桑夢科 劉君昂 周國英

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.10.019

摘要：油茶炭疽病是由多種真菌引起的主要危害油茶葉片和果實的病害，其發(fā)生嚴重時會影響油茶的產(chǎn)量。為從土壤中尋找對油茶炭疽病具有生防潛力的拮抗菌，通過稀釋涂布平板法分離出可人工培養(yǎng)的微生物與指示菌平板對峙試驗，經(jīng)過初篩和復篩確定目標菌株。對目標菌株進行形態(tài)特征觀察、生理生化鑒定及功能驗證。利用蓋玻片斜插法于顯微鏡下觀察目標菌株對指示菌菌絲的影響，并進行抑菌譜試驗。利用離體刺傷接種試驗，驗證目標菌株對油茶炭疽病發(fā)生的防治效果和治療效果。通過16S rDNA基因擴增技術、gyrA基因擴增技術，對目標菌株進行分子鑒定。結果表明：從土壤中分離出可培養(yǎng)不同菌落形態(tài)的菌株 34 株，結合初篩、復篩，將菌株YFB-10-3-2確定為目標菌株。菌株YFB-10-3-2具有產(chǎn)生解淀粉酶、解纖維素酶、蛋白酶的能力和固氮功能，能使指示菌菌絲膨大、彎曲。進一步試驗發(fā)現(xiàn)，目標菌株對10種病原菌的抑制率為46%～72%，表明該菌株具有抑菌廣譜性。室內試驗發(fā)現(xiàn)，該菌株對油茶炭疽病有68.11%的預防效果和28.60%的治療效果，結合形態(tài)特征和生理生化試驗，通過雙基因分子鑒定，將菌株YFB-10-3-2鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。綜上，菌株YFB-10-3-2具有開發(fā)成為油茶炭疽病生防菌劑的巨大潛力。

關鍵詞：油茶；拮抗細菌；分離；鑒定；離體防效；生物防治

中圖分類號：S763.744；S182? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）10-0145-08

收稿日期：2023-06-13

基金項目：中央財政林業(yè)科技推廣示范資金（編號：［2022］XT18）；湖南省林業(yè)科技攻關與創(chuàng)新項目（編號：XLKY202321）；湖南省油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展資金（編號：湘財資環(huán)指［2023］16號、66號）。

作者簡介：桑夢科（1996—），男，河南平輿人，碩士研究生，主要從事生物農(nóng)藥研究。E-mail：1604306243@qq.com。

通信作者：周國英，博士，教授，博士生導師，主要從事微生物資源開發(fā)與利用、林業(yè)微生物、植物檢疫方面的研究。E-mail：s2393694264@outlook.com。

油茶為山茶科（Theaceae） 山茶屬（Camellia）植物中油脂含量較高且具有栽培經(jīng)濟價值的一類植物的總稱，是我國特有的油料樹種，主要種植于秦嶺、淮河以南地區(qū)，至今已有2 300多年的種植歷史。油茶籽壓榨出的茶油對人體具有多種功效，素有“東方橄欖油”的美譽。2022年5月國家林業(yè)和草原局指出，到2025年全國油茶種植面積力爭超過600萬hm2。隨著種植面積的擴大，油茶病害的發(fā)生率提高。油茶炭疽病是影響油茶產(chǎn)量最主要的病害之一，每年由油茶炭疽病引起的油茶減產(chǎn)達10%～30%，重病區(qū)可減產(chǎn)50%以上，給種植戶帶來了巨大的經(jīng)濟損失［1］。油茶炭疽病發(fā)生時，多以在油茶發(fā)病期噴灑多菌靈進行治療；然而化學藥劑的施用不僅會引起病原菌產(chǎn)生抗藥性，同時帶來環(huán)境污染，也給油茶的農(nóng)副產(chǎn)品帶來農(nóng)藥殘留問題。生防菌的篩選及應用，不僅可以給油茶炭疽病的防治提供新的思路，還能避免農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染。

土壤中分布著大量細菌，每1 g土壤中細菌數(shù)量高達 109個。這些細菌中既有在人類生產(chǎn)生活中起負作用的，也有起促進作用的，土壤拮抗細菌是具有促進作用的細菌。油茶炭疽病拮抗細菌的研究已有相關報道，但從土壤中分離出油茶炭疽病拮抗細菌卻鮮有報道。目前僅有宋光桃從土壤中分離到223株細菌，最終篩選出 Z17、Z26這2株抑菌率超過 50%的菌株；經(jīng)過16S rDNA基因擴增技術將Z17鑒定為克氏擬桿菌（Paenibacillus kribbensis），將Z26鑒定為短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）；但卻未對2種菌株進行刺傷接種試驗及林間試驗［2］。本研究從土壤中尋找新的油茶炭疽病拮抗菌株，對其進行鑒定并進行刺傷接種試驗，對其生防效果進行驗證，旨在為油茶炭疽病的生物防治分離出新的菌種。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

1.1.1? 供試土壤? 采集于湖南天華油茶科技股份有限公司湖南攸縣油茶產(chǎn)業(yè)基地（27.203 697°N，113.377 083°E）。

1.1.2? 供試菌株? 果生刺盤孢菌（Colletotrichum fructicola）、彩絨革蓋菌 （Coriolus versicolor）、油茶軟腐病菌（Agaricodochium camelliae）、喀斯特炭疽菌（C. karstii）、隱秘刺盤孢菌（C. aenigma）、膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）、暹羅炭疽菌（C. siamense）、油茶葉枯病菌（Pestalotiopsis microspora）、哈銳炭疽菌（C. horii）、山茶炭疽菌 （C. camelliae），均保存于中南林業(yè)科技大學南方人工林病蟲害防控國家林業(yè)局重點實驗室森林微生物菌種保藏中心。其中，果生刺盤孢菌為引起湖南油茶炭疽病的主要病原菌。

1.1.3? 供試油茶? 油茶葉片采集于國家油茶工程技術研究中心。

1.1.4? 主要培養(yǎng)基? LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、酵母提取物5 g、瓊脂20 g （液體LB不加瓊脂）、pH值自然，用于拮抗細菌分離、純化及培養(yǎng)。PDA培養(yǎng)基：新鮮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂 20 g、 水1 000 mL、pH值自然，用于油茶致病菌的培養(yǎng)及拮抗試驗。

1.1.5? 主要儀器設備和試劑? 超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），恒溫培養(yǎng)箱，恒溫振蕩器（IS-EDD3），BioPhotometer核酸蛋白快速檢測儀，滅菌鍋，電泳儀，2×T5 Super PCR Mix（Basic）（湖南擎科生物技術有限公司），DL5000 DNA marker（湖南擎科生物技術有限公司）。

1.1.6? 試驗時間和地點? 于2022年9月采集土壤，帶回中南林業(yè)科技大學生科樓A座進行后續(xù)試驗。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 生防菌株的分離純化? 稱取10 g土壤置于裝有90 mL無菌水的250 mL滅菌錐形瓶中，充分振蕩后，以10倍濃度梯度進行稀釋，分別取10-1、10-3、10-5、10-7梯度稀釋后的溶液 100 μL 于LB固體培養(yǎng)基進行涂布平板。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內避光倒置培養(yǎng)2 d后，挑取形態(tài)不同的單個菌落進行分離純化，處理后的菌株保存在 4 ℃冰箱中待用。

1.2.2? 生防菌株的初篩? 以湖南油茶炭疽病的主要病原菌果生刺盤孢菌為指示菌進行生防細菌的篩選，對分離出的細菌進行3點對峙試驗。在 PDA平板（d=90 mm）中央接種直徑為6 mm的果生刺盤孢菌，以果生炭疽菌為中心，以等邊三角形分布的頂點（頂點離果生刺盤孢菌中心距離為25 mm）接種上述已分離出的細菌，進行拮抗試驗，每株細菌重復試驗3次，以只在PDA中心接種果生刺盤孢菌為空白對照組。培養(yǎng)4 d后進行抑菌率測定。抑菌率=（對照組菌落面積-處理組菌落面積）／對照組菌落面積×100%。

1.2.3? 生防菌株的復篩? 參照尚笑男等的方法［3］進行拮抗細菌的復篩。

1.2.4? 生防菌株形態(tài)特征觀察及生理生化鑒定? 將篩選出的拮抗細菌通過涂布平板法于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 48 h 后，進行單個菌落的形態(tài)觀察；觀察革蘭氏染色后的菌株。參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》《伯杰氏細菌鑒定手冊》，對篩選出的拮抗菌株進行生理生化鑒定。

1.2.5? 生防菌株生長曲線的測定? 利用接種環(huán)，將在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng) 48 h 后的拮抗菌取1環(huán)于 100 mL 液體LB培養(yǎng)基中，于37 ℃、220 r/min條件下進行培養(yǎng)。當D600 nm為 0.5時，按照1%的接種量接種到裝有液體LB的三角瓶中，于37 ℃、220 r/min條件下進行培養(yǎng)，進行3組技術重復試驗。分別取培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h的菌液，以液體LB培養(yǎng)基為對照，測定吸光度D600 nm。利用Excel繪制生防菌株的生長曲線。

1.2.6? 生防菌株對果生刺盤孢菌菌絲的影響? 于超凈工作臺內，采用兩點對峙法在PDA平板上接種拮抗細菌、果生刺盤孢菌，取已滅菌的蓋玻片，傾斜45°插入拮抗細菌、果生刺盤孢菌兩者中央，使蓋玻片平面與拮抗細菌、果生刺盤孢菌兩者連線平行，重復上述方法；以不接拮抗細菌為對照組，當菌絲著生于蓋玻片時，取下蓋玻片，于光學顯微鏡下分別觀察處理組與對照組的菌絲形態(tài)。

1.2.7? 生防菌株功能驗證? 參考孫科等的方法［4-11］分別對生防細菌的固氮、溶有機磷、溶無機磷、解鉀、產(chǎn)蛋白酶、產(chǎn)纖維素、產(chǎn)淀粉酶、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn) IAA的能力進行測定。

1.2.8? 生防菌株抑菌譜的測定? 參照“1.2.2”節(jié)中的方法對生防菌株進行抑菌譜的測定。

1.2.9? 生防菌株離體刺傷防效測定? 預防試驗：選取油茶秋梢上健康無病害的葉片，75%乙醇消毒 30 s，無菌水沖洗3次，待葉片干燥后用蠟油對葉柄位置進行密封，以保持葉片盡可能長時間離體培養(yǎng)。選取葉片表面對稱位置處，用無菌注射器針頭刺穿2處，其中一處接種生防細菌無菌發(fā)酵液 10 μL，同一葉片的另一處接種未接菌的液體LB培養(yǎng)基無菌發(fā)酵液10 μL。將處理過的葉片置于 9 mm 平板中（平板內側放有無菌水打濕的無菌脫脂棉），然后對平板進行封口，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱，24 h后每處各接種孢子濃度為1×108個/mL的果生刺盤孢菌孢子懸浮液10 μL。而后置于? 28 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱，5 d后計算離體防效，預防效果=（對照病斑直徑-處理病斑直徑）／對照病斑直徑×100%。綜合預防效果為各葉片預防效果的平均值。

治療試驗：試驗前油茶葉片處理參照預防試驗中方法。2個刺穿處先接種孢子濃度為1×108個/mL的果生刺盤孢菌孢子懸浮液10 μL，24 h后于2個接種處的1處接種10 μL生防細菌無菌發(fā)酵液，另1處接種未接菌無菌發(fā)酵液10 μL。5 d后計算離體防效，治療效果=（對照病斑直徑-處理病斑直徑）/對照病斑直徑×100%。綜合治療效果為各葉片治療效果的平均值。

1.2.10? 生防菌株的分子生物學鑒定? 將已分離純化的拮抗細菌接種于裝有液體LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于 37 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h后得到菌懸液。

16S rDNA 基因擴增：采用細菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1 492R （5′-TACGCDTACCTTGTTACDACTT-3′）進行基因擴增。PCR 反應體系：2×T5 Super PCR Mix（Basic）25.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 2.0 μL，DNA模板2.0 μL（用菌懸液代替），ddH2O 19.0 μL；PCR反應條件：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，57 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。

gyrA基因擴增：采用引物gyrA-F（5′-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3′）和gyrA-R（5′-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3′）進行基因擴增。PCR 反應體系：2×T5 Super PCR Mix（Basic）25.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 2.0 μL，DNA模板 2 μL （用菌懸液代替），ddH2O 19.0 μL；PCR 反應條件：98 ℃ 3 min；98? ℃ 10 s，63 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃，5 min；4 ℃保存。

后續(xù)將4 ℃保存樣品送至湖南擎科生物技術有限公司進行測序，將獲得的序列提交至GenBank中，利用BLAST對所提交序列的同源性進行比對分析，并利用 MEGA-11采用N-J法構建分子系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.11? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析? 利用Excel、MEGA-11軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2? 結果與分析

2.1? 生防菌株的分離、純化和篩選

從樣品中分離獲得不同菌落形態(tài)的菌株34株，其中3株對指示菌株果生刺盤孢菌具有明顯的抑制作用。最終選取對果生刺盤孢菌抑制效果最好（培養(yǎng)96 h后抑制率可達56.17%）的菌株YFB-10-3-2進行后續(xù)試驗。

2.2? 生防菌株菌落形態(tài)及生理生化鑒定

將生防菌株在固體LB平板上于28 ℃培養(yǎng) 2 d，觀察發(fā)現(xiàn)菌株YFB-10-3-2單菌落形態(tài)為近圓形，邊緣不整齊，顏色為白色不透明狀，中間光滑、干燥（圖1），通過革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)該菌株為革蘭氏陽性菌。對其進行部分生理生化試驗，結果如表1所示。

2.3? 生防菌株生長曲線的測定

對YFB-10-3-2發(fā)酵液進行24 h測定吸光度D600 nm，由圖2可知，在 0～4 h細菌生長處于遲緩期，這個階段細菌體內積累大量有利于分裂的物質，為對數(shù)期的到來做準備；4～8 h細菌生長處于對數(shù)期，由于前期物質的大量積累，這個階段的細菌生長迅速，呈現(xiàn)出幾何增長狀態(tài)；8～18 h細菌生長處于穩(wěn)定期，此時細菌不斷消耗培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質，同時有害物質不斷積累；18～20 h細菌處于衰亡期，由于穩(wěn)定期營養(yǎng)物質的大量消耗以及有害物質的積累，導致細菌死亡數(shù)量超過活菌數(shù)量，細菌出現(xiàn)菌體自溶現(xiàn)象；20～24 h由于自溶現(xiàn)象細菌裂解，體內物質釋放，此時培養(yǎng)基以細菌的代謝產(chǎn)物為主（圖2）。

2.4? 生防菌株對果生刺盤孢菌菌絲的影響

通過蓋玻片斜插法，對著生于蓋玻片上的菌絲進

行觀察。與對照組相比，處理組能夠使指示菌株果生刺盤孢菌菌絲發(fā)生膨大、彎曲，影響菌絲的正常生長，從而影響果生刺盤孢菌的生長發(fā)育及繁殖（圖3）。

2.5? 生防菌株功能驗證

對拮抗菌株進行功能驗證發(fā)現(xiàn)，剛果紅使拮抗菌株YFB-10-3-2周圍染色較淺（圖4-A），說明菌株YFB-10-3-2具有產(chǎn)纖維素酶的功能。碘液不能使含淀粉平板上的菌株YFB-10-3-2周圍變藍，說明菌株YFB-10-3-2具有產(chǎn)分解淀粉酶的功能（圖4-B）。經(jīng)過連續(xù) 3 代的接續(xù)培養(yǎng)，菌株仍能在阿須貝培養(yǎng)基上生長，說明菌株YFB-10-3-2具有固氮功能（圖4-C）。經(jīng)過培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，菌落周圍具有透明光圈，說明菌株YFB-10-3-2 具有產(chǎn)蛋白酶的功能（圖4-D）。經(jīng)過試驗發(fā)現(xiàn)，拮抗菌株YFB-10-3-2 不具有解無機磷、解有機磷、解鉀、產(chǎn)IAA、產(chǎn)鐵載體的功能。

2.6? 生防菌株抑菌譜的測定

生防菌YFB-10-3-2與病原真菌通過平板對峙培養(yǎng)4 d后發(fā)現(xiàn)，生防菌YFB-10-3-2對供試病原真菌具有較好的抑制效果，對病原真菌具有廣譜抑菌作用（圖5）。其中，生防菌YFB-10-3-2對隱秘刺盤孢菌抑制率最大，達到71.22%；對油茶葉枯病菌抑制率最小，只有46.50%；對其他病原真菌抑制率為50.00%～71.00%（表2）。

2.7? 生防菌株離體刺傷防效的測定

2.7.1? 預防試驗

通過試驗可知，生防菌YFB-10-3-2對不同品種油茶刺傷接種果生刺盤孢菌的預防效果不同，綜合預防效果為68.11%，具有較好的預防效果（圖6）。

2.7.2? 治療試驗

對油茶葉片先刺傷接種致病菌果生刺盤孢菌，再進行接種生防菌YFB-10-3-2進行治療。結果表明，生防菌YFB-10-3-2 對已被果生刺盤孢菌侵染的油茶葉片具有一定的治療作用，其綜合治療效果達28.60%（圖7）。

2.8? 生防菌株分子鑒定

將擴增的16S rDNA基因片段測序后，得到全長1 421 bp的序列，將該序列提交到GenBank中（登錄號OQ586059），利用MEGA-11軟件采用N-J法構建分子系統(tǒng)發(fā)育樹（圖8），生防菌YFB-10-3-2與貝萊斯芽孢桿菌（NR 116240.1、NR 075005.2）聚為一支，分支支持率為100.00%。對該菌株gyrA基因片段進行擴增， 得到全長940 bp的序列， 將該序列提交到GenBank中（登錄號OQ632933），與已知序列進行同源性比對，圖9結果顯示與該菌株的gyrA基因同源性較高的菌株均屬于芽孢桿菌屬，生防菌

YFB-10-3-2 與貝萊斯芽孢桿菌（OP867063.1、OP561960.1、OP56957.1）聚為一支，分支支持率為 100.00%。結合其形態(tài)和生理生化特征，將生防菌YFB-10-3-2 鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

3? 討論

貝萊斯芽孢桿菌最早于1999年被分離出，2005年被首次報道和命名［12］。隨著學者對生防菌種的篩選和鑒定，具有生防效果的貝萊斯芽孢桿菌被大量報道，貝萊斯芽孢桿菌大多從土壤中分離，也有學者從植物的根、莖、葉、鱗莖中分離出具有生防效果的貝萊斯芽孢桿菌［13-17］。相關研究表明，貝萊斯芽孢桿菌不僅具有生防效果，也具有良好的促生效果［18-20］。也有一些研究結果顯示，貝萊斯芽孢桿菌具有較好的殺線蟲效果［21］。近年來，化學藥劑的頻繁使用使得病原菌和害蟲產(chǎn)生了抗藥性，生態(tài)環(huán)境也受到巨大破壞；生防菌劑的使用不僅可以延緩病原菌和害蟲抗藥性的產(chǎn)生，對生態(tài)環(huán)境也較為友好。因此， 生防菌的研發(fā)與應用對農(nóng)林業(yè)健康發(fā)展和生態(tài)環(huán)境的良性恢復具有重要意義。

本試驗從土壤中分離獲得1株細菌YFB-10-3-2，通過16S rDNA基因和gyrA基因分子鑒定，結

合形態(tài)特征及生理生化特征，綜合鑒定細菌YFB-10-3-2為貝萊斯芽孢桿菌，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)細菌 YFB-10-3-2使病原菌絲發(fā)生膨大和彎曲，這與Li等的研究結果［22-23］相似。也有研究表明，貝萊斯芽孢桿菌能使致病菌菌絲體頂端腫脹或破裂［24］。Baptista等在電子顯微鏡下觀察出貝萊斯芽孢桿菌CMRP 4489的無菌上清液通過引起菌絲結構變形，進而扭曲和損傷病原菌絲，從而使真菌生長受到抑制［25］。Wang等通過病原菌絲體可被臺盼藍染成藍色發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌FKM10能使病原菌菌絲體細胞膜受損［26］。有學者深入研究貝萊斯芽孢桿菌對病原菌絲生長產(chǎn)生的影響時發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌E2產(chǎn)生的脂肽能使黃曲霉的菌絲異常腫脹、扭曲和塌陷［27］，這與Park等的研究結果［28］相同。Zhao等研究證明，貝萊斯芽孢桿菌 A4的無菌上清液處理后，能夠誘導灰霉菌菌絲細胞中的活性氧形成關鍵基因的表達，從而導致菌絲的氧化損傷［29］。以上研究表明，貝萊斯芽孢桿菌具有較好的抑制菌絲生長的效果，這也為細菌 YFB-10-3-2后續(xù)對菌絲生長影響機理的研究提供了理論依據(jù)。

通過平板對峙試驗發(fā)現(xiàn)，細菌YFB-10-3-2對10種病原菌具有較好的抑制效果，表明細菌YFB-10-3-2具有廣譜抑菌性。Feng等同樣證明了，貝萊斯芽孢桿菌對多種病原菌具有抑菌廣譜性［30-32］。油茶葉片的離體刺傷接種試驗表明，細菌YFB-10-3-2對油茶葉片感染果生炭疽菌的預防效果（68.11%）大于治療效果（28.60%）。Chen等在研究貝萊斯芽孢桿菌ZW-10對離體水稻稻瘟病的預防和治療效果中發(fā)現(xiàn)，ZW-10對稻瘟病的預防比治療效果更顯著［33］。Nifakos等的研究具有類似的結果［34-36］。而方園等則發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌SF327對水稻白葉枯病的治療效果明顯優(yōu)于預防效果［37］。離體刺傷接種試驗可為細菌 YFB-10-3-2 作為生防菌的開發(fā)與應用提供必要的試驗基礎。

4? 結論

試驗分離出1株對油茶炭疽病具有較好抑制作用的細菌YFB-10-3-2，結合生理生化及雙基因分子進行鑒定，最終將該細菌鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。蓋玻片斜插法試驗表明，細菌YFB-10-3-2 能影響油茶炭疽病主要致病菌果生刺盤孢菌的正常生長。平板對峙試驗表明，細菌YFB-10-3-2對多種致病菌的生長具有抑制作用。油茶葉片離體刺傷試驗表明，細菌YFB-10-3-2對油茶炭疽病發(fā)生的預防效果大于油茶炭疽病發(fā)生后治療效果。

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