王瑛華，王小菁

(1.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣東省植物發(fā)育工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510631；2.肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東肇慶 526061)

干旱、鹽、極端溫度、高光、重金屬等非生物脅迫，嚴(yán)重影響了植物的生長(zhǎng)和作物產(chǎn)量，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大威脅[1].非生物脅迫是全球范圍內(nèi)作物減產(chǎn)的主要原因，幾種主要的作物平均減產(chǎn)高達(dá)50%以上[2].為了適應(yīng)各種脅迫環(huán)境，植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中發(fā)展形成了各種不同的分子、細(xì)胞和生理生化機(jī)制，以抵御、適應(yīng)各種不利生境[3].至今尚未完全闡明逆境對(duì)植物產(chǎn)生危害和植物抗逆的機(jī)制，但從遺傳、細(xì)胞和生理生化多方面對(duì)抗逆機(jī)理的研究已取得了顯著的進(jìn)展[4-6].如一系列逆境相關(guān)基因得到克隆和功能鑒定， 將有用的基因轉(zhuǎn)入作物，提高作物抗非生物逆境的能力[7-12].然而，發(fā)現(xiàn)和研究新的抗逆蛋白仍然是植物抗逆性研究的熱點(diǎn)之一.

脅迫相關(guān)蛋白(Stress Associated Protein，SAP)是一類涉及脅迫應(yīng)答和脅迫調(diào)控的鋅指蛋白，近年研究發(fā)現(xiàn)SAP蛋白在植物中具有抗非生物脅迫的功能.本文對(duì)SAP蛋白與植物抗逆性的關(guān)系作一評(píng)述.

1 SAP蛋白的結(jié)構(gòu)和分類

1.1 SAP蛋白的結(jié)構(gòu)

SAP蛋白組成一個(gè)重要的涉及脅迫應(yīng)答和脅迫調(diào)控的基因家族,蛋白家族具有A20/AN1 鋅指結(jié)構(gòu)域特征[13].動(dòng)物SAP蛋白研究較深入，例如腫瘤壞死因子(TNFα)、人AWP1和ZNF216等.在人的內(nèi)皮細(xì)胞中，具A20結(jié)構(gòu)域的TNFα通過抑制核因子κB(NFκB)活性調(diào)控免疫應(yīng)答.A20結(jié)構(gòu)域位于蛋白的C端，特征是具有多個(gè)半胱氨酸2/半胱氨酸2(Cys2/Cys2)鋅指基元，它的保守序列為CX2-4CX11CX2C(X代表任意氨基酸)[14].另一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)AN1最早發(fā)現(xiàn)于編碼非洲爪蟾動(dòng)物半球母體RNA的蛋白中[15].AN1鋅指結(jié)構(gòu)域的保守序列為CX2CX9-12CX1-2CX4CX2HX5HXC.目前AN1結(jié)構(gòu)域確切的生物學(xué)功能仍不清楚，發(fā)現(xiàn)人ZNF216蛋白中的AN1結(jié)構(gòu)域與TRAF6(TNF受體相關(guān)因子6)相互作用[16].人AWP1與一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PRK1相互作用，在細(xì)胞調(diào)控中發(fā)揮重要作用，如參與蛋白磷酸化和細(xì)胞凋亡過程[17].人ZNF216蛋白負(fù)調(diào)控NFκB的免疫調(diào)控激活途徑和抗細(xì)胞凋亡基因的轉(zhuǎn)錄[16]，小鼠ZNF216蛋白具有泛素化活性和去泛素化活性[18].

1.2 SAP蛋白的分類

根據(jù)SAP蛋白結(jié)構(gòu)上的鋅指特點(diǎn)，通過系統(tǒng)進(jìn)化分析將A20/AN1蛋白家族分為2大類：類型ⅠSAP蛋白具有典型的CX2CX9-12CX1-2CX4CX2HX5HXC結(jié)構(gòu)；類型 Ⅱ 具有擴(kuò)展的CX4CX9-12CX1-2CX4CX2HX5HXC結(jié)構(gòu)[19].大多數(shù)類型Ⅰ成員的編碼序列不含內(nèi)含子且有1個(gè)A20結(jié)構(gòu)域，而大多數(shù)類型 Ⅱ 成員有1個(gè)內(nèi)含子卻缺乏A20結(jié)構(gòu)域.進(jìn)化分析揭示，類型Ⅰ的進(jìn)化率高于類型Ⅱ的.類型Ⅰ又分為3個(gè)亞類:ⅠA，ⅠB和ⅠC.亞類ⅠA包含42個(gè)成員，在N端具有1個(gè)完整的A20結(jié)構(gòu)域，在C端則具有1個(gè)完整的AN1結(jié)構(gòu)域.亞類ⅠB包括4個(gè)成員，除了水稻OsAN116以外，都有1個(gè)不完整的AN1結(jié)構(gòu)域和1個(gè)A20結(jié)構(gòu)域.亞類ⅠC的5個(gè)成員具有2個(gè)A20結(jié)構(gòu)域或者沒有該結(jié)構(gòu)域.類型Ⅱ被分為2個(gè)亞類：ⅡA和ⅡB.在植物中，這2個(gè)亞類的成員均來自單子葉植物和雙子葉植物，暗示植物中類型Ⅱ的SAP基因的起源可能發(fā)生于單子葉植物和雙子葉植物分離之前.除了AN1結(jié)構(gòu)域以外，亞類ⅡA還具有其他保守結(jié)構(gòu)，如C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域.除去擬南芥AtAN19只有1個(gè)C2H2鋅指，其它的亞類ⅡA成員在C端均有2個(gè)C2H2鋅指.而亞類ⅡB僅有ZnF-AN1結(jié)構(gòu)域，不包含其他類型的結(jié)構(gòu)域.

1.3 植物中的SAP蛋白基因

具有A20/AN1鋅指結(jié)構(gòu)的SAP蛋白普遍存在于真核生物中，在動(dòng)物中研究的較深入，但它們?cè)谥参镏械墓δ懿⒉皇智宄?2004年，MUKHOPADHYAY等從秈稻中克隆到1個(gè)含有A20和AN1鋅指結(jié)構(gòu)的基因，A20和AN1鋅指分別位于N端和C段.這個(gè)基因被命名為OsiSAP1，是植物中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)SAP基因，超表達(dá)OsiSAP1的轉(zhuǎn)基因煙草抵抗多種非生物脅迫的能力增強(qiáng)[20].隨后玉米[19]、毛果楊[19,21]、萊茵衣藻[19-21]、粳稻[22-23]、擬南芥[21-24]、獐毛[25]、番茄[26]等物種中的SAP基因相繼被研究.在已經(jīng)完成基因組測(cè)序的植物中該蛋白家族基因廣泛存在，例如水稻和高粱中均含有18個(gè)SAP基因，擬南芥中有14個(gè)SAP基因，毛果楊、番茄和葡萄的SAP基因家族分別有19、13和10個(gè)成員，玉米中至少有11個(gè)SAP基因，低等生物萊茵衣藻中僅有3個(gè)[19, 21-26].

不同的蛋白質(zhì)通常分布于細(xì)胞的不同部位，它們的空間定位與其功能密切相關(guān).植物SAP蛋白中水稻OsiSAP8和ZFP177亞細(xì)胞定位[1,22].分析OsiSAP8基因產(chǎn)物，該基因缺乏核定位信號(hào)(NLS)或DNA結(jié)合域.Sosui分析和 pSORT分析預(yù)測(cè)OsiSAP8是一個(gè)親水性可溶的細(xì)胞質(zhì)蛋白.GFP-OsiSAP8融合蛋白特異性地定位于煙草葉片表皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)與許多鋅指蛋白不同，OsiSAP8是一個(gè)細(xì)胞質(zhì)蛋白[1].與OsiSAP8相似，HUANG等人研究水稻ZFP177蛋白(即OsiSAP9)時(shí)發(fā)現(xiàn)，ZFP177序列中無信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域和典型的核定位信號(hào)；構(gòu)建ZFP177-GUS融合載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草葉片，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZFP177-GUS融合蛋白遍布于煙草葉和根細(xì)胞中，從而證明了ZFP177是一個(gè)細(xì)胞質(zhì)蛋白[22].與之相似，動(dòng)物細(xì)胞中的A20蛋白也是一個(gè)細(xì)胞質(zhì)蛋白[27].這些結(jié)果說明，植物SAP基因家族的產(chǎn)物可能是細(xì)胞質(zhì)蛋白.

2 植物SAP基因的表達(dá)調(diào)控

關(guān)于植物SAP基因表達(dá)模式的研究主要集中于水稻和擬南芥這2種模式植物中.秈稻OsiSAP1在水稻基因組中是一個(gè)無內(nèi)含子的單拷貝基因.OsiSAP1受到不同類型脅迫的誘導(dǎo)，諸如冷、干燥、鹽、水浸沒、重金屬以及傷害等，另外也受到脅迫激素ABA的誘導(dǎo)[20].VIJ等人應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析了非生物脅迫對(duì)水稻SAP家族基因表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有的水稻SAP基因均受到一種或幾種非生物脅迫的誘導(dǎo).其中，在鹽和干旱脅迫下，OsSAP14和OsSAP10 的表達(dá)水平上調(diào)最高，分別為非脅迫條件下的11和22倍.OsSAP1,OsSAP9,OsSAP11,OsSAP12,OsSAP14和OsSAP17等6個(gè)基因在冷脅迫下上調(diào)表達(dá)[23].OsiSAP8是一個(gè)多種脅迫誘導(dǎo)型基因，受到不同的脅迫誘導(dǎo)，例如熱、冷、鹽、干燥、水浸沒、傷害、重金屬和ABA[1].我國研究者從粳稻中克隆到12個(gè)A20/AN1型鋅指蛋白基因[22]，這些基因大多數(shù)在根、莖、葉和穗中呈組成型表達(dá).通過基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)其中4個(gè)基因(ZFP177,ZFP181,ZFP176,ZFP173)受到冷脅迫的誘導(dǎo)， 2個(gè)基因(ZFP181和ZFP176) 和1個(gè)ZFP157基因則分別受到干旱和H2O2處理的誘導(dǎo).ZFP177對(duì)冷和熱脅迫均產(chǎn)生應(yīng)答，但受鹽脅迫下調(diào)[22].在擬南芥中，大多數(shù)的SAP基因也涉及非生物脅迫應(yīng)答[19].如擬南芥AtSAP12基因的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)烈地受到冷和鹽脅迫的誘導(dǎo)，脅迫6 h后表達(dá)水平高，24 h和48 h后降低，AtSAP12蛋白含量也有所下降[24].

Northern雜交實(shí)驗(yàn)表明，玉米SAP基因家族的大多數(shù)成員對(duì)非生物脅迫產(chǎn)生應(yīng)答[19].番茄栽培種Pusa Ruby中有13個(gè)SAP基因.分析冷、熱、鹽、水澇、干燥等傷害以及脫落酸和氧化脅迫對(duì)這些基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)所有的番茄SAP基因均對(duì)一種或幾種環(huán)境脅迫產(chǎn)生應(yīng)答[26].禾本科植物獐毛(Aeluropuslittoralis)是一種鹽漬土指示植物，具有很強(qiáng)的抗鹽、抗旱能力，也是抗性基因庫的重要物種, 其體內(nèi)AlSAP基因不僅受到鹽、滲透、熱和冷等多種非生物脅迫誘導(dǎo)，也受到脫落酸(ABA)和水楊酸(SA)的誘導(dǎo)[25].

高粱(SorghumbicolorL.Moench)是全世界種植的第五大禾谷類作物，具有C4植物高光效特征.作為糧食作物，高粱抗旱、耐鹽堿和貧瘠土壤，在干旱和半干旱農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有及其重要的位置，是一種具有發(fā)展?jié)摿Φ淖魑锖秃Y選抗逆基因的理想材料.除此之外，它也是重要的飼料植物和釀造業(yè)原料.最近高粱的基因組序列已公布，有利于加快高粱遺傳育種研究過程.

本課題組利用同源克隆技術(shù)得到了高粱SbSAP12(Sb07g021370)和SbSAP14(Sb01g005640)基因，對(duì)其進(jìn)行功能分析，以期為作物的分子育種提供理論上的指導(dǎo)，并為改良和提高干旱、半干旱及鹽堿地區(qū)植物的抗逆性提供候選基因.高粱SbSAP12基因全長(zhǎng)753 bp，編碼251個(gè)氨基酸;SbSAP14基因全長(zhǎng)543 bp，編碼181個(gè)氨基酸;SbSAP12和SbSAP14基因均無內(nèi)含子.氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，高粱SbSAP12蛋白與水稻SbSAP14蛋白[23]的同源性最高，達(dá)70%，與OsSAP1蛋白[20]同源性最低，為 37%;而高粱SbSAP14蛋白與水稻OsSAP18蛋白[23]具有71%的高同源性，與OsSAP16蛋白[23]同源性最低，為36%.經(jīng)RT-PCR試驗(yàn)初步研究發(fā)現(xiàn)，高粱SbSAP12和SbSAP14基因的表達(dá)受到干旱脅迫、鹽脅迫和植物激素ABA的誘導(dǎo)，功能可能與植物抗逆相關(guān)(結(jié)果待發(fā)表).

3 植物SAP基因的轉(zhuǎn)基因研究

目前，受到全球變暖的影響，環(huán)境脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)造成的壓力日益增加，培育具有抗逆能力的新品種變得越來越重要[28].轉(zhuǎn)基因技術(shù)為提高植物的抗非生物脅迫能力提供了一條行之有效的新途徑.對(duì)SAP基因家族轉(zhuǎn)基因研究的結(jié)果表明，SAP蛋白在植物抵御多種非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要的功能.如超表達(dá)OsiSAP1的轉(zhuǎn)基因煙草增強(qiáng)了對(duì)冷、干旱、高鹽等逆境的抗逆能力，無論在脅迫環(huán)境還是在恢復(fù)階段，轉(zhuǎn)基因植株在鮮質(zhì)量、葉綠素保留率、葉片發(fā)育和種子萌發(fā)率等方面均優(yōu)于野生型植株[20].在此之后，水稻中另外2個(gè)SAP基因取得了與OsiSAP1相似的研究結(jié)果.其中，OsiSAP8受到熱、冷、鹽、干燥、重金屬等多種脅迫誘導(dǎo)，超表達(dá)OsiSAP8的轉(zhuǎn)基因煙草和水稻植株，對(duì)鹽、干旱和冷脅迫的耐受力在種子萌發(fā)率、脅迫恢復(fù)后鮮質(zhì)量明顯提高；值得一提的是，超表達(dá)OsiSAP8的轉(zhuǎn)基因水稻在開花期對(duì)鹽和干旱具有抗性，而且與未受脅迫的轉(zhuǎn)基因植株相比產(chǎn)量上沒有損失[1].超表達(dá)ZFP177(OsiSAP9)的轉(zhuǎn)基因煙草植株對(duì)低溫和高溫脅迫的耐受力增強(qiáng)，但同時(shí)對(duì)鹽和干旱脅迫敏感性增強(qiáng)[22].另有研究發(fā)現(xiàn)，將克隆自獐毛的AlSAP基因轉(zhuǎn)化煙草，超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草植株表現(xiàn)出對(duì)鹽、干旱、熱和冷凍脅迫的耐受力增強(qiáng)，在高鹽和干旱條件下，野生型植株在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期就已經(jīng)死亡，轉(zhuǎn)基因植株能夠產(chǎn)生可育的種子；除此之外，還發(fā)現(xiàn)與脅迫有關(guān)的8個(gè)基因(CAT1，MnSOD,APX，osmotin，NtERD10A，NtERD10B，NtERD10C和NtERD10D)在轉(zhuǎn)基因煙草植株中表達(dá)水平比野生型中的高[25].本實(shí)驗(yàn)室將高粱SbSAP14基因異源轉(zhuǎn)化水稻，超表達(dá)水稻植株抗鹽脅迫能力明顯增強(qiáng)(結(jié)果待發(fā)表).SAP基因家族在植物應(yīng)答不同的非生物脅迫過程中發(fā)揮不同的功能，如OsiSAP1和OsiSAP8具有抗冷、干旱和高鹽的功能，ZFP177具有抗低溫和抗高溫的功能，而AlSAP則同時(shí)具有抗干旱、高鹽以及抵御熱脅迫和冷脅迫的功能.超表達(dá)該家族基因可以增強(qiáng)植物的抗逆性，表明SAP基因家族在抗性作物分子育種中可望成為具有應(yīng)用價(jià)值的有效基因.

4 展望

今后需要針對(duì)以下問題展開深入研究：(1)進(jìn)一步研究脅迫條件下植物SAP基因表達(dá)調(diào)控的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及基因的開關(guān)調(diào)控過程；(2)分離和克隆植物SAP基因的啟動(dòng)子，研究啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件與基因表達(dá)的關(guān)系；(3)提取和純化SAP蛋白，研究SAP蛋白的結(jié)構(gòu)和功能；(4)利用植物基因工程的手段將SAP基因轉(zhuǎn)入植物體中，從分子水平了解SAP蛋白在植物抗逆中的作用及其機(jī)制并培育抗逆品種和品系.總之，對(duì)植物SAP基因家族的全面了解，有利于全面認(rèn)識(shí)植物對(duì)逆境應(yīng)答和適應(yīng)的生理生化及分子機(jī)制，為利用分子育種技術(shù)開發(fā)抗逆新品種奠定理論基礎(chǔ).

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