佟曉楠 胡文娟 楊杰 陳凱 董小筠 鐘奕恬 張曉媛 李興濤

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.10.006

摘要：克隆枳PP2C基因家族的PtrPP2C51基因，分析其在低溫、高溫和干旱等脅迫下的表達規(guī)律，探究其在非生物脅迫中的功能。以1年生枳苗為試材，從嫩葉克隆到PtrPP2C51基因cDNA序列，采用生物信息學方法對其進行分析，利用實時熒光定量PCR儀（qRT-PCR）檢測枳苗在低溫、高溫和干旱（15%PEG-6000）處理下的PtrPP2C51基因表達模式。克隆獲得PtrPP2C51基因編碼區(qū)CDS序列長度為879 bp，編碼292個氨基酸，其蛋白分子量為31.36 ku，理論等電點4.9，脂肪系數(shù)79.52，不穩(wěn)定系數(shù)39.57，親水性平均值-0.279。PtrPP2C51蛋白的二級結構中α-螺旋、β-轉角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲占比分別為40.07%、7.88%、18.15%和33.90%。PtrPP2C51蛋白與克里曼丁橘的PP2C蛋白在同一小分支上，親緣關系最近。經(jīng)低溫（0 ℃）、高溫（38 ℃）和干旱（15%PEG-6000）3種不同脅迫處理，PtrPP2C51基因的相對表達量均表現(xiàn)持續(xù)上調(diào)趨勢，并且均在處理12 h時表達量達到最高值。PtrPP2C51基因可能參與枳的抗逆脅迫調(diào)控機制。

關鍵詞：枳；PP2C基因；基因克??；非生物脅迫

中圖分類號：S666.01? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）10-0049-06

收稿日期：2023-07-19

基金項目：國家自然科學基金（編號：32160731）；江西省教育廳科技項目（編號：GJJ2201233）。

作者簡介：佟曉楠（1983—），女，遼寧遼陽人，碩士，講師，主要從事柑橘低溫脅迫分子機制研究。E-mail：tongxn_gnnu@qq.com。

通信作者：李興濤，博士，副教授，研究方向為果樹逆境植物生理。E-mail：lixt.gnnu@qq.com。

柑橘（Citrus reticulata Blanco）是我國乃至全球多個國家的主要水果栽培作物之一，是世界第一大水果，但柑橘在生長發(fā)育過程中十分容易受到多種非生物脅迫的不利影響。柑橘砧木的選用是柑橘生產(chǎn)過程中的關鍵，這不僅影響柑橘的質量和產(chǎn)量，其抗逆性也會受到影響。目前，在我國柑橘產(chǎn)業(yè)中枳是使用最為廣泛的柑橘砧木［1］，枳對氣候具有較強的適應性，抗逆性也較強，這也為柑橘篩選抗性基因提供了良好的材料。

蛋白磷酸酶2C（PP2C）是磷蛋白金屬磷酸酶的一個分支，其活性受Mn2+和Mg2+調(diào)控，在大多數(shù)生物體中廣泛存在［2］。植物與動物相比，含有數(shù)量更為豐富的PP2C蛋白［3］。PP2C家族蛋白具有一致特征，即有11個特異的亞結構域。植物中PP2C兼具多種不同功能，這是由于植物PP2C蛋白的N端具有多功能延伸區(qū)，在C端還有保守的催化結構域。研究表明，植物中的PP2C家族蛋白能夠參與多種激素信號的傳導，也能對植物體內(nèi)的激素水平和代謝途徑產(chǎn)生影響［4］，從而在干旱、鹽堿和低溫等環(huán)境脅迫調(diào)控中發(fā)揮作用［5-8］。迄今為止，已經(jīng)在擬南芥、二穗短柄草、馬鈴薯、水稻和大豆等多種植物中開展了PP2C的相關研究［2，5-6，9-10］。Xue等對擬南芥進行鑒定得到80個PP2C基因家族成員，并將其分為13個亞族，其中對A、B、C亞族的研究較多，對其他亞族研究的相對較少［9］。A亞族的ABI1和ABI2等PP2C蛋白依靠結合脫落酸（ABA）受體蛋白進而負調(diào)控ABA表達［11］，Gosti等的研究表明ABI1和ABI2均參與ABA信號的負調(diào)控機制［12-13］，B亞族蛋白能夠傳導有絲分裂原激活蛋白激酶（MAPK）信號，C亞族蛋白能夠調(diào)控花發(fā)育［14］，以此說明了PP2C可以依靠信號通路的差異影響轉錄因子的表達，從而參與植物逆境響應和生長發(fā)育［13，15］。PP2C基因家族成員在非生物脅迫方面有重要的調(diào)控功能。低溫脅迫下，轉ZmPP2C2基因的煙草植株的抗氧化酶活性和發(fā)芽率比對照顯著升高，電解質滲透率和丙二醛含量顯著降低［16］；對葡萄PP2C家族基因表達譜分析表明，低溫脅迫下有7個葡萄PP2C基因表達顯著上調(diào)［17］；張婷婷等對鐵皮石斛全基因組鑒定得到了67個DcPP2C基因家族成員，選取10個基因進行分析，4 ℃ 低溫處理后，根系有3個基因表達量上調(diào)，葉片有9個基因表達量上調(diào)，對鐵皮石斛42 ℃高溫處理后，在根系和葉片中，選取的10個基因均出現(xiàn)表達量上調(diào)［18］；Cao等通過研究發(fā)現(xiàn)，對二穗短柄草進行4 ℃低溫和42 ℃高溫脅迫處理，全部BdPP2C基因均出現(xiàn)表達量上調(diào)［2］；對苗期的黃瓜進行干旱處理，根系、莖部和葉片的CsPP2C2都出現(xiàn)了上調(diào)［19］。楊杰等在枳全基因組中鑒定得到53個PtrPP2C基因，分為10個亞族，利用qRT-PCR分析所有PtrPP2C基因在非生物脅迫下的表達模式，在低溫、高溫和干旱脅迫下，分別有10、8、9個基因表達量顯著上調(diào)，其中較為明顯的是PtrPP2C51，研究還發(fā)現(xiàn)，其中的A和F 2個亞族在枳響應逆境脅迫中起突出作用［20］。因此，PP2C基因家族成員在非生物脅迫中起重要的調(diào)控功能。

目前，PP2C基因已在擬南芥、小麥、苜蓿、玉米、白樺和茶樹等多種植物中被克隆并進行了表達分析［15-16，21-23］，但涉及枳F亞族的PtrPP2C基因克隆及其非生物脅迫的表達研究尚未見報道。本研究以枳苗為試驗材料，從嫩葉片中克隆F亞族的PtrPP2C51基因的cDNA全長序列，再進行生物信息學分析，使用qRT-PCR檢測枳在低溫、高溫和干旱脅迫處理下0、3、6、12 h時間點PtrPP2C51基因的表達模式，為解析PtrPP2C51基因參與枳抗逆調(diào)控機制提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

以1年生枳組培盆栽苗作為供試材料，培養(yǎng)基質為蛭石、珍珠巖和草炭以1 ∶1 ∶3的體積比混合，苗缽規(guī)格為30 cm×28 cm，在對其進行處理前保證良好的生長狀況。。

1.2? 樣品脅迫處理

挑選出生長良好的枳苗對其進行相應的處理，低溫和高溫脅迫處理為將枳苗放置于光照度 1 500～2 000 lx和相對濕度75%的培養(yǎng)箱中，分別進行0 ℃低溫和38 ℃高溫處理；干旱脅迫處理為利用濃度為15%的PEG-6000溶液，將枳苗放置于裝滿Hoagland營養(yǎng)液的塑料容器（36 cm×33 cm×26 cm）中，并對其進行供氧，供氧使用的打氧機為ACO-318型（廣東海利集團有限公司）。每組處理均進行3次重復，并分別在0、3、6、12 h共4個時間點取枳苗嫩葉片，快速放置于-80 ℃的超低溫冰箱中保存以便取用。

1.3? 總RNA提取及反轉錄合成cDNA

利用Trizol法提取總RNA，用超微量分光光度計（上海元析儀器有限公司，B-500）檢測RNA濃度和純度。以cDNA第一鏈合成試劑盒（杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司）將合格的RNA模板反轉錄合成cDNA。

1.4? PtrPP2C51基因的克隆

利用Primer Premier 5.0設計全長序列擴增引物（表1）。以枳苗嫩葉片cDNA為模板，克隆PtrPP2C51基因的cDNA全長序列。PCR反應體系為25 μL，反應體系含2×E-Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物均為1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。擴增程序為95 ℃預變性3 min；95 ℃ 變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，設置35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR經(jīng)產(chǎn)物電泳檢測后用AxyPrep PCR清潔試劑盒進行膠回收，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.5? PtrPP2C51基因的實時熒光定量PCR檢測

根據(jù)擴增獲得的PtrPP2C51基因序列，使用Beacon Designer 7.0軟件設計qRT-PCR引物qPtrPP2C51-F和qPtrPP2C51-R（表1）。以枳苗嫩葉片cDNA為模板，使用Light Cycler 96 Real-Time PCR System儀器進行qRT-PCR檢測。反應體系10 μL：2×SYBR Green PCR Mix（杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司）5 μL，ddH2O和模板cDNA各2 μL，15 μmol/L正反向引物各0.5 μL，每個樣本3個重復。擴增程序為94 ℃預變性3 min；94 ℃變性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)。以柑橘ACTB基因為內(nèi)參基因［24］。

1.6? 生物信息學分析

使用ProtParam tool（https//web.expasy.org/protparam/）分析PtrPP2C51蛋白理化性質；使用WoLF PSORT（https：//psort.hgc.jp/）預測PtrPP2C51蛋白亞細胞定位；通過ProtScale分析PtrPP2C51蛋白的疏水性；利用SOPMA和SWISS-MODEL在線軟件分別對PtrPP2C51蛋白二級、三級結構進行分析；通過Jalview對PtrPP2C51基因序列進行比對；從NCBI數(shù)據(jù)庫下載與PtrPP2C51蛋白不同物種的同源氨基酸序列，使用MEGA 7.0中的鄰接法（neighbor-joining method）生成系統(tǒng)發(fā)育進化樹，Bootstrap位置為1 000，其他條件為默認。

1.7? 統(tǒng)計分析

PtrPP2C51基因的相對表達量計算利用2-ΔΔCT法［25］，基因表達量間的顯著性分析使用SPSS 21.0軟件，使用Excel 2016作圖。

2? 結果與分析

2.1? PtrPP2C51基因的克隆

利用qPtrPP2C51基因上下游引物，以枳苗嫩葉片RNA反轉錄得到的cDNA為模板進行PCR擴增，擴增得到的結果如圖1所示，大小約1 000 bp，與預期結果1 006 bp相符。測序結果表明，編碼序列（CDS）全長為879 bp，編碼292個氨基酸，對其命名為PtrPP2C51。

2.2? PtrPP2C51基因的序列比對

將測序獲得的PtrPP2C51基因序列在NCBI上進行Blastx比對，獲得與之編碼蛋白序列相同的一條克里曼丁橘蛋白序列（GenBank登錄號為XP_006450232.1，對應基因序列登錄號為XM_006450169.2），通過Jaiview軟件比對其CDS序列，發(fā)現(xiàn)兩序列共有6處不同，分別處于第72、189、222、480、747、804位，其中只有第480位為顛換，由鳥嘌呤置換成胸腺嘧啶，其余5處都是轉換，分別為第72位由鳥嘌呤置換成腺嘌呤，第222位由腺嘌呤置換成鳥嘌呤，其余3個均是由胞嘧啶置換成胸腺嘧啶（圖2），由此可見，發(fā)生轉換的頻率比發(fā)生顛換的頻率高。枳和克里曼丁橘蛋白序列完全相同（圖3），表明該序列在核酸水平發(fā)生的突變都是無義突變。枳是蕓香科（Rutaceae）枳屬（Poncirus），克里曼丁橘是蕓香科柑橘屬（Citrus），不同屬的2個核酸序列雖然有差異，但是蛋白序列完全相同，說明在蕓香科內(nèi)，該基因在蛋白水平具有較為嚴格的保守性。

2.3? PtrPP2C51蛋白的理化性質分析

利用ExPASy ProtParam對PtrPP2C51蛋白的理化性質進行分析，結果顯示，PtrPP2C51蛋白的分子式為C1 366H2 133N391O444S7，由292個氨基酸殘基組

成，包含20種氨基酸，其中絲氨酸（Ser）、丙氨酸（Ala）和甘氨酸（Gly）含量較高，且絲氨酸含量最高，占10.6%，丙氨酸和甘氨酸含量相同，均占10.3%；PtrPP2C51蛋白分子量為31.36 ku，理論等電點為4.9，不穩(wěn)定系數(shù)為39.57，表明其為穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為79.52，為強脂溶性蛋白。亞細胞定位預測該蛋白可能位于細胞質。

PtrPP2C51蛋白的疏水性通過ProtScale進行分析，結果（圖4）顯示，分值最高出現(xiàn)于第276位的纈氨酸，為2.333，疏水性最強，分值最低出現(xiàn)于第119位的天冬酰胺，為-3.356，疏水性最弱。其整體疏水性小于0，親水性平均值（GRAVY）為-0.279，由此判斷PtrPP2C51蛋白為親水性蛋白。

2.4? PtrPP2C51蛋白的二級、三級結構分析

對PtrPP2C51蛋白進行二級結構分析使用的是SOPMA軟件，結果（圖5）顯示，PtrPP2C51蛋白含有4種二級結構類型，分別為α-螺旋、β-轉角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲，其中α-螺旋由117個氨基酸殘基構成，占氨基酸序列的40.07%，是占比最多的一個類型；延伸鏈由53個氨基酸殘基構成，占氨基酸序列的18.15%；β-轉角由23個氨基酸殘基構成，占氨基酸序列的7.88%，且占比最少；無規(guī)則卷曲由99個氨基酸殘基構成，占氨基酸序列的33.90%。利用SWISS-MODEL對PtrPP2C51蛋白的三級結構進行分析， 結果（圖6）與二級結構的分

析結果相符。

2.5? 系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫進行搜索，從中下載了甜橙（Citrus sinensis）、月季花（Rosa chinensis）、桃（Prunus persica）、麻風樹（Jatropha curcas）、蘋果（Malus pumila）、石榴（Punica granatum）、胡楊（Populus euphratica）、大麻（Cannabis sativa）、胡桃（Juglans regia）、葡萄（Vitis vinifera）、雷公藤（Tripterygium wilfordii）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、茶（Camellia sinensis）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）等不同植物物種的PP2C蛋白氨基酸序列，與PtrPP2C51蛋白共同構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結果（圖7）表明，PtrPP2C51蛋白與克里曼丁橘的PP2C蛋白在同一小分支上，同源性最高，親緣關系最近，與葡萄的親緣關系也比較近；而與擬南芥的同源性最差，親緣關系最遠。

2.6? PtrPP2C51基因在非生物脅迫下的表達模式分析

對枳苗分別進行0 ℃低溫、38 ℃高溫以及干旱（15%PEG-6000）處理，再使用qRT-PCR檢測枳在3種不同處理方式下PtrPP2C51基因的表達模式，結果（圖8）顯示，經(jīng)低溫、高溫以及干旱處理后的0～12 h內(nèi)，PtrPP2C51基因均出現(xiàn)了表達量持續(xù)升高的情況（P<0.05），其中在低溫處理后12 h表達量上調(diào)尤為顯著，并且3種不同處理下的PtrPP2C51基因表達量均在處理后12 h達到最高值。

3? 討論與結論

PP2C是植物體內(nèi)十分重要的一類蛋白磷酸酶，能夠調(diào)控植物的逆境信號傳導，主要依靠催化底物蛋白的去磷酸化和磷酸化反應進行。柑橘生長發(fā)育過程會受到生物和非生物脅迫，以至于品質變差、產(chǎn)量下降，而枳是柑橘生產(chǎn)中常用的砧木，探究PP2C基因家族成員在枳逆境中發(fā)揮的功能及作用從而提高柑橘生產(chǎn)的質量就很有必要。目前，已經(jīng)從枳中鑒定出了可分為10個亞族（A、B、C、D、E、F、H、I、J、L）的53個PtrPP2C基因家族成員，并將其命名為PtrPP2C1～PtrPP2C53［20］。本研究從枳中克隆得到的PtrPP2C51基因歸類于F亞族，PtrPP2C51基因CDS長度為879 bp，蛋白質編碼長度為292個氨基酸，蛋白分子量為31.36 ku。系統(tǒng)進化結果表明，PtrPP2C51蛋白與克里曼丁橘和葡萄的親緣關系較近，與擬南芥NP_001185062.1的親緣關系最遠，相似性為43.25%，說明PP2C在進化中相對保守。

本研究對枳苗分別進行低溫、高溫以及干旱（15%PEG-6000）脅迫處理，結果表明PtrPP2C51基因表達量會隨著處理時間逐步升高。Dong等的研究表明，PP2C基因能夠參與低溫脅迫的調(diào)控是通過MAPK或ABA信號通路［15］，在谷子的PP2C基因受到低溫脅迫后，除了SiPP2CA2，其他的基因表達量都呈現(xiàn)上升趨勢［26］，本研究中的PtrPP2C51基因低溫脅迫下表現(xiàn)與之一致。張金旭等分析干旱處理的甘蔗轉錄組，發(fā)現(xiàn)有37個SsPP2Cs基因表達受到干旱強烈誘導（FPKM>2），相對表達量分析結果表明，SsPP2C38和SsPP2C81 2個基因的表達量隨著干旱處理時間逐步升高，處理12 h達到最高值［27］。對葡萄赤霞珠進行干旱（PEG）處理，發(fā)現(xiàn)大部分基因表達量下降，但也有5個PP2C基因的表達量在干旱處理6 h后均表現(xiàn)出逐步上升的趨勢［17］，表明只有部分PP2C基因響應干旱脅迫，在本研究中PtrPP2C51基因對干旱脅迫也存在響應。同樣，經(jīng)高溫處理后，PtrPP2C51基因也表現(xiàn)出表達量上升的情況，但上升趨勢不如低溫和干旱處理。綜上所述，PtrPP2C51基因能積極響應多種非生物逆脅迫，可能參與調(diào)控低溫、高溫和干旱脅迫。

以上分析及結果對今后深入研究枳的抗逆脅迫機制，為提高枳抗逆境脅迫能力提供參考，同時也為柑橘篩選良好的抗性基因提供了材料。

參考文獻：

［1］朱世平，王福生，陳? 嬌，等. 柑橘不同類型砧木的種子和苗期性狀［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學，2020，53（3）：585-599.

［2］Cao J M，Jiang M，Li P，et al. Genome-wide identification and evolutionary analyses of the PP2C gene family with their expression profiling in response to multiple stresses in Brachypodium distachyon［J］. BMC Genomics，2016，17（1）：175.

［3］Singh A，Pandey A，Srivastava A K，et al. Plant protein phosphatases 2C：from genomic diversity to functional multiplicity and importance in stress management［J］. Critical Reviews in Biotechnology，2016，36（6）：1023-1035.

［4］Nishimura N，Okamoto M，Narusaka M，et al. ABA hypersensitive germination2-1 causes the activation of both abscisic acid and salicylic acid responses in Arabidopsis［J］. Plant and Cell Physiology，2009，50（12）：2112-2122.

［5］Wang Y F，Liao Y Q，Wang Y P，et al. Genome-wide identification and expression analysis of StPP2C gene family in response to multiple stresses in potato （Solanum tuberosum L.）［J］. Journal of Integrative Agriculture，2020，19（6）：1609-1624.

［6］Chen C，Yu Y，Ding X D，et al. Genome-wide analysis and expression profiling of PP2C clade D under saline and alkali stresses in wild soybean and Arabidopsis［J］. Protoplasma，2018，255（2）：643-654.

［7］Bhaskara G B，Nguyen T T，Verslues P E. Unique drought resistance functions of the highly ABA-induced clade A protein phosphatase 2Cs［J］. Plant Physiology，2012，160（1）：379-395.

［8］Akimoto-Tomiyama C，Tanabe S，Kajiwara H，et al. Loss of chloroplast-localized protein phosphatase 2Cs in Arabidopsis thaliana leads to enhancement of plant immunity and resistance to Xanthomonas campestris pv.campestris infection［J］. Molecular Plant Pathology，2018，19（5）：1184-1195.

［9］Xue T T，Wang D，Zhang S Z，et al. Genome-wide and expression analysis of protein phosphatase 2C in rice and Arabidopsis［J］. BMC Genomics，2008，9：550.

［10］曾? 堅，謝雅倩，陳麗萍，等. 木薯2C型蛋白磷酸酶基因MePP2C55的克隆及表達分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2022，50（8）：73-78.

［11］Singh A，Jha S K，Bagri J，et al. ABA inducible rice protein phosphatase 2C confers ABA insensitivity and abiotic stress tolerance in Arabidopsis［J］. PLoS One，2015，10（4）：e0125168.

［12］Gosti F，Beaudoin N，Serizet C，et al. ABI1 protein phosphatase 2C is a negative regulator of abscisic acid signaling［J］. The Plant Cell，1999，11（10）：1897-1909.

［13］Merlot S，Gosti F，Guerrier D，et al. The ABI1 and ABI2 protein phosphatases 2C act in a negative feedback regulatory loop of the abscisic acid signalling pathway［J］. The Plant Journal，2001，25（3）：295-303.

［14］張繼紅，陶能國. 植物PP2C蛋白磷酸酶ABA信號轉導及逆境脅迫調(diào)控機制研究進展［J］. 廣西植物，2015，35（6）：935-941.

［15］Dong W，Liu X J，Lü J，et al. The expression of alfalfa MsPP2CA1 gene confers ABA sensitivity and abiotic stress tolerance on Arabidopsis thaliana［J］. Plant Physiology and Biochemistry，2019，143：176-182.

［15］Hu X L，Liu L X，Xiao B L，et al. Enhanced tolerance to low temperature in tobacco by overexpression of a new maize protein phosphatase 2C，ZmPP2C2［J］. Journal of Plant Physiology，2010，167（15）：1307-1315.

［17］何紅紅，路志浩，馬宗桓，等. 葡萄PP2C家族基因的鑒定與表達分析［J］. 園藝學報，2018，45（7）：1237-1250.

［18］張婷婷，李雨欣，張德遙，等. 鐵皮石斛蛋白磷酸酶PP2C家族基因鑒定及其表達分析［J］. 園藝學報，2021，48（12）：2458-2470.

［19］Wang Y P，Wu Y，Duan C R，et al. The expression profiling of the CsPYL，CsPP2C and CsSnRK2 gene families during fruit development and drought stress in cucumber［J］. Journal of Plant Physiology，2012，169（18）：1874-1882.

［20］楊? 杰，陳? 蓉，胡文娟，等. 枳PP2C基因家族的鑒定及表達分析［J］. 果樹學報，2022，39（4）：532-547.

［21］Hu W，Yan Y，Hou X W，et al. TaPP2C1，a group F2 protein phosphatase 2C gene，confers resistance to salt stress in transgenic tobacco［J］. PLoS One，2014，10（6）：e0129589.

［22］Sugimoto H，Kondo S，Tanaka T，et al. Overexpression of a novel Arabidopsis PP2C isoform，AtPP2CF1， enhances plant biomass production by increasing inflorescence stem growth［J］. Journal of Experimental Botany，2014，65（18）：5385-5400.

［23］Xing B Y，Gu C R，Zhang T X，et al. Functional study of BpPP2C1 revealed its role in salt stress in Betula platyphylla［J］. Frontiers in Plant Science，2021，11：617635.

［24］嚴佳文. 柑橘內(nèi)參基因篩選及轉pthA基因甜橙的表達分析［D］. 長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學，2010：41-56.

［25］Livak K J，Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method［J］. Methods，2001，25（4）：402-408.

［26］閔東紅，薛飛洋，馬亞男，等. 谷子PP2C基因家族的特性［J］.? 作物學報，2013，39（12）：2135-2144.

［27］張金旭，周少麗，姜? 爍，等. 甘蔗割手密PP2C基因家族的全基因組鑒定與表達分析［J］. 植物生理學報，2023，59（6）：1101-1116.