梁博 李國(guó)東 牟江月崔昭

[摘要]目的：探討補(bǔ)骨脂異黃酮通過(guò)調(diào)控miR-497-5p抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制研究。方法：體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，使用濃度為0、9、18、36μg/ml補(bǔ)骨脂異黃酮處理細(xì)胞，記為Con組、低劑量組、中劑量組、高劑量組；按照脂質(zhì)體法miR-NC、miR-497-5p轉(zhuǎn)染細(xì)胞，記為miR-NC組、miR-497-5p組；按照脂質(zhì)體法anti-miR-NC、anti-miR-497-5p轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，使用36μg/ml補(bǔ)骨脂異黃酮處理細(xì)胞，記為高劑量組+anti-miR-NC組、高劑量組+anti-miR-497-5p組。CCK8、克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖；傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移；Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平；qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-497-5p表達(dá)水平。結(jié)果：補(bǔ)骨脂異黃酮呈劑量關(guān)系降低瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞活性、遷移率（P＜0.05），減少克隆細(xì)胞數(shù)（P＜0.05），降低Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平（P＜0.05），增加miR-497-5p表達(dá)水平。與miR-NC組相比，miR-497-5p組細(xì)胞活性、遷移率降低（P＜0.05），克隆細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05），Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。抑制miR-497-5p可以逆轉(zhuǎn)補(bǔ)骨脂異黃酮對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、遷移的影響。結(jié)論：補(bǔ)骨脂異黃酮可能通過(guò)上調(diào)miR-497-5p抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和遷移。

[關(guān)鍵詞]補(bǔ)骨脂異黃酮；miR-497-5p；瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞；增殖；遷移

[中圖分類(lèi)號(hào)]R285? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2024）06-0060-04

Mechanism Study on Proliferation and Migration of Keloid Fibroblasts Regulated by Psoralen Isoflavones Via miR-497-5p

LIANG Bo1， LI Guodong2， MOU Jiangyue1， CUI Zhao1

（ 1.Department of Dermatology， Baoding Second Hospital， Baoding 071051， Hebei， China; 2. Department of Gastroenterology， Baoding First Central Hospital， Baoding 071030， Hebei， China ）

Abstract： Objective? To investigate the mechanism of psoralen isoflavones inhibiting the proliferation and migration of keloid fibroblasts by regulating miR-497-5p. Methods? Keloid fibroblasts were cultured in vitro and treated with 0， 9， 18， 36 μg/ml psoralen isoflavones， which were classified as Con group， low dose group， medium dose group and high dose group. The cells were transfected with miR-NC and miR-497-5p by liposome method， and were denoted as miR-NC group and miR-497-5p group. After transfection with anti-miR-NC and anti-miR-497-5p by liposome method， the cells were treated with 36 μg/ml psoralen isoflavones， which were denoted as high-dose group +anti-miR-NC group and high-dose group +anti-miR-497-5p group. Cell proliferation was detected by CCK8 and cloning assay. Cell migration was detected by wound healing test. The expression levels of Cyclin D1， MMP2 and MMP9 were detected by Western blot assay. The expression level of miR-497-5p was detected by qRT-PCR. Results? Psoralen isoflavones decreased the cell viability and migration rate of keloid fibroblasts （P＜0.05）， decreased the number of cloned cells （P＜0.05）， and decreased the protein expression levels of Cyclin D1， MMP2， and MMP9 （P＜0.05）， increase the expression level of miR-497-5p. Compared with the miR-NC group， the cell viability and migration rate of the miR-497-5p group were reduced （P＜0.05）， the number of cloned cells was reduced （P＜0.05）， and the protein expression levels of Cyclin D1， MMP2， and MMP9 were reduced （P＜0.05）. Inhibition of miR-497-5p can reverse the effect of psoralen isoflavones on the proliferation and migration of keloid fibroblasts. Conclusion? Psoralen isoflavones may inhibit the proliferation and migration of keloid fibroblasts by increasing miR-497-5p.

Key words： psoralen isoflavones; miR-497-5p; keloid fibroblasts; proliferation; migration

瘢痕疙瘩主要是外傷或自發(fā)形成過(guò)度增長(zhǎng)的病理性瘢痕組織，與正常皮膚界限表現(xiàn)明顯，瘢痕疙瘩一般呈暗紅或紫紅色，呈結(jié)節(jié)狀或片狀，常高出皮膚表面[1]。瘢痕疙瘩主要以手術(shù)、激光、藥物治療為主，但效果均不顯著且復(fù)發(fā)率高，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[2]。補(bǔ)骨脂是豆科植物補(bǔ)骨脂的成熟果實(shí)，具有溫腎助陽(yáng)、溫脾止瀉等功效，外用能夠消風(fēng)祛斑，有抗炎、抗菌和抗病毒等藥理活性[3]。有研究結(jié)果顯示，補(bǔ)骨脂異黃酮對(duì)人體皮膚創(chuàng)傷有治療作用，可能與抗炎、抗氧化作用有關(guān)[4]，但是補(bǔ)骨脂異黃酮對(duì)瘢痕疙瘩的研究尚不清楚。miRNA是短鏈非編碼RNA，與人類(lèi)皮膚病有關(guān)，目前被證實(shí)的miRNA與瘢痕疙瘩有關(guān)，如miR-21、miR-141-3p、miR-181a等[5-6]。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-497-5p在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中呈下調(diào)表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-497-5p能抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。關(guān)于補(bǔ)骨脂異黃酮和miR-497-5p對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的研究尚不清楚，鑒于此，本研究主要探究補(bǔ)骨脂異黃酮通過(guò)miR-497-5p影響瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1? 材料和方法

1.1 細(xì)胞和試劑：人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；補(bǔ)骨脂異黃酮（寶雞市辰光生物科技有限公司）；miR-NC、miR-497-5p、anti-miR-NC、anti-miR-497-5p、引物（廣州銳博公司設(shè)計(jì)合成）；Lipofectamine 2000試劑盒、TRIzol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；CCK8試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；Cyclin D1抗體、MMP2抗體、MMP9抗體、GAPDH抗體（美國(guó)Cellular Signaling Technology公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（美國(guó)Promega公司）。

1.2 細(xì)胞分離和分組：將人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞從液氮罐內(nèi)取出，復(fù)蘇后使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基孵育，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)融合度達(dá)到80%，采用0.25%胰酶消化培養(yǎng)細(xì)胞。取對(duì)數(shù)期人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞病接種96孔板中，融合度為60%，使用補(bǔ)骨脂異黃酮濃度為9、18、36μg/ml處理細(xì)胞，分為低劑量組、中劑量組、高劑量組，以Con為對(duì)照，細(xì)胞內(nèi)加DMSO試劑；按照Lipofectamine 2000試劑盒說(shuō)明書(shū)將miR-NC、miR-497-5p轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)，記為miR-NC組、miR-497-5p組；按照Lipofectamine 2000試劑盒說(shuō)明書(shū)將anti-miR-NC、anti-miR-497-5p轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，使用補(bǔ)骨脂異黃酮濃度為36μg/ml處理細(xì)胞，記為高劑量組+anti-miR-NC組、高劑量組+anti-miR-497-5p組。各組細(xì)胞設(shè)置9個(gè)復(fù)孔。

1.3 CCK8、克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

1.3.1 CCK8實(shí)驗(yàn)：收集各組人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞然后以4×104個(gè)/毫升密度接種96孔板，培養(yǎng)48 h，然后加入10μl的CCK-8溶液，培養(yǎng)2 h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞吸光度值（A），用來(lái)計(jì)算細(xì)胞活性（%）。

1.3.2 克隆實(shí)驗(yàn)：將人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞按照1.2的方法處理，以每孔500個(gè)細(xì)胞接種6孔板中，放置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10～14 d，直至觀察到克隆出現(xiàn)停止培養(yǎng)，使用甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)，記為克隆細(xì)胞數(shù)目。

1.4 傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移：將對(duì)數(shù)期人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞接種6孔板中，細(xì)胞融合度生長(zhǎng)到80%，使用無(wú)菌槍頭垂直劃線，使用PBS漂洗細(xì)胞2次，加入不含血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。在0、24 h時(shí)拍照，計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率（%）=（0 h時(shí)劃痕寬度-24 h時(shí)劃痕寬度）/0 h時(shí)劃痕寬度×100%。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)：取各組人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞培養(yǎng)48 h，將總蛋白提取后經(jīng)過(guò)BCA法檢測(cè)定量蛋白濃度，然后將蛋白樣品使用SDS-PAGE凝膠分離蛋白，電泳結(jié)束迅速完成轉(zhuǎn)膜，在5%脫脂奶粉中封閉培養(yǎng)2 h，4℃加入一抗Cyclin D1（1∶800）、MMP2（1∶800）、MMP9（1∶800）、GAPDH（1∶1 000）過(guò)夜孵育，次日與稀釋濃度為1∶5 000的二抗室溫孵育2 h，加入ECL試劑進(jìn)行顯色，曝光、拍照。使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參計(jì)算目的蛋白表達(dá)。

1.6 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-497-5p表達(dá)水平：取各組人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞加入TRIzol試劑提取總RNA，紫外分光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，觀察是否在1.8～2.1之間，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，然后用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。以U6作為內(nèi)參，按2-ΔΔCt法計(jì)算miR-497-5p表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示，四組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 補(bǔ)骨脂異黃酮對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖的影響：與Con組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組細(xì)胞活性降低（P＜0.05），克隆細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05），Cyclin D1蛋白表達(dá)水平降低，且呈劑量依賴(lài)性（P＜0.05）。

2.2 補(bǔ)骨脂異黃酮對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞遷移的影響：與Con組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組遷移率降低（P＜0.05），MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），且呈劑量依賴(lài)性。

2.3 補(bǔ)骨脂異黃酮對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞miR-497-5p表達(dá)的影響：與Con組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組miR-497-5p表達(dá)水平升高（P＜0.05），且呈劑量依賴(lài)性。

2.4 上調(diào)miR-497-5p對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和遷移的影響：與miR-NC組相比，miR-497-5p組miR-497-5p表達(dá)水平升高（P＜0.05），細(xì)胞活性、遷移率降低（P＜0.05），克隆細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05），Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。

2.5 抑制miR-497-5p對(duì)補(bǔ)骨脂異黃酮處理瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、遷移的影響：與高劑量組+anti-miR-NC組相比，高劑量組+anti-miR-497-5p組miR-497-5p表達(dá)水平降低（P＜0.05），細(xì)胞活性、遷移率升高（P＜0.05），克隆細(xì)胞數(shù)增多（P＜0.05），Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。

3? 討論

瘢痕疙瘩是皮膚科常見(jiàn)良性腫瘤，與成纖維細(xì)胞過(guò)度增長(zhǎng)且膠原分泌過(guò)多有關(guān)[8]。瘢痕疙瘩治療方法比較多，但是容易復(fù)發(fā)從而影響治療效果，近年研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)治療瘢痕疙瘩效果明顯[9]。如雷公藤紅素可抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]。補(bǔ)骨脂外用可治療牛皮癬、斑禿等皮膚病，化學(xué)成分豐富多樣，藥理研究顯示具有良好的抗炎、抗腫瘤、抗菌等作用[11-12]。研究結(jié)果顯示，補(bǔ)骨脂酚通過(guò)增加COL-I表達(dá)，降低MMP-1、MMP-3表達(dá)，抑制紫外線誘導(dǎo)的光老化人皮膚成纖維細(xì)胞膠原合成[13]。補(bǔ)骨脂素對(duì)紫外線誘導(dǎo)的人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞老化有保護(hù)作用[14]。還有研究結(jié)果顯示，補(bǔ)骨脂異黃酮對(duì)中波紫外線誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，并能提高細(xì)胞抗氧化酶活性[15]。但是補(bǔ)骨脂異黃酮對(duì)瘢痕疙瘩研究不清楚。本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)骨脂異黃酮呈劑量效應(yīng)降低細(xì)胞活性、遷移率，減少克隆細(xì)胞數(shù)，降低Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)，提示補(bǔ)骨脂異黃酮抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和遷移，從而抑制瘢痕疙瘩形成。

既往研究結(jié)果顯示，miRNA與瘢痕疙瘩發(fā)生發(fā)展有關(guān)[16]，如miR-21在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞表達(dá)增加，miR-21通過(guò)降低Smad7表達(dá)抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞膠原蛋白合成[17]。另有研究結(jié)果顯示，在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中miR-34a表達(dá)降低，其可能通過(guò)降低SATB1抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[18]。在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中miR-141-3p表達(dá)降低，上調(diào)miR-141-3p抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖和遷移[19]。還有研究結(jié)果顯示，在瘢痕疙瘩組織中miR-152-5p低表達(dá)，Smad3是miR-152-5p靶基因，高表達(dá)miR-152-5p對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、遷移有抑制作用，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[20]。已有研究顯示，miR-497-5p與瘢痕疙瘩發(fā)展有關(guān)，可以作為瘢痕疙瘩潛在標(biāo)記物[7]。本研究結(jié)果也顯示，補(bǔ)骨脂異黃酮處理瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞后miR-497-5p表達(dá)增加，提示補(bǔ)骨脂異黃酮可能調(diào)控miR-497-5p表達(dá)。上調(diào)miR-497-5p能抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和遷移，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制miR-497-5p對(duì)補(bǔ)骨脂異黃酮處理瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、遷移的影響，提示補(bǔ)骨脂異黃酮可能通過(guò)增加miR-497-5p抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和遷移。

綜上所述，補(bǔ)骨脂異黃酮抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和遷移，可能與miR-497-5p有關(guān)。

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[收稿日期]2022-11-28

本文引用格式：梁博，李國(guó)東，牟江月，等.補(bǔ)骨脂異黃酮通過(guò)miR-497-5p調(diào)控對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2024，33（6）：60-64.