摘 要：為探討何首烏飲介導(dǎo)基因表觀遺傳（DNA甲基化）的改變對(duì)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞（Leydig）分泌睪酮的影響，選用12、18月齡 Wistar雄性大鼠睪丸組織，甲基化芯片篩選出受何首烏飲調(diào)控并與精子發(fā)生功能密切的基因AXL、Ttc29、wnt2b、MAPK10、C-myb，甲基化特異性PCR（MSP）與實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)檢測(cè)基因甲基化水平及mRNA表達(dá)水平；BrdU熒光染色觀察細(xì)胞增殖情況；慢病毒轉(zhuǎn)染敲低Leydig細(xì)胞DNMT1，分析wnt2b、C-myb甲基化程度和睪酮分泌水平是否受DNMT1影響.結(jié)果顯示：何首烏飲可調(diào)控衰老大鼠睪丸組織中關(guān)鍵基因DNA甲基化和mRNA水平，促進(jìn)細(xì)胞增殖和睪酮分泌；敲低Leydig細(xì)胞DNMT1后，細(xì)胞分泌睪酮水平降低，同時(shí)wnt2b和C-myb DNA甲基化水平也明顯下降.這表明何首烏飲可能介導(dǎo)基因DNA甲基化程度促進(jìn)大鼠Leydig細(xì)胞分泌睪酮，進(jìn)而提高生精功能.

關(guān)鍵詞：何首烏飲；睪丸組織；DNA甲基化；睪酮

中圖分類(lèi)號(hào)：

Q291"" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

A"" 文章編號(hào)：

1000-1565（2024）03-0301-11

Heshouwuyin mediates DNMT1 to regulate DNA methylation to promote rat Leydig cell function

SHI Bingye1，2， LIU Xinru2， WU Tian2， YANG Yujiao2， ZHEN Xiaolan3， NIU Siyun2

（1. Department of Ultrasound Diagnosis， Afiliated Hospital of Hebei University，Baoding 071000， China;2. School of Basic Medical Sciences， Hebei University， Baoding 071000， China;

3. In Vitro Diagnostic Reagent Room， Hebei Pharmaceutical and Medical Device Inspection and Research Institute， Shijiazhuang 050000， China）

Abstract：" To investigate the effect of Heshouwuyin-mediated gene epigenetic （DNA methylation） changes on testosterone secretion in rat Leydig cells， the testicular tissues of 12-month-old and 18-month-old Wistar male rats were selected. The genes AXL，" Ttc29， wnt2b， MAPK10 and C-myb regulated by Heshouwuyin and closely related to spermatogenesis were screened by methylation chip. MSP and RT-qPCR were used to detect gene methylation level and mRNA expression level. BrdU fluorescence staining

was used to observe cell proliferation. DNMT1 was knocked down by lentivirus transfection in Leydig cells， and the effects of DNMT1 on wnt2b and C-myb methylation and testosterone secretion were analyzed. The results showed that Heshouwuyin could regulate the DNA methylation and mRNA levels of key genes in testicular tissue of aging rats， and promote cell proliferation and testosterone secretion. After knocking down DNMT1 in Leydig cells， the level of testosterone secretion was decreased， and the levels of wnt2b and C-myb DNA methylation were also significantly decreased， indicating that Heshouwuyin may improve the ability of rat testicular cells to secrete testosterone by regulating the level of gene DNA methylation， thereby improving the spermatogenic function.

Key words： Heshouwuyin; testicular tissue; DNA methylation; testosterone

增齡過(guò)程中男性性腺軸激素分泌水平下調(diào)，使精子質(zhì)量顯著下降［1］.睪酮是重要的男性性激素，由睪丸間質(zhì)細(xì)胞（Leydig）分泌，體內(nèi)睪酮水平的下降與多種老年疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān).目前，晚婚晚育成為普遍的社會(huì)現(xiàn)象，晚育直接或間接地影響男性生育力.輔助生殖技術(shù)（ART）是目前改善不孕不育的有效手段，但中國(guó)ART市場(chǎng)總體仍供不應(yīng)求［2］，且近年來(lái)接受ART

治療患者年齡分布向高齡偏移，男方精子質(zhì)量的下降成為影響ART結(jié)果的重要因素［3］.目前常使用睪酮替代療法治療男性衰老過(guò)程中的相關(guān)疾病，但副作用會(huì)超過(guò)其潛在的健康益處［4］，而補(bǔ)腎中藥對(duì)不育不孕和延緩衰老有獨(dú)到作用［5］，但其生物學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制尚未被闡明.

本課題組研究證實(shí)，補(bǔ)腎中藥何首烏飲可提高老齡大鼠血清睪酮水平、精子密度和精子活力［6-7］，文獻(xiàn)［11］研究證實(shí)DNA甲基化與精子發(fā)生、衰老密切相關(guān).本課題組通過(guò)基因芯片篩查發(fā)現(xiàn)，老齡大鼠睪丸組織中有912個(gè)基因受何首烏飲調(diào)控，其中包含大量與睪丸發(fā)育、精子發(fā)生和機(jī)體衰老密切相關(guān)的DNA甲基化調(diào)控基因.基于此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討何首烏飲改善睪丸生殖功能的DNA甲基化機(jī)制，為補(bǔ)腎類(lèi)中藥防治衰老及提高男性生殖功能的作用機(jī)制提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥物制備

選用SPF級(jí)雄性Wistar大鼠30只（350～390 g），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)碼為SCXK（京）2016-0006，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供.

何首烏飲由制首烏、淫羊藿、丹參、懷牛膝、茯苓和肉蓯蓉以3∶2∶5∶2∶3∶2的質(zhì)量比組成.本實(shí)驗(yàn)使用廣東一方有限公司生產(chǎn)的中藥顆粒，由單味中藥飲片按傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)炮制后經(jīng)提取濃縮制成，成分與中藥飲片一致.顆粒與中藥飲片的物質(zhì)的量比為制首烏1∶9.1，淫羊藿1∶20，丹參1∶5.6，懷牛膝1∶4，茯苓1∶20，肉蓯蓉1∶20.

何首烏飲大鼠灌胃量：依據(jù)大鼠和人給藥換算比例，結(jié)合前期研究結(jié)果，中劑量的何首烏飲對(duì)大鼠的最佳給藥量為0.048 g/g［9］.根據(jù)廣東一方有限公司生產(chǎn)的配方顆粒的生藥飲片與顆粒物質(zhì)的量比換算，大鼠給藥量（顆粒）為7.3 mg/g，生理鹽水溶解顆粒后，灌胃質(zhì)量濃度為0.9 g/mL.

含藥血清制備：雄性Wistar大鼠，何首烏飲組灌胃何首烏飲（空白組為同體積生理鹽水），2次/d，相同時(shí)間進(jìn)行，連續(xù)灌胃7 d，第7天給藥1 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉溶液（0.05 mg/g）麻醉內(nèi)眥取血，離心取血清，-80 ℃保存.

1.2 主要試劑與儀器

鼠源BrdU單克隆抗體（美國(guó)Sigma公司）;PrimeScript RT reagent Kit with Gdna Eraser（日本TaKaRa公司）;TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒（日本TaKaRa公司）;TRIzol Reagent試劑盒（美國(guó)Ambion公司）;基因組DNA快速提取Kit（山東艾德森生物科技股份公司）;安捷倫Mx 3000P熒光定量PCR儀（美國(guó)AgiLent technoLogies公司）;全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek Epoch公司）.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組和取材

SPF級(jí)Wistar雄性大鼠12月齡30只，正常飲食、飲水，動(dòng)物房溫度控制在（22±0.2） ℃.動(dòng)物使用均按照中華人民共和國(guó)國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的《中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn).

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組：1）青年組（YG）；2）老齡組（NAG）；3）何首烏飲組（SWYG）；每組10只.YG組于12月齡取材，SWYG組和NAG組于12月齡分別灌胃何首烏飲（顆粒）7.3 mg/g和等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)60 d，于18月齡取材.BrdU（50 μg/g，Solarbio，China）注射，每4 h注射1次，共3次，最后1次注射4 h后取材.腹腔注射戊巴比妥鈉溶液麻醉，左側(cè)睪丸放入40 g/L的多聚甲醛固定液中，4 ℃過(guò)夜，常規(guī)制備石蠟切片，右側(cè)睪丸立即投入液氮中，-80 ℃保存待用.

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)和衰老模型構(gòu)建

選用17～21 d的幼年雄性Wistar大鼠，分離、培養(yǎng)原代Leydig細(xì)胞.細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清（Biological Industries）、100 U/mL青鏈霉素的Gibcos DMEM/F12完全培養(yǎng)基.細(xì)胞置于培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，第3天細(xì)胞融合度為80%左右時(shí)進(jìn)行傳代，傳代后培養(yǎng)3 d，繼續(xù)傳至第3代，培養(yǎng)2 d，將其分為正常對(duì)照組（NCG）、衰老模型組（AG）與何首烏飲組（HSWY），待用.采用自由基氧化損傷刺激構(gòu)建Leydig細(xì)胞衰老模型［10］：傳至第3代的Leydig細(xì)胞培養(yǎng)2 d后，給予AG與HSWY組細(xì)胞300 μmol/L H2O2（2 μL）以及100 μmol/L FeSO4（1 μL）進(jìn)行刺激，NCG組給與同等體積PBS溶液，作用2 h，每天同一時(shí)間進(jìn)行，連續(xù)4 d，更換新鮮的培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)3 d；之后HSWY組細(xì)胞在體積分?jǐn)?shù)5%胎牛血清＋體積分?jǐn)?shù)10%含藥血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d，其余組細(xì)胞在體積分?jǐn)?shù)5%的胎牛血清＋體積分?jǐn)?shù)10%的大鼠空白血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d.

1.3.3 DNA甲基化芯片檢測(cè)

各組取睪丸組織提取基因組DNA（gDNA），首次回收并標(biāo)記（NimbleGen Dual-Color DNA Labeling Kit， Roche，Switzerland）MeDIP DNA，二次回收標(biāo)記的DNA和芯片（上?？党缮锛夹g(shù)有限公司）在42 ℃下雜交16 ～20 h，雜交完成后清洗芯片.對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行中值標(biāo)準(zhǔn)化、quantile標(biāo)準(zhǔn)化和線性平滑處理.標(biāo)準(zhǔn)化后的log2-ratio數(shù)據(jù)用于尋找差異甲基化峰，

從中選取5個(gè)與睪丸精子發(fā)育有密切關(guān)系的受何首烏飲差異表達(dá)基因AXL、Ttc29、wnt2b、MAPK10、C-myb，通過(guò)甲基化特異性PCR（MSP）與實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)檢測(cè)基因甲基化水平及mRNA表達(dá)水平.

1.3.4 甲基化特異性PCR（MSP）

采用DNA提取試劑盒（TIANamp Genomic DNA kit，天根公司，中國(guó)）提取基因組DNA，采用轉(zhuǎn)化試劑盒（ZYMO EZ DNA Methylation-Gold kit，ZYMO RESEARCH，美國(guó)）進(jìn)行DNA亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，利用Methprimer在線軟件（http：//www.urogene.org）對(duì)挑選的目的基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（表1），確定合適的引物，由Invitrogen公司合成設(shè)計(jì)引物.然后采用MSP甲基化試劑盒（ZymoTaq PreMix kit，ZYMO RESEARCH，美國(guó)）試劑盒以亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的DNA為模板進(jìn)行MSP實(shí)驗(yàn).根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，分析啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化情況，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量分析：Image J軟件測(cè)量各核酸條帶光密度值，計(jì)算各基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化程度，即

甲基化百分比=DNA甲基化核酸光密度值/（未DNA甲基化核酸光密度值+DNA甲基化核酸光密度值）×100%.

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）

睪丸組織和Leydig細(xì)胞中的總RNA使用TRIZOL法進(jìn)行提取，提取完成后的RNA利用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè).通過(guò)普通PCR儀反轉(zhuǎn)錄成cDNA，SYBR作為熒光染料進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，各組均以β-actin為內(nèi)參，引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表2. 2-△△Ct計(jì)算方法對(duì)各組Ct值進(jìn)行計(jì)算后，使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.

1.3.6 慢病毒轉(zhuǎn)染敲低Leydig細(xì)胞DNMT1基因

將傳至第3代的Leydig細(xì)胞培養(yǎng)2 d后，PBS清洗1遍，6孔板各孔均加入1 mL 5 μg/mL的Polybrene液，同時(shí)加入pSicoR-DNMT1慢病毒（中國(guó)吉瑪基因公司）懸液（滴度為7×108 TU/mL），通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中綠色熒光的強(qiáng)度和位置，計(jì)算最佳作用時(shí)長(zhǎng)和轉(zhuǎn)染效率.DNMT1敲低組（DNMT1-sh-RNA）、陰性對(duì)照組（nc）和DNMT1敲低+HSWY組（DNMT1-shRNA+HSWY）均在第3天加入30 μL慢病毒懸液，其中陰性對(duì)照組或正常組分別加入30 μL 陰性質(zhì)粒病毒或PBS，作用8 h.正常組、DNMT1敲低組和陰性對(duì)照組在體積分?jǐn)?shù)5%、10%胎牛血清和空白血清混合培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)7 d，DNMT1敲低+HSWY組在體積分?jǐn)?shù)5%的胎牛血清＋體積分?jǐn)?shù)10%的大鼠含藥血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)7 d.

1.3.7 β-半乳糖苷酶染色

采用β-半乳糖苷酶染色鑒定細(xì)胞衰老狀態(tài).每組隨機(jī)選取3只大鼠睪丸組織，沿睪丸組織橫軸正中位置進(jìn)行連續(xù)切片，厚4 μm.切片梯度酒精水化.采用β-半乳糖苷酶染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）對(duì)切片進(jìn)行染色，陽(yáng)性產(chǎn)物呈藍(lán)色，定位于間質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì).每只大鼠選用相近的部位染色觀察，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞率.

1.3.8 睪酮含量測(cè)定

使用ELISA檢測(cè)試劑盒（Cayman，美國(guó)）分別檢測(cè)各組大鼠血清和Leydig細(xì)胞培養(yǎng)液的上清液睪酮含量（嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明操作）.

1.3.9 免疫組化與熒光染色

每組隨機(jī)選取3只大鼠睪丸組織，沿睪丸組織橫軸正中位置進(jìn)行連續(xù)切片，厚4 μm.切片梯度酒精水化，熱抗原修復(fù)，H2O2封閉.

DNMT1一抗（1∶1 000，abways，兔源）4 ℃孵育過(guò)夜.采用SP兩步法試劑盒（中杉金橋）以及DAB顯色（中杉金橋）；陰性對(duì)照加入不含抗體的一抗稀釋液.每只大鼠選用相近的部位染色觀察，隨機(jī)選擇10個(gè)視野，顯微鏡拍照（Nikon），利用Image J軟件的IHC Profiler插件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，按照不同的染色強(qiáng)度等級(jí)進(jìn)行評(píng)分，每個(gè)視野內(nèi)的強(qiáng)陽(yáng)性：3分，陽(yáng)性：2分，弱陽(yáng)性：1分，陰性：0分.每個(gè)視野的得分指數(shù)為各等級(jí)細(xì)胞所占的百分比×相應(yīng)評(píng)分.IHC得分為各組中所有視野得分指數(shù)的平均值.

BrdU一抗（1∶100，Abcam）4 ℃孵育過(guò)夜.熒光二抗（1∶1 000）室溫孵育后DAPI染色（避光）.熒光顯微鏡下觀察拍照，每只大鼠選用相近的部位染色觀察，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù).

1.3.10 統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)SPSS軟件（22.0版本）對(duì)文中所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和差異分析.最終結(jié)果使用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SDS）形式，數(shù)據(jù)需要經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，保證數(shù)據(jù)能夠滿(mǎn)足正態(tài)分布密度曲線后進(jìn)行比較，采用單因素方差分析或獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，若方差齊用LSD法，不齊則用Dunnett’s T3法.檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05.

2 結(jié)果

2.1 血清睪酮測(cè)定結(jié)果

為驗(yàn)證衰老與生精功能間的關(guān)系，檢測(cè)各組大鼠血清睪酮水平.

結(jié)果表明，與青年組（YG）相比，老齡組（NAG）血清睪酮水平明顯下降（Plt;0.05），何首烏飲可顯著提高老齡大鼠血清睪酮水平（Plt;0.05）（圖1）.

2.2 睪丸組織β-半乳糖苷酶染色結(jié)果

在細(xì)胞衰老進(jìn)程中β-半乳糖苷酶活性增加，β-半乳糖苷酶染色是目前公認(rèn)的衰老染色金標(biāo)準(zhǔn)之一.結(jié)果（圖2）顯示，β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞呈藍(lán)綠色，主要定位于間質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中.隨著增齡大鼠睪丸組織β-半乳糖苷酶活性明顯增高，NAG組明顯高于YG組（Plt;0.05）；何首烏飲干預(yù)后β-半乳糖苷酶表達(dá)明顯低于NAG組（P lt;0.05）.

2.3 睪丸組織BrdU熒光染色結(jié)果

熒光染色結(jié)果（圖3）顯示，BrdU陽(yáng)性產(chǎn)物位于細(xì)胞核中，呈散點(diǎn)或紅色斑塊狀，各組中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞均位于精原小管基底膜附近的精原細(xì)胞中，核DAPI顏色為藍(lán)色.統(tǒng)計(jì)分析表明，與YG組相比，NAG組睪丸組織中Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著減少（Plt;0.05），而給予何首烏飲作用后陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加（Plt;0.05）.

2.4 睪丸組織DNMT1免疫組化結(jié)果

DNMT1陽(yáng)性產(chǎn)物定位于睪丸細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中.蛋白表達(dá)顯示棕黃色，在生精小管內(nèi)的精原細(xì)胞、精母細(xì)胞以及小管間的間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)（圖4）.NAG組DNMT1表達(dá)量明顯低于YG組（Plt;0.05）；何首烏飲干預(yù)后DNMT1表達(dá)量明顯高于NAG組（Plt;0.05）.

2.5 甲基化芯片篩選結(jié)果

采用甲基化芯片分析了YG組、NAG組以及SWYG組大鼠睪丸組織中15 987個(gè)基因的啟動(dòng)子（圖5a～c），篩選出NAG組與YG組差異甲基化基因1 728個(gè)，其中受何首烏飲調(diào)控的差異甲基化基因共有238個(gè)（圖5d～e），其中：NAG組中有552個(gè)基因啟動(dòng)子的甲基化程度降低，何首烏飲干預(yù)后可使103個(gè)基因甲基化水平上調(diào)；NAG組有1 176個(gè)基因啟動(dòng)子的甲基化程度升高，而何首烏飲用藥后，使其中135個(gè)基因的甲基化水平出現(xiàn)下降.通過(guò)GO分析，何首烏飲調(diào)控的差異甲基化基因群體涉及701個(gè)生物學(xué)過(guò)程，54個(gè)細(xì)胞組分和76個(gè)分子功能.主要包括生物調(diào)節(jié)過(guò)程、代謝過(guò)程、大分子代謝過(guò)程等生物學(xué)過(guò)程（圖5f）.何首烏飲調(diào)控的差異甲基化基因主要涉及細(xì)胞內(nèi)組分、細(xì)胞器組分、細(xì)胞核組分及胞漿組分等（圖5g）和金屬離子結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、核酸結(jié)合等分子功能（圖5h）.受何首烏飲調(diào)控的238個(gè)基因分布在23條信號(hào)通路上，這些信號(hào)通路與代謝、腫瘤、疾病、細(xì)胞增殖和凋亡、細(xì)胞黏附、性腺發(fā)育、炎癥、基因轉(zhuǎn)錄等有關(guān)，從中選取5個(gè)與睪丸精子發(fā)育有密切關(guān)系的受何首烏飲調(diào)控的差異表達(dá)基因AXL、Ttc29、wnt2b、MAPK10、C-myb，通過(guò)MSP與qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)基因甲基化水平及mRNA表達(dá)水平.

2.6 差異基因甲基化水平及mRNA表達(dá)水平

采用MSP檢測(cè)基因在各組睪丸組織的甲基化水平（圖6a），半定量分析（圖6b）表明，與YG組相比，NAG組AXL、Wnt2b及MAPK10啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平均顯著下降（Plt;0.05），而Ttc29、C-myb啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平均顯著升高（Plt;0.05），何首烏飲作用后可提高AXL、Wnt2b及MAPK10的甲基化水平并降低Ttc29、C-myb的甲基化水平.RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果（圖6c）顯示，與YG組相比，NAG組AXL、Ttc29、C-myb的mRNA表達(dá)水平明顯降低（Plt;0.05）；而wnt2b及MAPK10的mRNA表達(dá)水平明顯升高（Plt;0.05），何首烏飲作用后可提高AXL、Ttc29、C-myb的mRNA表達(dá)水平及降低wnt2b及MAPK10的mRNA表達(dá)水平；YG組與SWYG組之間無(wú)顯著性差異（Pgt;0.05）.對(duì)基因甲基化程度及mRNA表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析（表3），結(jié)果顯示：AXL和Ttc29的甲基化程度和mRNA表達(dá)水平的相關(guān)系數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；而Wnt2b、MAPK10、C-myb的甲基化程度和mRNA表達(dá)水平呈高度的負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）.

2.7 Leydig細(xì)胞C-myb及wnt2b甲基化水平

為驗(yàn)證何首烏飲是否介導(dǎo)DNMT1改善衰老Leydig細(xì)胞DNA甲基化和睪酮分泌，采用慢病毒轉(zhuǎn)染敲低Leydig細(xì)胞DNMT1，熒光拍照、RT-qPCR及WB結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30 μL病毒懸液與Leydig細(xì)胞作用8 h，轉(zhuǎn)染敲低效率最高（圖7）.選取C-myb及wnt2b基因檢測(cè)其在Leydig細(xì)胞中的甲基化程度.實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖8）表明，與正常對(duì)照組相比，衰老模型組wnt2b與C-myb甲基化水平均顯著降低（Plt;0.05），何首烏飲顯著提高wnt2b與C-myb甲基化水平，與衰老模型組相比有顯著性差異（Plt;0.05）.與正常對(duì)照組相比，DNMT1敲低組wnt2b與C-myb DNA甲基化程度均明顯下調(diào)（Plt;0.05），DNMT1敲低＋HSWY組wnt2b與C-myb甲基化水平顯著升高，與DNMT1敲低組相比有顯著性差異（Plt;0.05），陰性對(duì)照組與正常對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Pgt;0.05）.

2.8 Leydig細(xì)胞培養(yǎng)液睪酮質(zhì)量濃度檢測(cè)結(jié)果

為驗(yàn)證DNMT1對(duì)生精功能的作用，檢測(cè)了DNMT1敲低及何首烏飲干預(yù)對(duì)Leydig細(xì)胞睪酮生成的影響，結(jié)果（圖9）表明，與正常對(duì)照組相比，衰老模型組和DNMT1敲低組細(xì)胞培養(yǎng)液中睪酮水平均顯著降低（Plt;0.05），何首烏飲可部分改善細(xì)胞衰老模型及DNMT1敲低導(dǎo)致的睪酮水平下降（與衰老模型組和DNMT1敲低組相比Plt;0.05）.

3 討論

隨著年齡的增長(zhǎng)，男性生殖系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能退化，出現(xiàn)睪酮水平降低、睪丸體積減少、精子密度和活力降低，精子發(fā)生能力減弱以及精子染色體異常等現(xiàn)象.文獻(xiàn)［11］已證明男性衰老之后血睪屏障發(fā)生異常，睪丸支持細(xì)胞數(shù)量減少，生精細(xì)胞增殖和凋亡的穩(wěn)態(tài)受到干擾，進(jìn)而導(dǎo)致男性生殖功能的下降.目前針對(duì)男性生殖衰老尚無(wú)有效的治療策略.大量研究表明中藥在延緩衰老過(guò)程中發(fā)揮重要作用，何首烏飲是中醫(yī)臨床中常用的補(bǔ)腎類(lèi)方劑，由制首烏、淫羊藿、茯苓、丹參、懷牛膝和肉蓯蓉組成，具有充髓生精、延年黑發(fā)等作用，臨床用于“腎精虧虛”致不孕不育和衰老等，其組方精當(dāng)，療效卓著.前期研究證明何首烏飲能改善衰老大鼠血清睪酮水平、精子密度、精子活力和生育能力，還可以調(diào)節(jié)衰老大鼠睪丸組織中與精子發(fā)生和衰老相關(guān)的表觀遺傳基因的表達(dá)［6，9-10］.

個(gè)體的衰老進(jìn)程與哺乳動(dòng)物體內(nèi)的DNA甲基化變化密切相關(guān)，當(dāng)個(gè)體處于胚胎期時(shí)，體內(nèi)的5-甲基胞嘧啶（5-Methylcytosine）水平達(dá)到頂點(diǎn)，隨著年齡的增長(zhǎng)其水平逐漸下降［12］.為了探究基因DNA甲基化程度與衰老大鼠睪丸生殖功能關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)以大鼠睪丸組織為材料，通過(guò)DNA甲基化測(cè)序，發(fā)現(xiàn)自然衰老組大鼠睪丸組織中有1 728個(gè)基因DNA甲基化水平發(fā)生改變，其中，552個(gè)基因DNA甲基化程度下降，1 176個(gè)基因DNA甲基化程度上升，而何首烏飲可直接調(diào)控238個(gè)基因的甲基化水平，且大量基因與睪丸的生精功能及衰老相關(guān)，如AXL、Ttc29、wnt2b、MAPK10、C-myb對(duì)睪丸的生精功能有重要調(diào)控作用.因此，推測(cè)何首烏飲可通過(guò)介導(dǎo)關(guān)鍵基因的DNA甲基化水平和表達(dá)水平延緩睪丸組織衰老過(guò)程.

AXL（anexelekto）是受體酪氨酸激酶家族TAM受體的成員之一，它與Mer和Tyro3一起形成TAM受體，于成年小鼠睪丸組織的巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞中高表達(dá)，在維持睪丸組織穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用.GAS6是TAM受體的共同配體，在小鼠睪丸組織中可介導(dǎo)暴露在凋亡細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）與巨噬細(xì)胞的TAM受體形成AXL-GAS6-PS復(fù)合物，促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡的吞噬作用，有利于維持睪丸組織的免疫穩(wěn)態(tài)，為精子發(fā)生提供穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境［13］.本研究發(fā)現(xiàn)，衰老大鼠睪丸組織AXL啟動(dòng)子甲基化水平及mRNA表達(dá)水平下降，給予何首烏飲后能提高AXL的啟動(dòng)子甲基化水平及mRNA表達(dá)水平，從而提高了精子發(fā)生的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性.Wnt家族是一種睪丸組織原癌基因，在胚胎發(fā)育、組織干細(xì)胞更新、分化過(guò)程中起關(guān)鍵調(diào)控作用，促進(jìn)睪丸組織的發(fā)育［14］.睪丸組織啟動(dòng)減數(shù)分裂時(shí)，經(jīng)典的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)激活，進(jìn)而粗促進(jìn)未分化的精原細(xì)胞更新［15］，而過(guò)量的wnt2b會(huì)抑制細(xì)胞增殖和分化并導(dǎo)致組織的畸形生長(zhǎng)［16］.本研究發(fā)現(xiàn)，衰老大鼠睪丸組織及Leydig細(xì)胞的wnt2b啟動(dòng)子甲基化水平下降而mRNA表達(dá)水平增高，何首烏飲作用后可能通過(guò)提高其DNA甲基化水平和表達(dá)水平促進(jìn)細(xì)胞周期和分化，促進(jìn)精子發(fā)生.MAPK10（JNK3）是JNK家族的重要成員，它通過(guò)激活c-jun/AP1來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)，同時(shí)又可以激活p53，從而導(dǎo)致p53依賴(lài)的細(xì)胞發(fā)生凋亡.前期研究［17］已證明何首烏飲可以使衰老大鼠睪丸組織中p53蛋白的表達(dá)下調(diào)，抑制睪丸組織細(xì)胞的凋亡.本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)衰老大鼠睪丸組織MAPK10啟動(dòng)子甲基化水平降低，mRNA表達(dá)水平增高，何首烏飲作用后可提高大鼠睪丸組織MAPK10的啟動(dòng)子甲基化水平，降低mRNA表達(dá)水平，從而抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)精子的發(fā)生.C-myb是一種在睪丸組織中高度表達(dá)的原癌基因，對(duì)睪丸組織的功能有調(diào)節(jié)作用.研究［18］表明C-myb可調(diào)控支持細(xì)胞功能，促進(jìn)生精微環(huán)境穩(wěn)定.另外，C-myb還可以促進(jìn)在體外培養(yǎng)的大鼠Leydig細(xì)胞分泌睪酮［19］.且前期基礎(chǔ)研究［20］已證明何首烏飲可提高衰老大鼠的血清睪酮含量.本研究發(fā)現(xiàn)與青年對(duì)照組相比，NAG組大鼠睪丸組織C-myb的啟動(dòng)子甲基化水平增高，mRNA表達(dá)水平降低，給予何首烏飲后提高mRNA的表達(dá)水平，可能與何首烏飲促進(jìn)Leydig細(xì)胞分泌睪酮，提高精子質(zhì)量有關(guān).Ttc29是一種在睪丸組織階段特異性表達(dá)的基因，主要在成熟大鼠睪丸組織的粗線期精母細(xì)胞中表達(dá)，在減數(shù)分裂及精母細(xì)胞向精子細(xì)胞的轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用.由Ttc29編碼的動(dòng)力蛋白可以與其他功能蛋白結(jié)合，促進(jìn)正常的精子發(fā)生過(guò)程［21］.本研究發(fā)現(xiàn)，衰老大鼠睪丸組織Ttc29的啟動(dòng)子甲基化水平增高，mRNA的表達(dá)水平降低，何首烏飲作用后提高mRNA的表達(dá)水平，從而影響睪丸生精微環(huán)境，促進(jìn)生精進(jìn)程.上述實(shí)驗(yàn)證明幾個(gè)與生精功能密切相關(guān)的基因可在何首烏飲的作用下調(diào)控其DNA甲基化和表達(dá)水平從而調(diào)節(jié)精子發(fā)生，進(jìn)而調(diào)控生精過(guò)程.

細(xì)胞分裂標(biāo)記物BrdU是一類(lèi)胸腺嘧啶核苷類(lèi)似物，細(xì)胞有絲分裂時(shí)可代替胸腺嘧啶（T）參與DNA分子的復(fù)制，可通過(guò)Apollo熒光染料檢測(cè)，反映細(xì)胞增殖率.統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，何首烏飲使衰老大鼠睪丸組織精原細(xì)胞BrdU陽(yáng)性數(shù)明顯增多，說(shuō)明何首烏飲能促進(jìn)衰老大鼠睪丸組織精原細(xì)胞的DNA復(fù)制.

睪酮由Leydig細(xì)胞分泌，可促進(jìn)男性性腺發(fā)育并調(diào)控精子發(fā)生，對(duì)男性的生長(zhǎng)發(fā)育繁殖起著重要作用，但體內(nèi)睪酮含量會(huì)隨年齡的增長(zhǎng)而減低.衰老導(dǎo)致的Leydig細(xì)胞功能退化是體內(nèi)睪酮含量降低的主要原因［22］.DNMT1是維持整個(gè)基因甲基化模式的主要酶類(lèi)，且在多種細(xì)胞中調(diào)控衰老進(jìn)程的發(fā)生［23-24］.為了探究DNMT1與Leydig細(xì)胞衰老及基因DNA甲基化水平的關(guān)系，采用DNMT1低表達(dá)慢病毒載體，MSP技術(shù)檢測(cè)了Leydig細(xì)胞敲低DNMT1基因后wnt2b和C-myb的甲基化程度.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DNMT1敲低后leydig細(xì)胞中wnt2b和C-myb DNA甲基化水平降低，變化趨勢(shì)與自然衰老組一致.該研究表明DNMT1通過(guò)調(diào)節(jié)wnt2b和C-myb DNA甲基化水平，進(jìn)而影響Leydig細(xì)胞的功能.

綜上所述，何首烏飲可能通過(guò)調(diào)控表觀遺傳基因DNA甲基化和表達(dá)水平提高大鼠睪丸組織增殖能力，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究.

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（責(zé)任編輯：趙藏賞）

收稿日期：2023-08-11；修回日期：2023-11-10

基金項(xiàng)目：

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81673714）;河北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目-中醫(yī)藥創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)（223777134D）;河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（ZD2022060）;河北省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃項(xiàng)目（2022115）

第一作者：石炳燁（1983—），男，河北大學(xué)附屬醫(yī)院主治醫(yī)師，河北大學(xué)在讀碩士研究生，主要從事男性生殖衰老研究.E-mail：2435231348@qq.com

通信作者：牛嗣云（1967—），女，滿(mǎn)族，河北大學(xué)教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事生殖衰老方向研究.

E-mail：nsy1688@163.com

甄曉蘭（1976—），女，河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院副主任藥師，主要從事生殖衰老方向研究.E-mail：zhenxlan2007@163.com