基金項目：海南省自然科學(xué)基金項目（322RC766）；湛江市科技計劃項目（2022A01050）；中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費專項資金（1630102023007）；中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院公益項目（1630052019012）。

作者簡介：張秀霞（1982-），女，助理研究員，研究方向：海洋生物資源調(diào)查與評估， 水產(chǎn)健康養(yǎng)殖。E-mail： zhangxiuxia@itbb.org.cn。

通訊作者：鄧曉東（1969-），男，研究員，研究方向：藻類生理生化。E-mail： dengxiaodong@itbb.org.cn。

DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2024.05.003

摘" 要：為篩選適應(yīng)熱帶海水養(yǎng)殖環(huán)境并能高效凈化養(yǎng)殖廢水的優(yōu)勢藻種，分析比較五種微藻去除化學(xué)需氧量（COD）、總氮（TN）、總磷（TP）和亞硝酸鹽氮（NO-2-N）的能力。選擇海南本土篩選的藻種小球藻（Chlorella sp.）、微擬球藻（Nannochloropsis sp.）、菱形藻（Nitzschia sp.）、牟氏角毛藻（Chaetoceros sp.）和外購藻種四尾柵藻（Scenedesmus sp.），在以對蝦養(yǎng)殖水為底液配制的富營養(yǎng)化養(yǎng)殖廢水中培養(yǎng)6 d。結(jié)果表明，綠藻在養(yǎng)殖廢水中生長速率快，硅藻生長速率慢，小球藻在富營養(yǎng)化養(yǎng)殖廢水中生長最好，OD680值、葉綠素a含量和細胞密度均最高，并與其他藻種有顯著性差異。5種藻種中COD去除效果好的藻種是菱形藻和小球藻，去除率分別為71.6%、70.4%；總氮去除效果好的藻種是菱形藻、小球藻、牟氏角毛藻和微擬球藻，去除率分別為50.36%、47.96%、46.41%、42.79%；總磷去除效果好的藻種是菱形藻，去除率為71.43%；亞硝酸鹽氮去除效果好的藻種是菱形藻、四尾柵藻和牟氏角毛藻，2 d去除率分別為96.60%、95.63%和95.40%；綜合所有指標，菱形藻對養(yǎng)殖廢水綜合凈化效果最好。

關(guān)鍵詞：微藻；養(yǎng)殖廢水；凈化；總氮；總磷

為了滿足市場需求，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)越來越向高密度、規(guī)?；?、集約化方向發(fā)展，在這種養(yǎng)殖模式下，形成了高投入量和高生物負載量的水產(chǎn)養(yǎng)殖方式，使得水產(chǎn)養(yǎng)殖密度遠大于水體環(huán)境可承載容量。水產(chǎn)動物攝食后的殘餌、排泄的糞便以及養(yǎng)殖過程中施用的各類藥物殘留在水體中并逐漸富集，引起養(yǎng)殖水體化學(xué)需氧量（COD）、總氮（TN）、總磷（TP）等污染水平嚴重超標，最終使得養(yǎng)殖水體進入富營養(yǎng)化狀態(tài)。微藻亦稱浮游植物，能夠以光照為能源，利用水中的氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)進行光合作用，合成自身生長所需有機物質(zhì)，進而降低水中的氮、磷和COD。

微藻在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用主要集中在幾個方面：作為生物餌料、作為飼料添加劑、養(yǎng)殖水質(zhì)調(diào)控、水產(chǎn)動物病害防控及新型水產(chǎn)疫苗研發(fā)。利用微藻處理污水之前已有大量報道，王昱等利用小球藻來凈化村鎮(zhèn)的生活污水，對污水中TP的去除率達92.22%，污水滅菌后小球藻對COD和NH+4-N去除率分別達93.41%和86.21%。李興涵等也探索了幾種微藻處理天然橡膠加工廢水的處理效果，發(fā)現(xiàn)廢水中TN、TP、COD濃度越高，微藻對其去除效果越好。大量的研究表明微藻應(yīng)用于污水處理，能有效降低COD、TN、TP。綠藻在養(yǎng)殖廢水凈化中的使用也有相應(yīng)研究，劉慶輝等研究表明，小球藻類和柵藻類在養(yǎng)殖尾水中的氮磷吸收效果較好，氮磷去除率達85%以上；商洪國等利用鈍頂螺旋藻結(jié)合膜光合反應(yīng)器實現(xiàn)了海水養(yǎng)殖循環(huán)水高效的碳、氮、磷同步去除，無亞硝酸鹽累積；但是綠藻的其他藻種和硅藻在養(yǎng)殖廢水處理中的應(yīng)用研究不多，本試驗選取4種藻種為海南本土篩選的藻種，包含兩種綠藻兩種硅藻，評估其對養(yǎng)殖廢水的凈化效果，為進一步將微藻應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖提供數(shù)據(jù)參考。

1" 材料與方法

1.1" 材料

試驗用小球藻（Chlorella sp.）、微擬球藻（Nannochloropsis sp.）、菱形藻（Nitzschia sp.）、牟氏角毛藻（Chaetoceros sp.）均為本實驗室分離純化鑒定保存的藻種；四尾柵藻（Scenedesmus sp.）購于中國科學(xué)院淡水藻種庫（FACHB）。

1.2" 方法

1.2.1" 藻種培養(yǎng)" 小球藻用TAP培養(yǎng)基培養(yǎng)，微擬球藻、菱形藻、牟氏角毛藻用海水F/2培養(yǎng)基，四尾柵藻用BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)基按配方配制后121 ℃滅菌20 min，冷卻至室溫，藻種按20%的接種量接種。小球藻、微擬球藻、四尾柵藻放光照恒溫搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25 ℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min；菱形藻、牟氏角毛藻置于人工氣候箱培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25 ℃，光照時間24 h，每天早、中、晚各搖瓶一次。藻種培養(yǎng)一周后，離心收集藻泥各1 g，用30 mL培養(yǎng)基重新懸浮備用。

1.2.2" 富營養(yǎng)化養(yǎng)殖廢水配制" 飼料浸出液：用中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所自制對蝦飼料50 g加500 mL水，浸泡1 h，用雙層400目篩網(wǎng)過濾，121 ℃，滅菌20 min，備用。取對蝦養(yǎng)殖池塘水，加上飼料浸出液30 mL/L、氯化銨15 mg/L、尿素15 mg/L、磷酸二氫鉀5 mg/L、磷酸氫二鉀3 mg/L、亞硝酸鈉60 mg/L，配制成富營養(yǎng)化的養(yǎng)殖廢水，分裝至三角瓶中，每瓶加入400 mL，121 ℃滅菌20 min，備用。

1.2.3" 微藻在模擬養(yǎng)殖廢水中培養(yǎng)" 將藻種10 mL接種到350 mL滅菌模擬廢水中，每個藻種設(shè)三個重復(fù)，小球藻、微擬球藻、四尾柵藻放光照搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25 ℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min，光照時間24 h；菱形藻、牟氏角毛藻放光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25 ℃，光照時間24 h，早、中、晚人工各搖藻一次。每48 h取樣檢測一次，共培養(yǎng)6 d。

1.2.4" 微藻生物量的測定" 取各藻類培養(yǎng)液5 mL，檢測680 nm處的吸光值，同時用血球計數(shù)板進行細胞密度的計數(shù)。取各藻類培養(yǎng)液10 mL，6 000 r/min離心5 min，用生理鹽水重懸浮洗滌離心3次，棄上清液，用萃取液（丙酮∶無水乙醇=1∶1）重懸藻細胞沉淀，轉(zhuǎn)移至10 mL的容量瓶中并定容，室溫避光浸提24 h，每3 h進行顛倒混合。將萃取液轉(zhuǎn)入離心管中，10 000 r/min離心5 min，取上清液。以萃取液調(diào)零，在642.5 nm和665 nm 波長下測定樣液的吸光值。按下列公式計算葉綠素a含量。 葉綠素a含量（mg/L）=9.99A665-0.0867A642.5

1.2.5" 水質(zhì)指標測定" "取各藻類培養(yǎng)液50 mL，5 000 r/min離心5 min，用上清液稀釋后檢測水質(zhì)指標，各指標的檢測操作按試劑說明書的步驟進行，各水質(zhì)指標檢測儀器、試劑及方法見表1。

1.2.6" 統(tǒng)計分析" 結(jié)果為平均值±標準差（Mean±SD），數(shù)據(jù)利用SPSS 18.0進行單因素方差分析（One-way ANVOA），P＜0.05確認為差異性顯著。

2" 結(jié)果

2.1" 微藻在模擬富營養(yǎng)化養(yǎng)殖廢水中的生長情況

5種藻在富營養(yǎng)化養(yǎng)殖廢水中的OD680、細胞密度和葉綠素a含量見圖1—圖3。小球藻第6天OD680為0.518，細胞密度為108×106 CFU/mL，葉綠素a含量為2.462 mg/L，均在5種微藻中最高，顯著高于其它4種微藻（P＜0.05）。菱形藻第6天OD680為0.298，葉綠素a含量為0.898 mg/L，在5種微藻中最低，顯著低于其它4種微藻（P＜0.05）。四尾柵藻的細胞密度最低，為3.2×106 CFU/mL，顯著低于其它4種微藻（P＜0.05）。

同組圖柱上標不同字母表示差異顯著（Plt;0.05），下同。

2.2" 微藻對水質(zhì)指標的影響

2.2.1" COD去除效果" 如圖4和圖5所示，5種微藻均具有降低COD的作用，從第2天開始，各微藻組的COD已顯著低于對照組（P＜0.05）。在接種第6天，5種微藻的COD去除率由高到低分別為菱形藻、小球藻、微擬球藻、牟氏角毛藻、四尾柵藻。小球藻和菱形藻在第6天的COD去除效果最優(yōu)，COD分別從初始值的485.9 mg/L和489.21 mg/L降至138.00 mg/L和144.67 mg/L，去除率分別為71.6%和70.4%；四尾柵藻的COD去除率最低，為61.50%。

2.2.2" 總氮去除效果" 5種微藻對總氮的去除效果如圖6和圖7所示，5種微藻對養(yǎng)殖廢水中的總氮均具有去除作用，接種小球藻、菱形藻、牟氏角毛藻和微擬球藻的總氮含量均在第2天開始顯著低于對照組（P＜0.05），接種四尾柵藻的總氮含量在第4天開始顯著低于對照組（P＜0.05）。在接種的第6天，5種微藻的總氮去除率由高到低分別是小球藻、菱形藻、牟氏角毛藻、微擬球藻、四尾柵藻。四尾柵藻的第6天總氮去除率最低，為37.74%，顯著低于其它4種微藻（P＜0.05）；第6天總氮去除率最高為小球藻，為50.36%，總氮從初始的99.08 mg/L降至49.18 mg/L；在第6天時，除四尾柵藻以外的其它4種微藻種之間的總氮去除率沒有顯著性差異（P＞0.05）。

2.2.3" 總磷去除效果" 5種微藻對總磷的去除效果見圖8和圖9，5種微藻均能降低養(yǎng)殖廢水中的總磷，接種小球藻、微擬球藻、四尾柵藻的總磷含量在第2天開始顯著低于對照組（P＜0.05），接種菱形藻和牟氏角毛藻的總磷含量在第4天開始顯著低于對照組（P＜0.05）。接種的第6天，5種微藻的總磷去除率由高到低分別是菱形藻、牟氏角毛藻、小球藻、微擬球藻、四尾柵藻。小球藻在前4天的總磷去除量最大，到第6天時，菱形藻的總磷去除率最高，為72.45%，總磷從初始的20.25 mg/L降至5.79 mg/L，與其它4種微藻之間均存在顯著性差異（P＜0.05）。

2.2.4" 亞硝酸鹽氮去除效果" 5種微藻的亞硝酸鹽的去除效果見圖10和圖11，5種微藻均具有降低亞硝酸鹽的作用，其中接種四尾柵藻、菱形藻和牟氏角毛藻的第2天，亞硝酸鹽氮的去除率分別達到95.63%、96.60%和95.40%，亞硝酸鹽氮含量顯著低于小球藻和微擬球藻組（P＜0.05），在第4天以后，四尾柵藻、菱形藻和牟氏角毛藻組的亞硝酸鹽氮含量均在檢測值以下；微擬球藻和小球藻組的亞硝酸鹽氮含量均在第6天達到檢測值以下。

3" 討論

3.1" 不同微藻的生長情況

OD680主要通過測定微藻細胞內(nèi)色素在680 nm波長處的光密度來反映微藻的生物量，葉綠素a含量是反映浮游植物生物量乃至水體富營養(yǎng)化程度的最直接有效的指標。小球藻中總色素含量約占細胞干重的4%～5%，其中葉綠素占總色素的60%～80%。硅藻中除了葉綠素a外，巖藻黃素含量約占干重的0.22%～2.17%，故硅藻培養(yǎng)液顏色與綠藻不同，為黃褐色。由于不同種類微藻細胞內(nèi)色素組成的不同以及含量的差異，僅用OD680和葉綠素a含量來比較生物量并不準確，必須結(jié)合細胞密度來進行比較。結(jié)果顯示，四尾柵藻的初始細胞密度較低，且在試驗過程中增殖較慢，實際生物量增加較少，但持續(xù)升高的OD680值和葉綠素a含量均反映了其胞內(nèi)色素含量在持續(xù)積累。兩種硅藻的細胞密度和葉綠素含量均增長較慢，雖然四尾柵藻的細胞密度顯著低于兩種硅藻，但其OD680值和葉綠素a含量則顯著高于兩種硅藻。小球藻的細胞密度和葉綠素含量均增長最快，微擬球藻次之。另外發(fā)現(xiàn)，在第6天時，四尾柵藻和牟氏角毛藻的OD680值沒有顯著差異，但四尾柵藻的葉綠素a含量顯著高于牟氏角毛藻，表明牟氏角毛藻在試驗后期積累了更多的葉綠素a以外的其它色素。

圖11" 微藻的亞硝酸鹽氮去除率

3.2" 不同微藻的水質(zhì)凈化能力

COD反映了水體中有機物污染水平，在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，殘餌和水產(chǎn)動物糞便是養(yǎng)殖水體中有機污染物的主要來源。本研究選用的5種微藻，對COD的降解活力均較強，COD初始值達到480 mg/L，在6 d后的去除率均能達到61%以上，其中小球藻和菱形藻還達到了70%以上。王亞潔等利用微擬球藻處理生活污水，處理13 d的COD 去除率為72.9%。在選用的5種微藻中，小球藻對COD的降解速度最快，這可能與小球藻的生長速度較快有關(guān)；菱形藻在前期對COD的降解速度較慢，到后期的降解效果達到了小球藻的水平。值得關(guān)注的是，綜合OD680、細胞密度和葉綠素a含量來看，相對小球藻，菱形藻的生物量較低，但到第6天時也能達到小球藻的COD降解水平，表明菱形藻對COD的個體降解能力要高于小球藻，而小球藻對COD的降解主要是其生物量快速增加的總體效果。

氮磷濃度是藻類生長的限制性因素，氮磷濃度過高反而會限制藻類的生長活動，從而影響氮磷的去除。本研究中，初始總氮約為100 mg/L，在此條件下總氮的6 d去除率為37.70%～50.36%，菱形藻、小球藻、牟氏角毛藻和微擬球藻均表現(xiàn)出較好的總氮去除能力，四尾柵藻總體差于其它4種微藻；菱形藻在前期略優(yōu)于其它微藻，但到第6天時小球藻降解效果最好，表明菱形藻對總氮的個體降解速率快，而小球藻對總氮的降解主要是其生物量快速增加的總體效果，與COD降解結(jié)果一致。本研究中，初始總磷濃度約20 mg/L，在此條件下總磷的6 d去除率為49.37%～72.45%，在試驗前期，小球藻、微擬球藻和四尾柵藻的降磷效果優(yōu)于菱形藻和牟氏角毛藻，試驗后期，菱形藻的降磷效果最佳，其次是牟氏角毛藻和小球藻。

針對亞硝酸鹽氮，5種微藻均有很強的降解能力，在初始濃度為10 mg/L的情況下，在試驗前期，四尾柵藻、菱形藻和牟氏角毛藻均已去除95%以上的亞硝酸鹽氮，擬微球藻的降解效果最差；試驗中期，四尾柵藻、菱形藻和牟氏角毛藻均已將亞硝酸鹽氮全部降解，擬微球藻的降解速度提高，超過了小球藻；試驗后期，5種微藻均將亞硝酸鹽氮全部降解。不同微藻對不同形態(tài)氮的吸收利用順序不同，張向陽等研究了小球藻對不同形態(tài)氮的吸收順序，發(fā)現(xiàn)小球藻對不同形態(tài)氮的吸收速率依次為：氨氮＞簡單有機氮＞硝酸鹽氮＞亞硝酸鹽氮。本研究中，小球藻對亞硝酸鹽氮的去除率差于四尾柵藻、菱形藻和牟氏角毛藻，這可能與小球藻對亞硝酸鹽氮的吸收順序有關(guān)。

錢磊對污水處理優(yōu)勢微藻群落進行篩選，結(jié)果顯示菱形藻和小環(huán)藻組成的實驗組對污染物總氮、總磷的去除率最高，菱形藻為污水處理的優(yōu)勢微藻。在本研究中，綜合COD、總氮、總磷、亞硝酸鹽氮的去除效果，菱形藻也體現(xiàn)了最佳的綜合凈化效果，該菌株在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有較好的開發(fā)應(yīng)用潛力。

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Purification effect of several microalgae on aquaculture wastewater

ZHANG Xiuxia，XU Jiarui，HU Yonghua，DENG Xiaodong

（1.Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Science， Hainan Provincial Key Laboratory for Functional Components Research and Utilization of Marine Bio-Resources， Haikou 571101， China;2.Zhanjiang Experimental Station，Chinese Academy of Tropical Agricultural Science，Zhanjiang 524013， China）

Abstract：In order to screen the dominant algae that can adapt to the tropical marine aquaculture environment and purify aquaculture wastewater efficiently， the ability of five microalgae to remove chemical oxygen demand （COD）， total nitrogen （TN）， total phosphorus （TP） and nitrite nitrogen（NO-2N） was analyzed and compared. Chlorella sp.， Nannochloropsis sp.， Nitzschia sp.， Chaetoceros sp.， which were locally screened in Hainan， and purchased species Scenedesmus sp. were selected and cultured in eutrophic aquaculture wastewater with shrimp aquaculture water as bottom solution for 6 days. The results showed that Chlorophyta grew faster and diatom grew slower in aquaculture wastewater. Chlorella sp. grew best in eutrophic aquaculture wastewater， with the highest OD680 value， chlorophyll-a content and cell density， which were significantly different from other algae species （Plt;0.05）. Among the five kinds of algae， the ones with good COD removal effect were Nitzschia sp. and Chlorella sp.， and the removal rates were 71.6% and 70.4% respectively. The algae species with good removal efficiency of total nitrogen were Nitzschia sp.， Chlorella sp.， Chaetoceros sp. and Nannochloropsis sp.， and the removal rates were 50.36%， 47.96%， 46.41% and 42.79% respectively. Nitzschia sp. was the best algae to remove total phosphorus， and the removal rate was 71.43%.The algae species with good removal effect of nitrite nitrogen were Nitzschia sp.，Scenedesmus sp.and Chaetoceros sp. ，The removal rates in two days were 96.60%， 95.63% and 95.40% respectively. Nitzschia sp. had the best comprehensive purification effect on aquaculture wastewater.

Key words：microalgae; aquaculture wastewater; purification; total nitrogen; total phosphorus

（收稿日期：2024-03-22）