張貞宇 羅正飛 楊帥 顧江南 尹協(xié) 韋銀龍 聶瓊

摘要：糖苷水解酶CH3基因家族在植物的糖代謝和生長發(fā)育中起著重要作用，而煙草CH3基因家族目前尚未見相關(guān)鑒定和分析研究報(bào)道。本研究采用生物信息學(xué)方法在煙草基因組中鑒定CH3家族基因，并對其在不同組織中及逆境條件下的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，在普通煙草K326的基因組中共鑒定出35個(gè)CH3基因，其中23個(gè)被定位在14條染色體上，存在6對共線性基因；CH3家族蛋白均為熱穩(wěn)定性蛋白，其基因上游啟動(dòng)子區(qū)均包含多個(gè)激素和脅迫響應(yīng)元件。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，CH3家族基因大多數(shù)在煙苗莖尖高表達(dá)，少部分在根和莖中高表達(dá)，表達(dá)量受光照時(shí)間影響；煙苗受到干旱脅迫后CH3家族成員都有不同程度的響應(yīng)。挑選4個(gè)NtCH3基因進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果表明，NtCH3-5、NtCH3-19、NtCH3-22、NtCH3-26可能參與響應(yīng)低溫以及ABA處理。這可為深入了解煙草CH3基因家族及其功能提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：煙草；CH3基因家族；糖苷水解酶；生物信息學(xué)分析；表達(dá)模式

中圖分類號：S572：Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2024）04-0009-11

煙草（Nicotiana tabacum L.）是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，作為嗜好類用品，香氣是評判其質(zhì)量和商業(yè)價(jià)值的重要指標(biāo)。研究表明，煙草中的致香成分主要以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種形式存在，結(jié)合態(tài)呈香物質(zhì)沒有香氣，必須經(jīng)過分解釋放出游離態(tài)呈香物質(zhì)才能產(chǎn)生香氣。結(jié)合態(tài)潛香物質(zhì)大部分是以糖苷形式存在，如己醇、苯甲醇、苯乙醇和4-羥基-a-紫羅蘭醇等。糖苷態(tài)潛香物質(zhì)在常溫常壓下雖為非揮發(fā)性或半揮發(fā)性，但在陳化、加工或燃燒過程中卻能被糖苷水解酶水解釋放揮發(fā)性香氣物質(zhì)，從而影響煙草產(chǎn)品的風(fēng)味和香氣。

糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GH）又名糖苷酶，是指能夠水解兩個(gè)或兩個(gè)以上碳水化合物及碳水化合物和非碳水化合物之間糖苷鍵的一類酶。國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUBMB）基于底物特異性對糖苷水解酶進(jìn)行命名，如a-葡萄糖苷酶、B-葡萄糖苷酶、B-木糖苷酶、a-甘露糖苷酶等。碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫（Carbohydrate-Active-enZYmes Database，http：//www.CAZy.org）基于糖苷水解酶的氨基酸序列相似性及三維結(jié)構(gòu)性質(zhì)，將其分為135個(gè)家族。其中，糖苷水解酶3家族（GH3）是一類廣泛存在于真核生物和原核生物中的酶，具有B-葡萄糖苷酶和B-木糖苷酶等多種催化活性，能夠催化多種糖苷類化合物的水解反應(yīng)，參與生物體內(nèi)的多種代謝過程，如糖類代謝、細(xì)胞壁合成、激素合成、植物生長發(fā)育及香氣形成等。在擬南芥中，B-葡萄糖苷酶會(huì)通過影響ABA含量來改變植株耐旱性；水稻中的Os4BGlu31被證明通過平衡苯丙烯類化合物、類黃酮和植物激素糖綴合物在脅迫適應(yīng)中發(fā)揮作用；將B-葡萄糖苷酶在煙草中過量表達(dá)，提高了煙株生物產(chǎn)量，縮短了生育周期。添加B-葡萄糖苷酶有助于茶、果汁、葡萄酒中存在的糖苷類香氣前體水解，進(jìn)而增加產(chǎn)品的香氣，改善產(chǎn)品的品質(zhì)；B-木糖苷酶可促進(jìn)葡萄酒釀造過程中糖基化的萜烯類物質(zhì)水解，增加香氣。

目前尚未見煙草GH3基因及其相關(guān)功能的報(bào)道。因此，本研究利用生物信息學(xué)方法在普通煙草K326的基因組中鑒定GH3基因家族成員，系統(tǒng)分析其進(jìn)化關(guān)系、理化性質(zhì)及基因結(jié)構(gòu)，并利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和qRT-PCR技術(shù)分析其時(shí)空表達(dá)模式和脅迫響應(yīng)模式，為探究該基因家族在煙草糖代謝和香氣形成方面的功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與處理

煙草K326種子由貴州大學(xué)煙草品質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。2023年4月10日播種，采用烤煙漂浮育苗方式于28℃光照培養(yǎng)箱（16 h光照/8 h黑暗）中育苗培養(yǎng)45天至五葉一心。

1.2煙草GH3基因鑒定及其編碼蛋白理化性質(zhì)分析

普通煙草基因組序列以及注釋文件通過茄科基因組數(shù)據(jù)庫（https：//solgenomics.net/）獲得，由PFAM（http：//pfam-legacy.xfam.org/）下載GH3隱馬爾科夫模型（profile hidden markov models，profile HMMs）序列譜（PF00933）。利用HMMER 3.0軟件在K326蛋白組文件中檢索，將得到的GH3候選成員利用SMART（http：//smart.embl-heidel-berg.de/）進(jìn)行進(jìn)一步篩選，最終獲得煙草GH3家族成員。利用在線網(wǎng)站ExPasy（https：／／web.expasy.org/protparam/）對煙草GH3家族成員進(jìn)行理化性質(zhì)分析，包括氨基酸數(shù)目、分子量、蛋白質(zhì)疏水性值等指標(biāo)。

1.3煙草GH3家族成員系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過NCBI下載辣椒（Calxucum annum）和擬南芥（Arabidopsis thatiana）蛋白完整數(shù)據(jù)，同樣使用HMMER 3.0鑒定和篩選GH3家族蛋白序列，隨后利用MEGA 11對3個(gè)物種GH3蛋白進(jìn)行多序列對比和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。采用鄰接法，1 000次重復(fù)，利用ITOL（https：//itol.embl.de/）進(jìn)行進(jìn)化樹美化。

1.4煙草GH3蛋白保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)分析

將煙草GH3蛋白上傳至MEME（https：//meme-stute.org／meme/tools/meme）網(wǎng)站，保守基序設(shè)定為10個(gè)，其他采用默認(rèn)設(shè)定。利用軟件TBtools進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域作圖并使用GFF注釋文件繪制基因結(jié)構(gòu)圖。

1.5煙草GH3基因定位、共線性分析及Ka/Ks計(jì)算

煙草CH3基因染色體定位利用TBtools軟件中的Gene Location Visualize功能進(jìn)行作圖，并顯示各個(gè)染色體基因密度。利用TBtools軟件對煙草GH3基因進(jìn)行復(fù)制分析以及與擬南芥、辣椒的共線性分析。擬南芥基因組數(shù)據(jù)從NCBI上獲得，辣椒基因組數(shù)據(jù)在Ensemble上獲得。利用KaKs_Calculator v2.0軟件計(jì)算復(fù)制基因的Ks和Ka。

1.6煙草GH3基因順式作用元件分析

從煙草基因組中獲取每個(gè)CH3基因CDS序列上游2 000 bp序列，使用Plant-CARE數(shù)據(jù)庫（http：//bioinformatics.peb.ugent.be/webtools/plant-care/html/）獲得GH3基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件，并通過TBtools進(jìn)行可視化。

1.7煙草CH3基因轉(zhuǎn)錄組測序分析

在GEO（https：//www.ncbi.nlm.ruh.gov/geo/）網(wǎng)站下載GSE95717和GSE214048的表達(dá)量數(shù)據(jù)。GSE95717測序背景：煙草在長日照（18h光照/6 h黑暗）條件下生長至8周，收集光照0、6、12、18 h的根、莖、莖尖樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。GSE214048測序背景：使用200 mmol/L甘露醇模擬干旱處理五葉一心煙草幼苗，收集處理0、1、2、4、8h的煙葉樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。采用TBtools軟件歸一化處理后進(jìn)行可視化作圖，分析煙草GH3基因家族成員的差異表達(dá)特征。

1.8煙草CH3基因表達(dá)分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證煙草CH3家族成員是否對低溫和ABA激素進(jìn)行響應(yīng)，挑選4個(gè)NtGH3基因（NtGH3-5、NtGH3-19、NtGH3-22和NtGH3-26）進(jìn)行qRT-PCR分析。選擇茁壯且長勢相似的五葉一心幼苗進(jìn)行處理。ABA處理使用100 umol/LABA溶液：冷脅迫則是將幼苗放置在清水培養(yǎng)盤中，然后放入4℃光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每個(gè)處理20株，3次重復(fù)，分別在處理0、2、12、24 h取植株葉片，及時(shí)存放于-80℃超低溫冰箱中保存，用于RNA提取。用Plant RNA Kit純植物試劑盒（GenStar，R6827）提取總RNA，使用StarScriptⅡRT Mix with gDNA Remover試劑盒（GenStar，A224）獲得cDNA。使用Primer-Blast（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi）進(jìn)行特異引物設(shè)計(jì)，引物信息見表1。用L25作為內(nèi)參基因，每個(gè)反應(yīng)3次重復(fù)，采用2-△△ct法計(jì)算基因表達(dá)量。

2結(jié)果與分析

2.1煙草GH3家族成員鑒定及編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

通過HMMER 3.0軟件在煙草基因組數(shù)據(jù)庫中檢索得到CH3家族成員，去除重復(fù)和冗余序列，經(jīng)在線數(shù)據(jù)庫SMART復(fù)篩，共鑒定得到35個(gè)煙草GH3家族成員，將其依次命名為NtGH3-I-NtCH3-35（表2）。其中23個(gè)成員分別被定位在14條染色體上。

蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果（表2）表明，煙草GH3家族成員的蛋白序列長度在339-2259個(gè)氨基酸之間，分子量為37.2-248.9 kDa，其中Nt-GH3-18的氨基酸數(shù)量最少，分子量最?。篘tGH3-12的氨基酸數(shù)量最多，分子量最大。煙草GH3成員中有20個(gè)屬于堿性蛋白，15個(gè)屬于酸性蛋白，其中NtGH3-18的等電點(diǎn)最高（9.14），NtGH3-13的等電點(diǎn)最低（4.94）。煙草GH3蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為26.79-43.32，僅NtGH3-11的不穩(wěn)定系數(shù)大于40，較為不穩(wěn)定，其余均為穩(wěn)定蛋白。煙草GH3蛋白的脂肪族氨基酸指數(shù)為82.05-95.84，表明該類蛋白的熱穩(wěn)定性較好。同時(shí)煙草GH3蛋白親水系數(shù)為-0.214-0.056，其中NtGH3-15、NtGH3-18、NtGH3-22、NtGH3-25、Nt-GH3-26為疏水性蛋白，其余30個(gè)蛋白均為親水性蛋白。

2.2煙草GH3家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用HMMER 3.0軟件分別在擬南芥和辣椒中鑒定出30、51個(gè)GH3基因，使用MEGA 11軟件采用最大似然（ML）法構(gòu)建其與煙草GH3蛋白的鄰接（NJ）系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果（圖1）顯示，116個(gè)GH3蛋白可分為4類，其中，I類包括4個(gè)煙草成員、13個(gè)擬南芥成員和5個(gè)辣椒成員：Ⅱ類成員最多，包括15個(gè)煙草成員、8個(gè)擬南芥成員和22個(gè)辣椒成員：Ⅲ類成員最少，包括6個(gè)煙草成員、2個(gè)擬南芥成員和13個(gè)辣椒成員：Ⅳ類包括10個(gè)煙草成員、7個(gè)擬南芥成員11個(gè)辣椒成員。同時(shí)又可將I和II類分為編碼B-葡萄糖苷酶類，Ⅲ、Ⅳ類分為編碼B一木糖苷酶類。每一類都包含了3個(gè)物種的GH3家族成員，說明GH3家族成員的分化早于3個(gè)物種的分化。辣椒家族成員數(shù)量較多，說明GH3家族成員在該物種形成后可能經(jīng)歷了多次復(fù)制事件。

2.3煙草GH3基因家族成員序列分析及啟動(dòng)子分析

序列相似的基因一般具有相似的生物學(xué)功能，為此本研究采用在線網(wǎng)站MEME對煙草GH3家族成員的保守基序進(jìn)行了分析，結(jié)果（圖2A）表明NtGH3家族成員均包含4-10個(gè)基序，除Nt-GH3-2/和NtGH3-32外均含有Motifl和Motif2，表明這兩個(gè)基序是GH3家族成員的保守序列。CD Search分析（圖2B）顯示，NtGH3成員含有糖苷水解酶家族3的保守結(jié)構(gòu)域（Glyco_hydro_3_C），其中16個(gè)NtGH3蛋白還含有與木聚糖降解相關(guān)的PLN03080保守結(jié)構(gòu)域，19個(gè)NtGH3蛋白含有參與葡萄糖降解的PRK15098保守結(jié)構(gòu)域，可據(jù)此將其分為B-葡萄糖苷酶和B-木糖苷酶兩類，前者的保守基序中多出現(xiàn)Motif5和Motif6，推測這兩種保守基序可能決定了糖苷水解酶的功能。NtGH3基因結(jié)構(gòu)分析（圖2C）表明，除NtCH3-12外顯子為18個(gè)以外，其余成員均含有4-12個(gè)外顯子。

利用Plant-CARE在線軟件對NtGH3基因家族成員上游2 000 bp序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)上游序列中有多個(gè)與激素響應(yīng)、光響應(yīng)和脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件（圖3）。其中，與光反應(yīng)相關(guān)的元件有ACE、G-box、MRE、Spl和GTl-motif；與激素反應(yīng)相關(guān)的元件有：CGTCA-motif、TGACG-mo-tif（MejA）、ABRE（ABA）和P-box（GA3）等；還有與非生物脅迫相關(guān)的TC-rich repeats、LTR和MBS等元件。與茉莉酸甲酯（MejA）相關(guān)的CGT-CA-motif基序和TGACG-motif以及與脫落酸（ABA）相關(guān)的ABRE存在于大多數(shù)家族成員中，這意味著大多數(shù)NtGH3成員可能參與這兩類激素信號傳導(dǎo)。

2.4煙草GH3基因定位與共線性分析

染色體定位結(jié)果（圖4）表明，有23個(gè)NtGH3基因分布在14條染色體上，其中12、19、22、23號染色體上各有3個(gè)成員，17號染色體上有兩個(gè)成員，1、2、3、4、7、8、13、14、16號染色體上各有1個(gè)成員，12個(gè)NtGH3基因未能定位到染色體上。

共線性分析結(jié)果表明：23個(gè)NtGH3成員中共有6對共線性基因（圖5A），主要為大片段復(fù)制，沒有串聯(lián)復(fù)制的基因?qū)Γ和ㄟ^計(jì)算，6個(gè)復(fù)制基因?qū)Φ腒a/Ks都遠(yuǎn)小于1（表3），主要為同義替換。煙草分別與擬南芥、辣椒GH3成員的共線性分析發(fā)現(xiàn)：9個(gè)CaGH3基因與13個(gè)NtGH3基因共組成13個(gè)基因?qū)Γ?個(gè)AtGH3基因與3個(gè)NtGH3基因共組成3個(gè)基因?qū)Γ▓D5B），說明基因復(fù)制可能是煙草基因組GH3基因擴(kuò)增和進(jìn)化的動(dòng)力。

2.5煙草GH3家族基因表達(dá)分析

生長8周的煙草幼苗光照0、6、12、18 h的根、莖、莖尖的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，NtGH3基因在不同部位和不同光照時(shí)間差異表達(dá)（圖6A）。NtGH3-2、NtGH3-16、NtGH3-31主要在根中高表達(dá)，光照后表達(dá)量降低：NtGH3-6、NtGH3-10和NtGH3-11主要在莖中表達(dá)，表達(dá)高峰分別出現(xiàn)在光照12、12、0h：其余NtGH3基因在莖尖中高表達(dá)，表達(dá)量隨光照時(shí)間延長呈先上升后下降的趨勢。

使用200 mmol/L甘露醇模擬干旱處理后，煙草幼苗的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共檢測到23個(gè)NtGH3成員（圖6B）。干旱脅迫后，NtGH3-2、NtGH3-3、Nt-GH3-5、NtGH3-11、NtGH3-16的表達(dá)量下調(diào)，Nt-GH3-1、NtGH3-4、NtGH3-6、NtGH3-7、NtGH3-10、NtGH3-12、NtGH3-13、NtGH3-18、NtGH3-19的表達(dá)量呈現(xiàn)增加趨勢，NtGH3-14、NtGH3-17、NtGH3-20、NtGH3-22的表達(dá)趨勢為先增加后下降，NtGH3-15、NtGH3-8的表達(dá)量表現(xiàn)為先降低后升高又降低的趨勢，NtGH3-9、NtGH3-21、Nt-GH3-23表達(dá)量不受干旱脅迫的影響。

2.6低溫和ABA對部分NtGH3基因表達(dá)的影響

對NtGH3家族基因的啟動(dòng)子元件分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)基因上游含有低溫和ABA響應(yīng)元件。因此，本試驗(yàn)對煙草幼苗進(jìn)行24 h低溫（4℃）和ABA處理后，分析NtGH3-5、NtGH3-19、NtGH3-22、NtGH3-26四個(gè)基因的表達(dá)變化。結(jié)果（圖7）顯示，低溫脅迫下，4個(gè)基因表現(xiàn)出了不同的變化，較長時(shí)間的低溫處理（24h）使NtGH3-5的表達(dá)顯著下調(diào)，而使NtGH3-22、NtGH3-26的表達(dá)顯著上調(diào)：NtGH3-19的表達(dá)量則隨處理時(shí)間延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。ABA處理后，NtGH3-5和NtGH3-19的表達(dá)量表現(xiàn)出先下降后升高的趨勢，而NtGH3-22表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，在12h時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值。NtGH3-26對ABA非常敏感，ABA處理后其表達(dá)明顯受到抑制，僅為處理前的30%。表明這4個(gè)基因可能參與了低溫和ABA的響應(yīng)。

3討論與結(jié)論

本研究在普通煙草K326的全基因組范圍內(nèi)鑒定到35個(gè)NtGH3基因，根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域類型可將其分為B-木糖苷酶和B-葡萄糖苷酶兩類。NtGH3成員均為熱穩(wěn)定性蛋白，這與在棘孢木霉中的預(yù)測結(jié)果相似。在擬南芥和辣椒基因組中也分別鑒定到30個(gè)和51個(gè)GH3家族成員。系統(tǒng)發(fā)育樹和共線性分析表明，NtGH3成員中有6對共線性基因，復(fù)制方式主要為大片段復(fù)制。Ka/Ks表示的是異義替換（Ka）和同義替換（Ks）之間的比例，共線性基因?qū)χ蠯a/Ks都小于0.5，表明NtGH3基因家族進(jìn)化過程受到了純化作用。GH3家族的分化可能早于3個(gè)物種的形成，但后期辣椒GH3家族成員的分化與煙草的親緣關(guān)系更近。辣椒GH3成員個(gè)數(shù)明顯多于煙草，從染色體數(shù)目來推測辣椒CH3家族的復(fù)制事件多于煙草。

啟動(dòng)子的作用對于基因表達(dá)至關(guān)重要，決定了特定蛋白質(zhì)在特定細(xì)胞或組織中何時(shí)產(chǎn)生，因此，對啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，可以揭示基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制。NtGH3家族成員上游含有較多的激素響應(yīng)位點(diǎn)、逆境脅迫應(yīng)答元件和光反應(yīng)元件識別位點(diǎn)，推測NtGH3可通過激素調(diào)控對外界環(huán)境變化做出響應(yīng)。前人研究發(fā)現(xiàn)，植物產(chǎn)生脫落酸和茉莉酸甲酯可作為激活防御機(jī)制的信號，而且脫落酸和茉莉酸甲酯與植物香氣的形成密切相關(guān)。NtGH3家族的大多數(shù)成員都含有脫落酸和茉莉酸甲酯響應(yīng)元件，表明NtGH3可能通過產(chǎn)生茉莉酸甲酯和ABA來響應(yīng)外界環(huán)境變化和促進(jìn)香氣物質(zhì)的形成。

長日照下不同部位的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，大部分基因在煙草幼苗各部位均有表達(dá)，但部分成員表達(dá)量極低：各部位基因表達(dá)量存在差異，大部分成員在莖尖中高表達(dá)，少部分在莖與根中高表達(dá)。表明NtCH3成員的表達(dá)受到日照時(shí)間的調(diào)控。而NtGH3-21和NtGH3-23可能為煙草GH3基因家族擴(kuò)張中出現(xiàn)的不進(jìn)行表達(dá)的“假基因”。

滲透調(diào)節(jié)是植物應(yīng)對逆境脅迫的重要途徑。研究表明糖苷水解酶可提高耐輻射球菌的滲透耐受性。本研究發(fā)現(xiàn)煙草GH3基因家族成員包含許多逆境脅迫應(yīng)答元件，因此探究了NtGH3家族基因在非生物脅迫下的表達(dá)模式，結(jié)果表明，大多數(shù)基因?qū)Ω珊荡嬖趹?yīng)答，呈現(xiàn)隨著脅迫時(shí)間延長而上調(diào)、下調(diào)及先上調(diào)后下調(diào)表達(dá)3種情況：在低溫和ABA處理下，NtGH3家族4個(gè)基因均有不同程度的響應(yīng)，變化趨勢存在差異，其中NtGH3-22在低溫下隨處理時(shí)間延長表達(dá)量逐漸升高，NtGH3-26對外源ABA敏感，短時(shí)間內(nèi)表達(dá)量就顯著降低。

綜上，本研究從煙草基因組中鑒定出GH3基因家族的35個(gè)成員，并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，確定了煙草GH3家族成員分屬于B-葡萄糖苷酶和B-木糖苷酶，在干旱、低溫等逆境脅迫響應(yīng)方面發(fā)揮作用。因此，NtGH3基因家族可以作為研究煙草糖代謝和逆境脅迫響應(yīng)機(jī)制的候選基因。本研究結(jié)果可為煙草的遺傳改良及優(yōu)良品種選育提供理論基礎(chǔ)。

作者貢獻(xiàn)：張貞宇是實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)和執(zhí)行人：羅正飛、揚(yáng)帥及顧江南完成數(shù)據(jù)分析和論文初稿的寫作：尹協(xié)參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：聶瓊是項(xiàng)目的構(gòu)思者及負(fù)責(zé)人，指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析和論文寫作與修改。全體作者都已閱讀并同意最終的文本。