鹽弧菌脅迫感染實驗，每組放入70個蛤仔，并設(shè)3個平行。分別在0 h對照組與24 h、48 h和72 h下實驗組隨機挑取3只蛤仔。使用Trizol法提取蛤仔消化腺總RNA。質(zhì)量檢測合格后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TianGen）合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄程序為37 ℃15 min，85 ℃5 s，反應(yīng)體系見表2。根據(jù)相關(guān)研究對蛤仔消化腺組織內(nèi)免疫相關(guān)基因表達情況進行分析，并在NCBI網(wǎng)站上設(shè)計特異性引物（表4），以β-actin作為內(nèi)部參考基因。利用羅氏熒光定量PCR儀（Roche）進行反應(yīng)，反應(yīng)體系見表3。熒光定量反應(yīng)程序為95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，40個循環(huán)，重復(fù)三次。qRT-PCR定量驗證結(jié)果使用2-△△Ct法計算基因相對表達量。使用SPSS 25.0處理數(shù)據(jù)并進行單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛤仔低鹽條件下副溶血弧菌脅迫后死亡率分析

通過表型性狀觀察發(fā)現(xiàn)，未受脅迫的蛤仔解剖后各組織完整、鰓組織結(jié)構(gòu)清晰可見，整體軟體部組織新鮮，并對外部刺激反應(yīng)敏感。而受脅迫感染的死亡個體的外套膜無光澤發(fā)生萎縮易剝離，鰓組織發(fā)生萎縮，鰓絲出現(xiàn)嚴重糜爛，水管、足和閉殼肌軟弱無力。在對不同處理組蛤仔96 h內(nèi)累計死亡率統(tǒng)計（圖1）中發(fā)現(xiàn)，16‰-106 CFU/mL、16‰-107 CFU/mL、16‰-108 CFU/mL處理組在48 h死亡率達到100%，與30‰-106 CFU/mL、23‰-108 CFU/mL、30‰-108 CFU/mL和23‰-106 CFU/mL處理組相比差異顯著（P＜0.05）。通過對不同條件下蛤仔死亡率進行方差分析的結(jié)果可以看出，鹽度對蛤仔死亡率的影響具有顯著意義（P＜0.05）。

2.2 蛤仔在副溶血弧菌脅迫后消化腺組織病理分析

如圖2所示，0 h為健康蛤仔消化腺組織，可見消化腺基本結(jié)構(gòu)清楚，排列整齊，消化腺為復(fù)管狀腺，腺管上皮細胞多呈柱狀，細胞核大，核仁明顯，間質(zhì)內(nèi)結(jié)締組織未見明顯的增生。然而，低鹽條件下，副溶血弧菌感染組中的蛤仔消化腺組織隨感染時間的增加可觀察到內(nèi)腺管結(jié)構(gòu)開始逐漸排列松散，大量的腺管出現(xiàn)上皮細胞脫落，管腔內(nèi)可見脫落的上皮細胞（紅色箭頭），間質(zhì)內(nèi)可見結(jié)締組織輕度增生，可見炎性細胞浸潤（紅色*表示）。

2.3 低鹽條件下副溶血弧菌處理后蛤仔免疫相關(guān)基因表達分析

通過qRT-PCR對低鹽條件下副溶血弧菌處理后的蛤仔消化腺內(nèi)免疫相關(guān)基因表達模式進行分析（圖3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低鹽條件下，副溶血弧菌侵染后蛤仔消化腺內(nèi)Rho GTP基因表達與0 h相比在48 h時表現(xiàn)出顯著上調(diào)，甚至表達量達到峰值（P＜0.05），在72 h時出現(xiàn)下降（圖3 A）；CD-MPR基因在副溶血弧菌脅迫下表達呈現(xiàn)低-高-低的變化趨勢，在24 h表達量顯著升高并達到最大值（P＜0.05）（圖3 B）；此外，與0 h相比Big Defensin基因表達量在12 h升高后在24 h時出現(xiàn)下降，48 h再次出現(xiàn)升高并達到最大值，隨后達到72 h再次出現(xiàn)下降，但整個過程中除24 h外其他時間點與0 h均表現(xiàn)出顯著差異（P＜0.05）（圖3 C）；圖3 D所示，CfC1qDC基因表達量總體呈上升趨勢，并與0 h均表現(xiàn)出顯著差異（P＜0.05），表達水平在48 h達到最大值，但在72 h出現(xiàn)明顯下降。圖3 E所示，與0 h相比在12 h時RpLysBp基因表現(xiàn)出下調(diào)趨勢，在48 h時表達量最高（P＜0.05）。PGLYRPs基因表達量與0 h相比在脅迫24 h后表達量開始升高，并在72 h達到最高（P＜0.05）（圖3 F）。

3 討論

采用正交實驗設(shè)計不同鹽度和不同濃度副溶血弧菌脅迫證實鹽度對蛤仔的死亡率產(chǎn)生顯著影響，發(fā)現(xiàn)在鹽度16‰的條件下脅迫48 h時蛤仔死亡率達到100%。表明鹽度的改變與致病性弧菌會對貝類養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生嚴重的危害［6］。通過組織學(xué)切片觀察23‰-108 CFU/mL條件下蛤仔的消化腺組織病變程度隨時間增加而不斷加深。其實此前Joshy等［7］研究表明，根據(jù)對貝類的消化腺和鰓組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化及損傷程度的評分，進而可以對水體環(huán)境質(zhì)量進行評估。在研究發(fā)現(xiàn)隨著感染時間的推移，蛤仔消化腺在感染72 h后可明顯觀察到消化腺組織的結(jié)構(gòu)排列極為松散，同時伴有大量的腺管上皮細胞脫落，以及出現(xiàn)多處炎性細胞浸潤等病理現(xiàn)象。

蛤仔在低鹽條件下受副溶血弧菌感染時，機體大部分能量會被用于體內(nèi)滲透壓的調(diào)節(jié)，使免疫力下降更容易被弧菌所感染。本試驗中通過對消化腺中的免疫相關(guān)基因的驗證，表明6種與免疫相關(guān)的基因在蛤仔免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮了一定的作用。Rho族蛋白是重要的分子開關(guān)，Yin等［8］人在進行鰻弧菌（Vibrio anguillarum）脅迫蛤仔實驗中發(fā)現(xiàn)，作為免疫因子的Rho GTP基因出現(xiàn)顯著表達，這與本實驗中蛤仔受到副溶血弧菌脅迫下的顯著表達結(jié)果一致。陽離子依賴性甘露糖6-磷酸受體（CD-MPR）在貝類先天免疫過程中，可以介導(dǎo)吞噬作用，抵御病原菌的感染，將細菌引導(dǎo)到溶酶體進行降解［9］，本研究發(fā)現(xiàn)蛤仔在應(yīng)對副溶血弧菌侵染時，CD-MPR是蛤仔識別副溶血弧菌入侵細胞的受體。同樣，在本研究驗證了大防御素基因（Big Defensin）在蛤仔消化腺中的表達量隨著脅迫時間的延長逐漸達到峰值。Big Defensin可以響應(yīng)貝類免疫因子的儲存以及應(yīng)激反應(yīng)機制，使機體在受到病原菌的感染時，可以使免疫系統(tǒng)能及時發(fā)揮作用，抵制病原體的侵害［10］。Big Defensin在多數(shù)雙殼綱貝類中均被發(fā)現(xiàn)，其表達量均會隨著病原菌刺激時間的推進而逐漸增加［11-13］。肽聚糖識別蛋白（PGRPs）作為一種模式識別受體，在機體先天免疫系統(tǒng)中占據(jù)重要地位［14］。Su等［15］通過對櫛孔扇貝（Chlamys farreri）的CfPGRP-S1基因的研究發(fā)現(xiàn)，在鰻弧菌（V.anguillarum）刺激24 h時其表達水平顯著增加，與本研究PGRPs基因的表達水平在低鹽條件下副溶血弧菌刺激后的24 h到48 h顯著升高的結(jié)果相似。本研究中C1q相關(guān)的CfC1qDC基因表達上調(diào)，總體趨勢與隋立軍等對文蛤（Meretrix meretrix）受鰻弧菌侵染研究中發(fā)現(xiàn)C1q的表達水平顯著上調(diào)的實驗結(jié)果類似［16］。差異之處是由于隨著副溶血弧菌在體內(nèi)侵害時間的延長，其體內(nèi)營養(yǎng)代謝，有機質(zhì)的利用受阻，免疫活性開始受到抑制，導(dǎo)致其表達水平降低。溶菌酶（Lysozyme，LSZ）廣泛存在于軟體動物的許多組織器官中，溶酶體酶是軟體動物中研究最多的，在本研究中，與LSZ相關(guān)的RpLysBp基因在48 h時的表達量達到峰值，與王銳等［17］的研究表明PGN處理組在3 h時蛤仔RpLysBp基因表達量達到最高存在差異，這可能是由于脅迫方式的不同所導(dǎo)致。

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