作者簡介：吳冰（1986-），女，碩士研究生，研究方向：水產養(yǎng)殖。E-mail：283863746@qq.com。

通訊作者：許建和（1976-），男，博士，碩士生導師，研究方向：水產動物營養(yǎng)與飼料。E-mail：jianhexu218@163.com。

DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2024.05.004

摘" 要：為研究丁香酚慢性麻醉對紅鯽（Carassius auratus）血液生理及肝臟中應激基因hsp70和hsp90mRNA相對表達量的影響，試驗設置丁香酚處理組和對照組，用15 mg/L丁香酚處理平均體質量（61.9±3.66）g紅鯽12 h。試驗結果表明，經12 h麻醉后，試驗組紅鯽除游動變緩外，其它行為表現(xiàn)正常，未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；麻醉組紅鯽血液中皮質醇含量、乳酸脫氫酶活力顯著下降，而血糖和K+、Na+濃度卻顯著上升?；蚨拷Y果顯示，麻醉組紅鯽肝臟中hsp70和hsp90mRNA相對表達量顯著高于對照組。綜上所述，15 mg/L丁香酚處理12 h內對紅鯽未造成明顯損傷，可用于其?；钸\輸。

關鍵詞：紅鯽（Carassius auratus）；丁香酚；血液生理；hsp70; hsp90

漁用麻醉劑因其成本低、使用方便，對魚類有著良好的鎮(zhèn)靜作用，可以有效減少魚類在運輸過程中應激反應和新陳代謝，保證鮮活水產品的品質，從而得到了廣泛應用。近年來在市場上魚類用的麻醉劑被廣泛應用于保持魚的生命活力，種類繁多，已經開發(fā)出了30多種不同的魚類用麻醉劑，其中較為常用的有丁香酚、MS-222、CO2和苯佐卡因等。

丁香酚是丁香油的主要成分，通過蒸餾丁香樹的花、莖和葉子提取而成的天然麻醉劑。丁香酚由于其高效、安全、價格低廉，且不會誘發(fā)魚體產生有毒及突變物質，而被廣泛應用于活魚運輸、產卵和手術等養(yǎng)殖過程和科學試驗中。目前國際上澳大利亞、日本等國已經公開批準了丁香油/酚作為水產麻醉劑合法使用，國內關于漁用麻醉劑立法還是空白。丁香酚用于魚類麻醉和活體運輸目前已有較多報道。研究發(fā)現(xiàn)丁香酚可以降低魚體新陳代謝，減少應激反應，保護肝臟健康，提高機體免疫力。李寧等發(fā)現(xiàn)低劑量丁香酚可顯著降低大口黑鱸運輸過程中的應激反應。Liu等用25～30 mg/L丁香酚對黃顙魚進行12 h模擬運輸后未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。但丁香酚具有揮發(fā)性，在長距離麻醉運輸過程中其效用可能會降低。

紅鯽又被稱為金鯽魚或草金魚，由鯽（Carassius auratus）選育，屬鯉形目，是我國重要的觀賞魚類和魚類雜交育種親本來源。紅鯽在實際養(yǎng)殖生產過程中經常需要進行長距離活體運輸，運輸過程中由于捕撈、運輸時間、運輸量等應激脅迫，極易造成紅鯽受傷甚至死亡，導致經濟損失。如何采取適當措施，降低紅鯽運輸應激反應，改善動物福利，提高運輸成活率目前已受到越來越多的關注。本文研究了丁香酚慢性麻醉對紅鯽血液中皮質醇、葡萄糖（GLU）；乙酰膽堿（AChE）、溶菌酶（LZM）、乳酸脫氫酶（LDH）等酶活力；K+、Na+、Ca+、尿素氮（BUN）等無機物含量以及肝臟中hsp70和hsp90mRNA相對表達量的影響，為丁香酚慢性麻醉用于紅鯽活魚運輸?shù)陌踩蕴峁┰囼炓罁?/p>

1" 材料及方法

1.1" 試驗材料

試驗魚購自連云港市海州區(qū)金龍魚水族館，平均體質量（61.9±3.66）g。丁香酚購于國藥企業(yè)，含量 ≥98.5％，使用時先按V（丁香酚）∶V（酒精）=1∶9溶于酒精，靜置10 min后再溶于水。

1.2" 試驗設計及樣品采集

試驗設置15 mg/L丁香酚麻醉組，一組加無水乙醇為對照組。試驗開始前停食24 h，挑選30尾健康個體，分成2組，5尾魚/組，每組3個重復。在塑料養(yǎng)殖箱中先加入30 L曝氣的淡水，用丁香酚母液將水體丁香酚濃度調成15 mg/L，然后放入試驗魚，水溫在25～28 ℃，溶氧均大于5 mg/L。每隔0、1、2、4、6、8、10、12 h觀察紅鯽在麻醉狀態(tài)下的行為特征。試驗開始和12 h后時用肝素鈉（2 800 U/mL）潤洗后的2 mL注射器從尾靜脈取血，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，收集上清液，保存于-80 ℃。采血后解剖，取魚體肝臟，凍存于-80 ℃用于基因定量。

1.3" 血液生化指標測定

血液生化指標測定用南京建成生物工程試劑盒。取-80 ℃保存的血漿，用酶標法測定皮質醇濃度，葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖含量，比色法測定乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）、溶菌酶（Lysozyme，LZM）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活力，以及K+、Na+、Ca2+離子濃度和尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）濃度。

1.4" hsp70和hsp90mRNA表達定量

1.4.1" RNA提取及反轉錄" 參照動物組織總RNA提取試劑盒說明書（TIANGEN，北京）提取總RNA，用超微量紫外分光光度計確定RNA濃度及OD值，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。參照反轉錄試劑盒說明書（TIANGEN，北京）測定反轉錄。

1.4.2" 引物設計與合成" 紅鯽與鯽具有高同源性，根據NCBI公布的鯽hsp70（GenBank序列號為AB092839.2）、hsp90 （GenBank序列號為KT985291.1）和β-actin mRNA全序列（GenBank序列號為HQ267516.1），使用Primer 5.0設計q-RT-PCR引物：hsp70F，5'-ATGGAGGGAAGCCGAAAG-3'；hsp70R，5'-TGAAATAGGCAGGAACTGTGAT-3'；hsp90F，5'-GGCGTTGTGGACTCTGATGA-3'；hsp90R，5'-GGTGCCAAACTCCTTCCAGA-3'；β-actin F，5'-ATGCGGAAACTGGAAAGG-3'；β-actin R，5'-GAGGGCAGAGTGGTAGACG-3'。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4.3" 熒光定量PCR檢測mRNA表達差異" 采用SYBR Green（QIAGEN，上海）染料法，參照熒光定量說明書進行。然后通過熒光定量PCR檢測引物的特異性，挑選條帶單一且特異性好的引物進行熒光定量PCR實驗。以不同濃度下紅鯽肝臟的cDNA為未知樣品模板，以β-actin為內參基因，檢測hsp70和hsp70基因的相對表達量。熒光定量PCR反應體系：SYBY Green Master （Mix） 10 μL；QN ROX Reference Dye 2 μL；上下游引物各0.6 μL；無菌水5.8 μL；cDNA模板1 μL，每個樣品設置3個平行。反應程序：95 ℃、2 min；95 ℃、5 s；60 ℃、10 s，共40個循環(huán)?；虻南鄬Ρ磉_量以2-ΔΔCt方法計算。

1.5" 數(shù)據統(tǒng)計分析

所有數(shù)據均用平均值±標準差（Mean±SD）表示，經SPSS 22.0軟件進行數(shù)據處理。試驗數(shù)據經方差同質性檢驗后，使用單因方差分析（One-way ANOVA）進行差異顯著性比較，顯著性水平為P＜0.05。

2" 結果

2.1" 丁香酚不同麻醉時間對紅鯽行為狀況的影響

丁香酚不同麻醉時間對紅鯽行為狀況的影響結果見表1。試驗開始時（0 h）， 對照組和試驗組魚體運動活躍，應激反應劇烈，鰓蓋張合有力；經15 mg/L丁香酚麻醉處理1 h后，魚體呈抖動式游動，少數(shù)魚體呈側翻趨勢，鰓蓋張合力度正常；2 h后，多數(shù)魚體有側翻現(xiàn)象，鰓蓋張合無力且無規(guī)律；4 h后，出現(xiàn)群聚現(xiàn)象，多數(shù)魚體側翻，存在浮頭現(xiàn)象；麻醉6 h后，多數(shù)魚體鰓蓋張合無力但是有規(guī)律，少部分有浮頭現(xiàn)象；8 h后，浮頭現(xiàn)象消失，大多數(shù)魚體成群在水箱底部，鰓蓋張合無力但有規(guī)律，無浮頭、側翻、游動現(xiàn)象，外界環(huán)境變化時無較大應激反應。12 h后對照組和試驗組均未出現(xiàn)魚體死亡現(xiàn)象。

2.2" 丁香酚慢性麻醉對紅鯽血液生化指標影響

丁香酚麻醉對紅鯽血液中皮質醇、葡萄糖和無機物濃度影響見表2。經12 h麻醉后，紅鯽血液中皮質醇含量顯著降低（P＜0.05）；葡萄糖、K+和Na+的含量顯著高于對照組（Plt;0.05），Ca2+和尿素氮BUN濃度兩組間無顯著差異（P＞0.05）。

與對照組相比，丁香酚處理12 h后的紅鯽血液中乳酸脫氫酶活性顯著下降（P＜0.05）;而乙酰膽堿酯酶活力和溶菌酶活力均沒有顯著性差異（表3）。

2.3" 丁香酚麻醉對紅鯽肝臟中hsp70和hsp90mRNA相對表達量影響

紅鯽經15 mg/L丁香酚麻醉12 h后，肝臟中hsp70和hsp90mRNA相對表達量顯著增加，且均明顯高于對照組（圖1）。但hsp90相對表達量增加更明顯，麻醉組相對表達量大約是對照組的7倍。

組間上標字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。圖1" 丁香酚麻醉對紅鯽肝臟中hsp70和hsp90mRNA相對表達量的影響

3" 討論

3.1" 丁香酚慢性麻醉對紅鯽行為影響

在活魚運輸過程中，長時間路途的劇烈晃動會導致魚體產生較強烈的應激反應，甚至會出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象。麻醉劑能有效地解決這一問題，麻醉劑通過減緩緊張，可以使魚體運動量和生理變化變小，處于一種相對鎮(zhèn)靜的狀態(tài)，從而降低長時間路途晃動產生的碰撞損傷。本試驗將紅鯽置于15 mg/L的丁香酚時，魚體均能達到相對鎮(zhèn)靜的狀態(tài)，均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，說明丁香酚具有持久性和安全性。

3.2" 丁香酚麻醉對紅鯽血液生化指標影響

當魚類在受到麻醉等脅迫時，會刺激其下丘腦-垂體-腎間軸，合成并釋放頭腎細胞皮質醇激素。所以魚類的應激程度可以用血液中皮質醇的濃度來衡量。本試驗條件下，運輸12 h后的麻醉組中皮質醇的濃度顯著低于對照組，表明在紅鯽運輸12 h后，丁香酚可以緩解魚體的應激反應，在許氏平鲉和歐洲鱸的報道中有類似結果。血液中的葡萄糖受攝食狀態(tài)和環(huán)境條件等因素的干擾，應激過程中血糖增加，通常是由于動物遭受的突發(fā)刺激需要更多充足的能量來應對。在本試驗中，12 h后的丁香酚麻醉組中的葡萄糖含量顯著高于對照組（P＜0.05），這是由于麻醉應激能夠加快糖原分解的速率和代謝消耗的不平衡。

硬骨魚類血清中Na+、Ca2+、K+的正常范圍分別是120～200 mmol/L、5 mmol/L以下、15 mmol/L。在本試驗中，紅鯽血清中離子水平均處于上述范圍中。在正常范圍內離子水平的升高，不但能提高及加快魚體代謝速率和生長，而且對魚體吸收營養(yǎng)具有改良狀態(tài)。紅鯽在模擬運輸12 h后，麻醉組血清中K+和Na+濃度顯著上升，而Ca2+濃度無顯著差異，與MS-222對羅非魚的研究結果相似。麻醉劑的使用會對魚體腎臟功能有影響，通常用血液中尿素氮的含量作為麻醉劑對腎功能影響的判斷依據。有研究表明，MS-222可以降低俄羅斯鱘幼魚中尿素氮的含量，但本試驗的麻醉組與對照組無顯著性差異，這可能是由于丁香酚濃度太低或者個體間的差異所導致。

乙酰膽堿是中樞膽堿能系統(tǒng)中重要的神經遞質之一，其活性的降低會導致魚類的呼吸和運動紊亂。溶菌酶是一種堿性酶，能夠水解細菌的細胞壁，并使之溶解，在體內起到對機體的防御作用，可作為免疫指標。本試驗的結果表明，麻醉組中乙酰膽堿和溶菌酶的活性與對照組均無顯著性差異，表明15 mg/L的丁香酚麻醉紅鯽12 h后不影響其運動和免疫等功能。王彩霞在加州鱸中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。乳酸脫氫酶是機體參與能量代謝的一種酶，能夠催化丙酮酸和乳酸的相互轉化。有研究表明，魚在缺氧或者劇烈運動后，體內的乳酸含量會迅速升高，因此乳酸脫氫酶的活性也升高。但是在本試驗中，運輸12 h后麻醉組中的乳酸脫氫酶活性顯著低于對照組（P＜0.05），這可能是因為丁香酚能夠降低魚類應激反應，使其處于一種鎮(zhèn)靜狀態(tài)，從而導致乳酸脫氫酶的活性降低。

3.3" 丁香酚麻醉對肝臟中hsp70和hsp90mRNA相對表達量的影響

熱休克蛋白（HSPs）是一類重要的非特異性細胞保護蛋白，通常在機體受到應激源刺激后產生，它可增加機體細胞蛋白質結構的穩(wěn)定性、提升機體免疫水平。有報道表明血液中皮質醇水平下降可誘導莫桑比克羅非魚（Oreochromis mossambicu）肝臟中熱激蛋白基因上調表達。本研究中紅鯽經丁香酚麻醉后血液中皮質醇水平明顯下降，而肝臟中熱休克蛋白基因表達量明顯增加，這表明丁香酚麻醉可通過降低魚體血液中皮質醇含量，來誘導肝臟增加hsp70和hsp90mRNA表達量，為魚體提供保護作用。相似的結果在高體鰤和斜帶髭鯛中也有報道。但本研究中紅鯽經丁香酚麻醉后肝臟hsp90相對表達量增加較hsp70更顯著，這與Liu等在黃顙魚中的研究結果剛好相反，推測原因可能在紅鯽體內hsp90比hsp70更易被誘導表達，是其應對應激脅迫的主要熱休克蛋白。相似結果在Salmo salar亦有報道，表明麻醉劑誘導魚體熱休克蛋白基因家族表達方式存在種間差異。

4" 結論

在紅鯽模擬運輸過程中，用15 mg/L的丁香酚進行麻醉，可顯著降低魚體應激反應，經12 h模擬運輸后，未發(fā)現(xiàn)對魚體行為和血液生理造成不良影響，可用于紅鯽長時間活體運輸。

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The effects of chronic eugenol anesthesia on the blood physiology and the expression levels of hsp70 and hsp90 mRNA in the liver of red crucian carp

WU Bing， DONG Xiujin， XU Yili， XU Jianhe

（Jiangsu Ocean University， School of Marine Science and Fisheries， Lianyungang 222005， China）

Abstract：To investigate the effects of chronic anesthesia with eugenol on the blood physiology and expression of stress genes hsp70 and hsp90 in the liver of red crucian carp（Carassius auratus）， in experimental group， red crucian carps in an average body weight of （61.9 ± 3.66） g were exposed to 15 mg/L eugenol for 12 h and fish without eugenol treatment was used as control group. The experimental results showed that after 12 h anesthesia， no dead fish were observed and all fish exhibited normal behavior except for slower swimming. Compared with the control group， the blood cortisol content and lactate dehydrogenase activity of the fish subjected to eugenol treatment significantly decreased， while blood glucose content and K+， Na+ concentrations significantly increased. The gene expression quantification results showed that the relative expression levels of hsp70 and hsp90 in the liver of fish in the eugenol treatment group were significantly higher than those in the control group. In summary， 15 mg/L eugenol treatment did not cause significant damage to red crucian carp within 12 h and can be used for its live transportation.

Key words： red crucian carp（Carassius auratus）; eugenol; blood physiology; hsp70; hsp90

（收稿日期：2024-04-07）