丁澤紅+付莉莉+黃猛+顏彥+鐵韋韋+張家明+胡偉

摘要：對從木薯Ku50葉片中克隆的1個P5CS基因MeP5CS1進行聚乙二醇（PEG）、脫落酸（ABA）、鹽脅迫下的表達分析，結果表明，基因MeP5CS1具有1個2 220 bp的開放閱讀框，編碼739個氨基酸，且含有P5CS保守結構域；MeP5CS1與楊樹、杞柳的P5CS基因親緣關系相對較近，序列相似性分別達到88.61%、88.95%；MeP5CS1基因在第1張完全展開葉、老葉中的表達量受到PEG處理誘導，且與葉片中脯氨酸的含量變化趨勢一致；MeP5CS1基因的表達還受到脫落酸（ABA）、鹽脅迫處理的誘導。在此基礎上，成功構建MeP5CS1基因的植物表達載體pCAMBIA 2300-MeP5CS1，為進一步解析MeP5CS1在木薯抗旱中的作用機制提供參考。

關鍵詞：木薯；MeP5CS1；非生物脅迫；克??；基因表達；載體構建

中圖分類號： S533.01 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）18-0040-03

收稿日期：2016-05-09

基金項目：海南省自然科學基金（編號：20163120、20153048）。

作者簡介：丁澤紅（1982—），男，湖南岳陽人，博士，助理研究員，主要從事植物分子生物學研究。E-mail：dingzehong@itbb.org.cn。

通信作者：胡 偉，博士，副研究員，主要從事植物分子生物學研究。Tel：（0898）66989380；E-mail：huwei2010916@126.com。 干旱是世界農(nóng)業(yè)面臨的最嚴重問題之一。隨著全球發(fā)生周期性降水分布不均、水資源受到污染等現(xiàn)象，植物面臨干旱脅迫的程度日益加劇，不但導致農(nóng)作物產(chǎn)量嚴重減少，而且還使得旱地面積持續(xù)擴大，制約著農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]。在漫長的環(huán)境適應和馴化過程中，植物形成了多種生理生化策略以應對干旱脅迫，如當植物遭受長時間和較為嚴重的干旱時，植物冠層的光合作用將顯著減少；為盡快適應缺水的情況，植物通過老葉的脫落來減少水分消耗，或增加根長來吸收更深層的地下水[2]，脯氨酸等各種小分子化合物將被合成并迅速積累以保持細胞中的含水量[3]等等。

脯氨酸是植物面對水分、高鹽等逆境脅迫最為重要的滲透調節(jié)物質，提高植物中脯氨酸的積累對提升植物抗?jié)B透脅迫能力具有重要的意義。Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是植物脯氨酸生物合成途徑中的關鍵酶，決定著植物體內(nèi)脯氨酸的積累速度[4]。目前，對很多植物中的P5CS基因研究較為深入[5-7]，并發(fā)現(xiàn)P5CS轉基因植株的抗逆性表型增強[8-9]。木薯是重要的糧食作物和經(jīng)濟作物，雖具有一定的抗旱特性，但同大多數(shù)作物一樣，干旱脅迫仍嚴重地影響木薯的生長和發(fā)育，導致木薯塊根產(chǎn)量減少[2]，而與模式植物相比，木薯的重要經(jīng)濟性狀基礎理論研究還相對薄弱，與抗旱相關的分子機制尚不明確。本研究在克隆木薯P5CS基因MeP5CS1的基礎上，分析MeP5CS1基因在聚乙二醇（PEG）、脫落酸（ABA）和鹽脅迫條件下的表達量變化，并構建相關的植物表達載體，為進一步解析木薯的抗旱機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料的準備

試驗材料為木薯栽培品種Ku50，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所提供，在木薯種植季節(jié)，將Ku50種莖切成長度約15 cm的莖段，挑選含3～4個芽眼/莖段、粗細均勻一致的莖段，扦插于高為18.8 cm，上、下直徑分別為18.5、14.8 cm的塑料盆中，1莖段/盆。基質采用營養(yǎng)土與蛭石以 1 ∶ 1 的體積比進行混合。木薯種植約10 d進行間苗，保留1苗/盆。

1.2 試驗處理

木薯盆栽種植60 d，選取長勢一致的植株用20% PEG6000溶液模擬干旱脅迫，以澆灌自來水為對照，分別在處理0、3、6、12、24 h時，按照Bates等的方法[10]測定葉片脯氨酸含量，同時，分別在處理0、3、24 h時采集未展開葉、第1張完全展開葉、老葉、根。此外，對種植60 d的木薯幼苗用100 μmol/L ABA噴施，在處理0、2、6、10、24、48、72 h時采集未展開葉、第1張完全展開葉、老葉；另用200 mmol/L NaCl進行灌根，在處理0、2、6 h及3、14、18、24 d同樣采集葉片。根、葉樣品液氮冷凍、-80 ℃保存，待測。

1.3 RNA提取與cDNA合成

按照天根生化科技有限公司生產(chǎn)的RNA提取試劑盒說明書提取木薯的總RNA；利用Fermentas公司生產(chǎn)的第一鏈cDNA合成試劑盒（revert aid first strand cDNA synthesis kit）將總RNA反轉錄成cDNA，-20 ℃儲存，備用。

1.4 引物設計與實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）

用Primer 6.0設計引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成。MeP5CS1基因全長擴增正向、反向引物分別為L1：5′-GGGGTACCCTGCTCATGGCTGCAAACTG-3′、R1：5′ -GCGTCGACATGAAGCAACGGTGGGAGAT-3′（下劃線為酶切位點），分別帶有KpnⅠ和SalⅠ酶切位點及保護堿基，可用于植物表達載體的構建。qRT-PCR引物包括MeP5CS1基因特異性引物L2：5′-GCTTATGCTGGTGTCC CTGT-3′、R2：5′-CACGCGCACCAAAGTGTTTA-3′及actin基因引物L3：5′-GATGAGTCTGGTCCATCCA-3′、R3：5′-CTCCTACGACCCAATCTCA-3′[11]。qRT-PCR采用TaKaRa公司生產(chǎn)的R GreenⅠ試劑盒，按照說明在Stratagene公司生產(chǎn)的3005P熒光定量PCR儀上進行操作，反應程序為95 ℃預變性30 s；95 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)。每個樣品重復3次，表達量按照ΔΔCT法進行計算[12]。endprint

1.5 生物信息學分析

采用Clustal X軟件對序列進行比對；采用CDD數(shù)據(jù)庫 （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）預測保守結構域；采用ORF Finder、GenScan軟件預測開放閱讀框；采用ExPASy ProtParam軟件分析蛋白質的分子量和等電點；采用Mega 5.2軟件構建進化樹。

1.6 植物表達載體的構建

用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、SalⅠ分別對含有目的基因MeP5CS1的重組質粒和植物表達載體pCAMBIA2300進行雙酶切。酶切體系20.0 μL：d2H2O 7.0 μL，質粒10.0 μL，10 × FastDigest Buffer 2.0 μL，KpnⅠ和SalⅠ各0.5 μL，37 ℃反應4 h。反應產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，分別回收MeP5CS1目的片段和pCAMBIA 2300載體片段；用T4連接酶將目的基因片段和植物表達載體片段進行連接，16 ℃過夜反應；將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α，通過藍白斑篩選陽性克??；進行PCR及雙酶切驗證，測序，構建植物表達載體pCAMBIA 2300-MeP5CS1。

2 結果與分析

2.1 基因MeP5CS1的克隆

以木薯Ku50葉片cDNA為模板，用基因特異性引物進行PCR擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得1條2 600 bp左右的單一條帶?；厥誔CR產(chǎn)物連接pMD19-T simple載體，測序得到1條2 627 bp的序列，包括343 bp的5′非翻譯區(qū)（5′UTR）、2 220 bp的開放閱讀框、64 bp的非翻譯區(qū)3′ 非翻譯區(qū)（3′ UTR），該序列編碼739個氨基酸。Blast結果表明，MeP5CS1與木薯數(shù)據(jù)庫中公布的P5CS基因（Manes.10G024800.1）只有4個堿基的差異，同源性高達99%。與基因組信息比對發(fā)現(xiàn)，MeP5CS1基因含有20個外顯子。預測的蛋白質分子量為 80 139.4 ku，理論等電點（pI）為6.18。蛋白質結構域預測顯示（圖1），MeP5CS1編碼的蛋白含有P5CS保守結構域PLN02418，這進一步表明克隆到的基因為P5CS基因。

2.2 基因MeP5CS1進化樹分析

經(jīng)序列比對，獲得與MeP5CS1同源性較高的其他物種序列，由圖2可見，P5CS基因大致可聚為3類；第Ⅰ類以C4物種為代表，包括谷子、狗尾草、柳枝稷、玉米和高粱；第Ⅱ類包括擬南芥、薺菜花和白菜型油菜；木薯MeP5CS1被聚類到第Ⅲ類，與楊樹、杞柳的親緣關系相對較近，序列相似性分別達到88.61%、88.95%。

2.3 脯氨酸含量與MeP5CS1表達分析

2.3.1 PEG脅迫對木薯葉片脯氨酸含量的影響 用20% PEG6000溶液模擬干旱脅迫，測定PEG處理對木薯葉片中脯氨酸含量的影響。由圖3可見，對照處理（澆灌自來水）的木薯葉片脯氨酸含量相對比較穩(wěn)定，維持在22 μg/g左右；隨處理時間的延長，PEG處理的木薯葉片脯氨酸含量迅速累積，呈線性增長趨勢，24 h達到最大值。

2.3.2 PEG脅迫處理對基因MeP5CS1表達量的影響 由圖4可見，處理0 h時，MeP5CS1在未展開葉、根中的表達量相對比較接近，明顯高于在第1張完全展開葉、老葉中的表達量；與0 h相比，處理3 h時各組織中的MeP5CS1表達量基本沒有變化， 處理24 h時， MeP5CS1在第1張完全展開葉中的表達量增加約2倍， 老葉中增加約5倍， 未展開葉、根中的變

化仍然不大，這說明MeP5CS1主要在第1張完全展開葉和老葉中發(fā)揮功能。

2.3.3 ABA、 NaCl處理對基因MeP5CS1表達量的影響 由

圖5、圖6可見，ABA處理2～6 h，葉片中MeP5CS1的表達量有明顯上升；與對照（處理0 h）相比，ABA處理10 h的MeP5CS1表達量沒有明顯變化，但在處理24～72 h時，葉片中MeP5CS1的表達量維持在明顯誘導水平；NaCl處理3、24 d時，葉片中MeP5CS1表達量被明顯誘導，其他處理時間點與對照相比沒有太大變化。因此，ABA、NaCl處理能夠明顯誘導MeP5CS1的表達。

2.4 木薯MeP5CS1表達載體的構建

用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、SalⅠ分別對含有目的基因MeP5CS1的重組質粒和植物表達載體pCAMBIA 2300進行雙酶切，連接后轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，提取質粒經(jīng)PCR檢測，電泳獲得1條約2 600 bp的條帶；同時，提取質粒進行雙酶切反應，分別獲得約9 500 bp的載體和約2 600 bp的條帶（圖7），2種驗證方法都獲得與目的基因片段大小一致的條帶。經(jīng)進一步測序驗證，明確為MeP5CS1基因，這表明已成功構建pCAMBIA 2300-MeP5CS1植物表達載體。

3 結論與討論

P5CS是植物細胞脯氨酸生物合成途徑的關鍵酶，目前，

已經(jīng)從許多植物中分離得到，并從分子角度證明該基因是一個重要的植物抗逆相關基因[6-9]，而木薯中有關P5CS基因的研究相對很少。本研究從木薯Ku50中克隆了MeP5CS1基因，該基因具有1個2 220 bp的開放閱讀框，編碼739個氨基酸，與其他物種中的P5CS大小基本一致[7-9]，序列分析表明，MeP5CS1與楊樹、杞柳中P5CS基因的親緣關系相對較近。

脯氨酸是植物細胞中重要的滲透調節(jié)物質，在干旱、高鹽等逆境脅迫條件下，脯氨酸含量會迅速積累以減輕脅迫傷害[8]。P5CS作為脯氨酸合成途徑的限速酶，其表達量也相應地被快速誘導，且具有不同的組織表達特異性[13]。木薯作為一種典型的抗旱作物，有關其P5CS基因對非生物逆境脅迫的響應尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，PEG6000脅迫處理能誘導木薯葉片中脯氨酸含量快速積累，PEG脅迫處理24 h，MeP5CS1在第1張完全展開葉和老葉中的表達量增加2～5倍，與脯氨酸含量的變化相對一致，暗示MeP5CS1主要負責脅迫木薯第1張完全展開葉、老葉中脯氨酸的積累；正常條件下，MeP5CS1傾向于在幼嫩的組織和根中的表達，與周精華等研究結論[14]相對一致。此外，MeP5CS1表達還受到ABA、鹽脅迫處理的誘導。endprint

構建表達載體是基因功能驗證的主要手段之一。張霞等將2個水稻P5CS基因在煙草中進行過表達，轉基因植株脯氨酸含量有顯著增加[9]；Ehsanpour等研究也表明，干旱條件下P5CS轉基因在煙草葉片、根中的脯氨酸含量有顯著增加[15]。本研究成功構建了木薯MeP5CS1基因表達載體pCAMBIA 2300-MeP5CS1，為進一步研究該基因在木薯干旱等非生物脅迫中的功能奠定了基礎。

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