王一曉 王慧芳 侯亞薇 翟春濤 田岳鳳
摘要? 目的:分析慢性疲勞綜合征動物模型種類、品系、性別、體質(zhì)量、造模方法、模型檢測指標的選擇,并分析模型在針灸研究中的應(yīng)用情況。方法:查閱近20年來中國知網(wǎng)(CNKI)和萬方數(shù)據(jù)庫中運用慢性疲勞綜合征動物模型的相關(guān)文獻,分析慢性疲勞綜合征模型動物種類品系、性別、體質(zhì)量、造模方法、檢測指標的選擇以及在針灸研究中的應(yīng)用情況。結(jié)果:慢性疲勞綜合征動物模型選用雄性SD大鼠,采用復(fù)合因素造模2~3周,造模后使用一般情況觀察、行為學(xué)檢測、臟器指數(shù)、組織形態(tài)學(xué)、分子生物生化指標來檢測模型成功。結(jié)論:總結(jié)了慢性疲勞綜合征模型動物種類、品系、性別、體質(zhì)量、造模方法、模型檢測指標,為慢性疲勞綜合征模型的建立和應(yīng)用以及在針灸方面的研究提供思路和參考。
關(guān)鍵詞? 慢性疲勞綜合征;動物模型;行為學(xué);針灸
doi:10.12102/j.issn.1672-1349.2024.11.034
慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome,CFS)是一種以極度疲勞為主要特征,且疲勞癥狀反復(fù)發(fā)作或維持6個月以上[1],排除其他疾病及藥物的因素,同時伴有低熱、疼痛、酸痛、體質(zhì)量下降等軀體癥狀,伴有記憶力下降、注意力減退、抑郁、焦慮等心理癥狀的疾病。調(diào)查顯示,近年來我國CFS患病率已經(jīng)達到12.54%,從2001年起一直處于上升狀態(tài),CFS已經(jīng)成為急需解決的公共安全衛(wèi)生問題[2]。該病由美國疾病控制中心在20世紀八九十年代制定并修改了其診斷標準,近年來該病受到的關(guān)注程度正在逐漸升高。然而CFS的發(fā)病機制和病因現(xiàn)代醫(yī)學(xué)并不能完全闡明[3],也尚無確定的診斷方法和治療手段[4],探討CFS的病因、機制及治療方案,需要建立更好的模擬現(xiàn)實中CFS病人癥狀和病理表現(xiàn)的CFS動物模型。本研究就國內(nèi)外有關(guān)CFS模型的有效文獻進行統(tǒng)計分析,并對近年來CFS模型在針灸研究中的應(yīng)用情況進行分析,為CFS的模型建立、評價以及CFS的機制研究、針灸的實驗研究提供模型參考。
基金項目? 山西省基礎(chǔ)研究計劃面上項目(No.202203021211224);山西中醫(yī)藥大學(xué)“臨床科研平臺建設(shè)”項目(No.2021PY-PT-02);山西中醫(yī)藥大學(xué)博士科研啟動基金項目(No.2023BK47);量子光學(xué)與定量子器件國家重點實驗室(山西大學(xué))開放課題(No.KF202307)
通訊作者? 翟春濤,E-mail:709966203@qq.com;田岳鳳,E-mail:tyfsx@163.com
引用信息? 王一曉,王慧芳,侯亞薇,等.慢性疲勞綜合征動物模型特點分析及在針灸研究中的應(yīng)用[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2024,22(11):2088-2093.
1? 資料與方法
1.1? CFS動物模型文獻檢索
通過中國知網(wǎng)(CNKI)的中國學(xué)術(shù)文獻網(wǎng)絡(luò)總庫進行文獻檢索,點擊“高級檢索”,在主題搜索中輸入“慢性疲勞綜合征”的同時,應(yīng)用“AND”主題搜索輸入“鼠”,設(shè)定時間為2003年1月1日—2023年1月1日,檢索主題為“慢性疲勞綜合征”和“鼠”的文獻;使用萬方數(shù)據(jù)庫,進行關(guān)鍵詞檢索,分別輸入“慢性疲勞綜合征”和“鼠”進行檢索同時段的相關(guān)文獻。
文獻納入標準:1)在正式期刊中發(fā)表的研究性文章(剔除綜述、學(xué)位論文、會議文獻);2)實驗中至少設(shè)計有對照組和模型組;3)所使用動物的品系、性別、體質(zhì)量信息描述清楚,造模要素描述完整。CNKI獲得CFS相關(guān)文獻共227篇,其中有效文獻142篇;萬方數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)文獻273篇,其中有效文獻157篇,去除兩個數(shù)據(jù)庫相同文獻和同一課題組同一次實驗所發(fā)表的不同文章,最終得到有效文獻111篇。
1.2? 模型及相關(guān)檢測指標分析
采用Excel軟件建立表格,整理111篇有效文獻中的信息和數(shù)據(jù)。錄入實驗動物品系、性別、體質(zhì)量,造模方法、造模時間、檢測方法、檢測指標等信息,對CFS模型動物及相關(guān)測試指標進行分析,所有圖形采用GraphPad Prism 8.3軟件制作。
1.3? 統(tǒng)計學(xué)處理
通過統(tǒng)計各種數(shù)據(jù)相關(guān)的文獻數(shù)量并計算所占總文獻百分比,由Graphpad Prism 8.3軟件制圖。
2? 結(jié)? 果
2.1? CFS模型動物品種、品系、性別、體質(zhì)量的選擇
2.1.1? 動物品種品系選擇
CFS模型在鼠種類的選擇上主要是大鼠(87.39%),大鼠的使用品系主要是SD大鼠(占80.41%),少部分使用Wister大鼠(占19.59%)。少部分研究選用了小鼠(占12.61%),小鼠的使用品系主要是昆明小鼠,3篇研究選用了美國癌癥研究所(ICR)小鼠,2篇研究選用了BALB/c小鼠。詳見圖1。
2.1.2? 雌雄選擇
在動物性別的選擇上,80項(72.07%)實驗研究選擇了雄性動物,16項(14.41%)實驗研究對性別選擇沒有要求,12項(10.81%)實驗研究選擇雌性動物進行實驗,3項(2.70%)實驗研究雌雄不限。
2.1.3? 體質(zhì)量選擇
在動物的體質(zhì)量選擇方面,大部分實驗研究選擇(200±20)g體質(zhì)量的大鼠,少部分選擇(170±10)g體質(zhì)量的大鼠;小鼠的體質(zhì)量主要選擇(20±2)g。
2.2? 模型造模方法的選擇
CFS動物模型的建立分為免疫模型和應(yīng)激模型,免疫模型主要通過細菌誘導(dǎo)、聚肌胞(Poly l:C)誘導(dǎo)、腎上腺切除誘導(dǎo),細菌誘導(dǎo)致病機制并未證實,且時間、劑量等各種因素對實驗產(chǎn)生的影響難以控制,模型可復(fù)制性一般,穩(wěn)定性難以控制,不能成為目前主流造模方法;Poly l:C誘導(dǎo)不同實驗動物的實驗結(jié)果存在差異,所以模型尚且有爭議;腎上腺切除方法造模缺乏臨床病例參考,存在一定局限性[5]。目前沒有文獻選擇免疫模型。
而應(yīng)激模型主要是以物理方法造模為主,分為生理疲勞、心理疲勞和生理心理復(fù)合造模3種方法。應(yīng)激造模方法可重復(fù)性高,操作簡單,且造模過程與CFS疾病的形成過程非常相似,能很大程度上模擬CFS的形成,目前收集的文獻中用到的都是應(yīng)激造模方法。應(yīng)激模型中生理疲勞造模方法有游泳法和跑臺法,有10篇文獻選擇僅用游泳法造模,所有文獻均未采用跑臺法造模。心理疲勞造模方式有夾尾刺激法、慢性束縛法、懸吊法、電刺激法、睡眠剝奪法、腎上腺皮質(zhì)激素應(yīng)用-停藥法、醋酸氫化可的松注射液肌內(nèi)注射法。文獻分析中只有1篇文獻采用慢性束縛的方法造模。
應(yīng)激模型中最常用且有效的是生理和心理疲勞復(fù)合造模方法,納入的111篇文獻中100篇文獻采用復(fù)合應(yīng)激刺激造模方法,其中力竭游泳和慢性束縛復(fù)合的方法最為常用,為24篇(24%);其次是力竭游泳+剝奪睡眠,為12篇(12%);游泳+束縛+夾尾復(fù)合的方法也有所使用,為10篇(10%)。詳見表1。研究顯示,大部分研究中通常采用力竭游泳來作為主要造模方法,再選擇1~3種刺激方法來建立CFS模型。但要注意應(yīng)同時心理和生理雙重刺激,而非簡單的多種方法聯(lián)合[5]。
2.3? 造模天數(shù)選擇
造模時長的選擇會很大程度上影響模型的成功,通過文獻發(fā)現(xiàn),造模的時間為6~49 d,其中大部分以周為標準,使用最多的是2周,為30篇(27.03%),其次為3周[20篇(18.02%)]、4周[13篇(11.71%)]。詳見圖2。分析文獻發(fā)現(xiàn),造模時間過短,可能會出現(xiàn)模型建立不成功或模型只有部分成功的情況,對后續(xù)實驗和檢測產(chǎn)生很大影響;造模時間過長,可能會造成實驗資源浪費、實驗人員時間浪費。通過對數(shù)據(jù)的總結(jié),CFS模型的建立時間一般選擇2~3周。
2.4? 模型檢測指標
判斷CFS模型建立是否成功,可以通過觀察動物的行為學(xué)、臟器指數(shù)、組織形態(tài)學(xué)、分子生物、生化指標等變化。也可以探究模型動物具體變化的形態(tài)、器官、組織、分子等方面,為治療提供思路和途徑。
2.4.1? 狀態(tài)觀察
通過文獻得出,CFS模型動物體質(zhì)量、食水消耗明顯減少,毛發(fā)無光,糞便不成形且?。?],食欲減退、萎靡嗜睡和易激怒[7],毛發(fā)脫落并發(fā)黃、背部皮膚松弛、大便變干或變稀、精神不振、活動減少以及食欲下降[8]。
2.4.2? 行為學(xué)
通過文獻發(fā)現(xiàn),有72篇文獻運用行為學(xué)檢測,占64.86%。CFS是以疲勞為主要癥狀,適合各種對運動能力、抑郁狀態(tài)、探索能力的行為學(xué)檢測。經(jīng)統(tǒng)計,使用最多的是力竭游泳實驗(43次)、曠場實驗(42次)和懸尾實驗(31次)。詳見圖3。CFS動物力竭游泳時間比空白組明顯減少[7];曠場實驗直立次數(shù)、水平穿格次數(shù)[9]、中央路程[7]比空白組也明顯減少;懸尾實驗掙扎次數(shù)、完全不動時間[9]比空白組也明顯減少。Morris水迷宮實驗也有使用,但是針對的是模型動物的認知能力檢驗,CFS會導(dǎo)致認知能力下降,Morris水迷宮實驗?zāi)P蛣游锉瓤瞻讓φ战M動物穿越原水上平臺次數(shù)明顯減少,潛伏期明顯延長[10]。行為學(xué)檢測一般是2種、3種方法聯(lián)合使用,最常用的是力竭游泳實驗和曠場實驗聯(lián)用(11次),其次是力竭游泳實驗、曠場實驗、懸尾實驗聯(lián)用(9次),力竭游泳實驗、懸尾實驗聯(lián)用也有使用(6次)。如果實驗條件允許,力竭游泳實驗、曠場實驗、懸尾實驗3種行為學(xué)檢測聯(lián)合使用,實驗的準確性、可信度會更高。若檢測認知能力是否變化,可加用Morris水迷宮實驗。
2.4.3? 臟器指數(shù)
基于文獻數(shù)據(jù),CFS模型對臟器指數(shù)的檢測有脾臟指數(shù)(8次)、胸腺指數(shù)(4次)、下丘腦(1次)、垂體(1次)、腎上腺(1次)臟器指數(shù)。CFS模型組脾臟指數(shù)明顯降低[11]。CFS模型組胸腺指數(shù)低于正常組(P<0.05)[12]。CFS模型組下丘腦、垂體、腎上腺臟器指數(shù)高于正常組[13]。
2.4.4? 組織形態(tài)學(xué)
組織形態(tài)的改變通常選用蘇木精-伊紅(HE)染色法來觀察。觀察CFS模型動物造模后海馬組織形態(tài)學(xué)變化,模型組海馬區(qū)神經(jīng)細胞呈現(xiàn)不整齊排列,細胞失去正常形態(tài),胞質(zhì)染色不整齊,胞核固縮,炎性細胞和凋亡小體數(shù)目增加[10]。觀察造模后海馬神經(jīng)元組織形態(tài)學(xué)變化,模型組海馬神經(jīng)元呈現(xiàn)不整齊排列,細胞間隙擴大明顯,神經(jīng)元部分壞死,神經(jīng)元核結(jié)構(gòu)不清晰數(shù)目增多,核仁模糊,胞質(zhì)濃縮染色加深,尼氏體消失,神經(jīng)纖維互相纏繞[14]。觀察海馬組織CA1區(qū)、CA3區(qū)、DG區(qū)細胞形態(tài),發(fā)現(xiàn)海馬CA1區(qū)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷不明顯;CA3區(qū)、DG區(qū)大多數(shù)細胞明顯受損,胞核固縮、細胞染色深且形狀不均勻,看不到細胞膜、細胞核等細胞基本結(jié)構(gòu)[15]。觀察下丘腦組織形態(tài)學(xué)變化,下丘腦區(qū)神經(jīng)細胞呈不整齊排列,細胞失去正常形態(tài),胞質(zhì)胞核染色模糊;膠質(zhì)細胞數(shù)目稍增多,凋亡小體和炎癥細胞數(shù)目增加,神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)松散[16]。觀察結(jié)腸形態(tài)學(xué),CFS模型大鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)失常,黏膜層水腫,炎癥細胞增多;杯狀細胞萎縮,排列松散混亂;黏膜下層及肌層可見炎癥細胞增多[17]。觀察股四頭肌組織形態(tài)學(xué)變化,模型組較空白組細胞間隙變小,部分肌纖維胞質(zhì)染色不均勻,胞核縮小,部分可見炎癥細胞增多[9]。觀察脾臟組織形態(tài)學(xué)變化,模型組脾臟組織紅髓、白髓縮小,所占比例減少。脾小梁數(shù)目縮減,體積縮小,排列混亂。中央動脈玻璃樣變,管壁加厚變硬[18]。
除了HE染色法,也有文獻直接在透射電鏡下觀察,模型組大鼠海馬神經(jīng)元胞體縮小,細胞膜出現(xiàn)褶皺,細胞核形狀改變,核異染色質(zhì)變多,部分核膜破裂,核周間隙變大,部分細胞膜內(nèi)陷,細胞質(zhì)空亮區(qū)增多[19]。
2.4.5? 分子生物、生化指標
檢測CFS模型動物的一系列分子生物、生化變化,最主要的檢測方法是免疫熒光法(immuno-fluorescent staining,IF)、蛋白免疫印跡法(Western Blot,WB)、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)法(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、酶聯(lián)免疫吸附法(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)等。文獻表明,炎癥細胞因子、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、氧化應(yīng)激標志物、基因及蛋白通路的檢測最為常見。炎性細胞因子生物學(xué)活性明顯,有助于協(xié)調(diào)機體對感染的反應(yīng),炎性細胞因子可以反映機體受各種外界刺激的程度;激素能夠調(diào)整機體生理活動,能促進或減慢體內(nèi)已有的代謝,激素起著信使作用,也能反映機體的各種變化;神經(jīng)遞質(zhì)是一種化學(xué)信使,在神經(jīng)元和整個身體的靶細胞之間攜帶、促進和平衡信號,但也可能受到疾病、藥物甚至其他化學(xué)信使的影響,也可以作為一種反映疾病的指標。其他如轉(zhuǎn)化生長因子、免疫球蛋白、細胞活性、疲勞指標、氨基酸等檢測也有使用,詳見表2。
2.5? CFS模型在針灸研究中的應(yīng)用
目前CFS的病因和機制尚未研究透徹,沒有治療的特定藥和高效藥,導(dǎo)致藥物的治療效果不明顯。而中醫(yī)針灸療法對其治療效果明顯,本研究收集了近5年來CFS模型在針灸研究中的應(yīng)用情況。
2.5.1? CFS模型在針刺研究中的應(yīng)用
針刺可以改善CFS模型動物的認知能力。馮楚文等[10]采用強迫負重游泳和慢性應(yīng)激刺激建立CFS模型,模型建立后電針百會、情感Ⅰ區(qū)、感覺區(qū)(雙側(cè))15 d,發(fā)現(xiàn)電針治療組Morris水迷宮穿越原平臺次數(shù)增加,海馬神經(jīng)細胞形態(tài)改善,核因子κB(NF-κB)蛋白表達下調(diào),CFS模型大鼠疲勞狀態(tài)緩解,學(xué)習(xí)記憶力、認知功能得到恢復(fù)。劉長征等[14]建立CFS模型的方法是懸吊、力竭游泳聯(lián)合,并針刺相關(guān)穴位12 d,發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)神經(jīng)元組織受損得到明顯改善,跳臺試驗、Morris水迷宮實驗結(jié)果和組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示,針刺能改善CFS的癥狀尤其是認知功能。水玲等[20-21]采用負重力竭游泳法建立模型,并用蒙醫(yī)溫針針刺頂會穴、心穴,溫針組海馬IL-1β、IL-6、TNF-α及iNOS含量明顯降低,海馬Caspase-3蛋白表達明顯降低,提示溫針灸能夠減少誘導(dǎo)細胞凋亡,進而來改善CFS認知功能障礙。
針刺能夠?qū)FS整體調(diào)節(jié)。謝亞娜等[22]采用強迫游泳、慢性束縛和飲食控制建立模型,并同時電針足三里、合谷、太沖穴位21 d,發(fā)現(xiàn)治療組高架十字迷宮實驗結(jié)果優(yōu)于模型組,血清TNF-α、脂多糖含量低于模型組,但腸道菌群變化相比模型組改變不明顯。得出電針治療CFS可能與下調(diào)血清TNF-α、脂多糖含量,抑制炎癥反應(yīng)有關(guān),尚不能認為與調(diào)節(jié)腸道菌群門水平豐度相關(guān)。楊燕等[23]采用強迫游泳和慢性復(fù)合應(yīng)激刺激方式建立模型,電針大鼠百會、寧神、雙側(cè)感覺區(qū)14 d,發(fā)現(xiàn)血清IL-10、TNF-α明顯降低,IFN-γ明顯升高,說明針刺對CFS癥狀有一定的改善和整體調(diào)節(jié)作用。楊添淞等[24]采用力竭游泳和慢性復(fù)合應(yīng)激刺激建立模型,模型成功后電針大鼠百會和頭部感覺區(qū)15 d,發(fā)現(xiàn)電針后大鼠相關(guān)腦區(qū)NF-κB p65、COX-2細胞表達比模型組明顯減少,得出電針可以通過改善CFS大鼠炎性反應(yīng)來緩解疲勞癥狀。錢桂鳳等[25]采用慢性束縛和強制冷水游泳建立模型,火針雙側(cè)膏肓穴7 d,血清SOD和GSH-Px明顯升高,血清MDA明顯降低。發(fā)現(xiàn)火針可以通過增強模型大鼠抗氧化能力來緩解疲勞癥狀。周鵬等[26-27]采用慢性復(fù)合應(yīng)激法建立模型,電針心俞、肺俞、脾俞、肝俞、腎俞20 d,治療后血清ACTH、CORT明顯降低,下丘腦CRH mRNA明顯降低,血清IL-10明顯降低。說明電針背俞穴可以通過增強免疫功能來增加機體抗疲勞能力,促進機體恢復(fù)。董佳梓等[28]強迫負重游泳、慢性束縛和睡眠剝奪聯(lián)合法建立CFS模型,電針足三里10 d,結(jié)果顯示,電針能夠調(diào)節(jié)線粒體氧化應(yīng)激反應(yīng),通過使機體能量代謝恢復(fù)正常來治療CFS。王德龍等[29]采用慢性復(fù)合應(yīng)激法建立模型,并電針額區(qū)、頂區(qū)和百會穴15 d,發(fā)現(xiàn)電針組海馬和下丘腦中TGF-β1水平明顯低于模型組。說明針刺可以改善CFS。
2.5.2? CFS模型在艾灸研究中的應(yīng)用
李超然等[17]采用跑臺、束縛、睡眠干擾、擁擠的復(fù)合應(yīng)激方法建立模型,A組溫和灸神闕、關(guān)元35 d,B組溫和灸雙側(cè)足三里35 d,結(jié)腸組織ZO-1和Occludin基因表達量在兩個治療組干預(yù)后都明顯升高。說明艾灸可能是通過修復(fù)損傷的腸黏膜屏障,抑制炎癥反應(yīng)來保護神經(jīng)。劉長征等[30]采用懸吊、力竭游泳聯(lián)合建立模型,并施灸神闕穴15 d,發(fā)現(xiàn)治療能明顯提高力竭游泳時間,明顯降低BUN、BLA,改善模型大鼠運動能力和疲勞指標。徐小珊等[31]采用慢性束縛和力竭游泳交替進行21 d造模,造模成功后對足三里等穴位隔逍遙散藥餅灸10 d,發(fā)現(xiàn)治療明顯提高大鼠曠場實驗跨格數(shù)和站立次數(shù)、懸尾實驗掙扎次數(shù),縮短懸尾實驗靜止不動時間,降低血清BLA、CXC趨化因子配體9(CXCL9)及β-EP含量,升高股四頭肌組織中p-AMPK、PGC-1α表達,改善疲勞癥狀,恢復(fù)精神體力。
3? 小? 結(jié)
CFS病因病機難以闡明,除了主癥疲勞外,還伴有記憶力降低、注意力減退、焦慮、疼痛、酸痛、體質(zhì)量下降等癥狀,研究者們根據(jù)CFS的癥狀和表現(xiàn)建立CFS動物模型,本研究總結(jié)了CFS模型的特點,包括動物種類、品系、性別、體質(zhì)量,造模方法、模型檢測指標等,為以后的CFS研究者提供思路和參考。1)CFS模型最常用品系的是SD大鼠,最常用的性別是雄性(沒有性別方面的對比或者針對雌性的研究)。2)造模方法方面最好選擇復(fù)合因素造模,采用力竭游泳來作為主要的造模方法,再選擇1~3種刺激方法來建立CFS模型,比如慢性束縛、睡眠剝奪、懸吊等,這樣可以更好的模擬生理和心理因素。造模周期常選2~3周,既不會造模不完全成功,也不會浪費資源和時間。3)對CFS模型的檢測主要是采用行為學(xué)方法,合理的方法是力竭游泳實驗、曠場實驗、懸尾實驗3種行為學(xué)檢測聯(lián)合使用,模型成功的檢測會更準確。也可采用臟器指數(shù)、組織形態(tài)學(xué)、分子指標來檢測。
綜上所述,通過統(tǒng)計分析CFS模型的動物品種、品系、性別、體質(zhì)量、造模方式、造模時間、行為學(xué)檢測方法、分子生物生化檢測方法和近5年CFS模型在針灸方面研究,以期為CFS模型動物實驗研究和針灸方面研究提供模型方案參考。
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(收稿日期:2023-04-11)
(本文編輯郭懷?。?/p>