李莎 杜麗娟 薛蕾 王銘磊 萬(wàn)娜 馮明

[摘要]目的：觀察iRoot BP Plus作為根尖倒充填材料封閉根尖的效果。方法：選取上下頜單直根管離體牙60顆，Reciproc blue機(jī)用單支鎳鈦銼預(yù)備根管，熱牙膠連續(xù)波技術(shù)充填根管，超聲工作尖對(duì)離體牙根尖區(qū)行倒預(yù)備。將離體牙隨機(jī)分為三組，分別以iRoot BP Plus、MTA、3MZ350樹(shù)脂行倒充填。體式激光共聚焦掃描顯微鏡觀察倒充填后材料及牙體組織的顏色變化率。上述標(biāo)本再次隨機(jī)分為兩個(gè)亞組，分別浸泡于2%亞甲基藍(lán)溶液和1 g/L羅丹明B熒光染料中，48 h后分別在光學(xué)顯微鏡、掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡下測(cè)量染料線性滲漏長(zhǎng)度；測(cè)量材料與牙本質(zhì)間的微間隙寬度，觀察不同倒充填材料與根管壁間的微觀結(jié)合形態(tài)；計(jì)算分析根尖區(qū)微滲漏熒光染色面積。通過(guò)定性和定量的方法研究不同倒充填材料對(duì)根尖封閉性能的影響。結(jié)果：iRoot BP Plus組倒充填后未發(fā)生明顯顏色改變，美觀性優(yōu)于MTA組（P＜0.05），但與樹(shù)脂組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。iRoot BP Plus組染料滲漏長(zhǎng)度較MTA組短（P＜0.05），和MTA組染料滲漏長(zhǎng)度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。三組微間隙寬度比較，iRoot BP Plus組＜MTA組＜樹(shù)脂組（P＜0.05）。三組微滲漏熒光染色面積比較，iRoot BP Plus組＜MTA組＜樹(shù)脂組（P＜0.05）。結(jié)論：iRoot BP Plus具有良好的根尖封閉性、密合性和美觀性。

[關(guān)鍵詞]iRoot BP Plus；根尖倒充填；激光共聚焦掃描顯微鏡；掃描電子顯微鏡；體外研究

[中圖分類號(hào)]R781.05? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2024）06-0056-04

In Vitro Research Concerning CLMS Observation of the Effect of? iRoot BP Plus on Root Tip Retrograde Filling and Sealing

LI Sha， DU Lijuan， XUE Lei， WANG Minglei， WAN Na， FENG Ming

（Dpartment of Dental and Endodontics Ⅱ， Urumqi Stomatological Hospital， Urumqi 830000， Xinjiang，China）

Abstract： Objective To observe how iRoot BP Plus， an apical filling material， sealed the apical root. Methods? Sixty in vitro teeth with a single straight root canal in upper and lower jaws were selected. A RECIPROC blue single nickel titaniμm file for instrμment was used for root-end preparation. The continuous wave of condensation technique with thermoplasticized gutta-percha was used to obturate roots. An ultrasonic tip was used to prepare the root end in vitro. The in vitro teeth were randomly divided into three groups， which were retrograde filled with iRoot BP Plus， MTA and resin（3MZ350）respectively. A dental microscope observed the color change rate of materials and dental tissue after the retrograde filling. The above specimens were again randomly divided into two sub -groups， and soaked in 2% methylene blue solution and 1g /L rhodamine solution respectively. Forty-eight hours later， the linear leakage length of dyes and the width of micro space between the materials and Dentin were measured under an optical microscope， a scanning electronic microscope and a laser confocal microscope. The microscopical bonding between different filling materials and root canal wall was observed. The microleakage fluorescent dyeing area of the root tip area was calculated and analyzed. The effect of different filling materials on apical sealing performance was studied through qualitative and quantitative methods. Results? There was no obvious color change after backfilling in iRoot BP Plus group， which was better than that in MTA group （P＜0.05）， but there was no significant difference between iRoot BP Plus group and resin group （P＞0.05）. The dye leakage length of iRoot BP Plus group was shorter than that of MTA group （P＜0.05）， and there was no significant difference in dye leakage length between iRoot BP Plus group and MTA group （P＞0.05）. The microgap width of the three groups was compared， iRoot BP Plus group＜MTA group＜resin group （P＜0.05）. The staining area of the three groups was compared， iRoot BP Plus group＜MTA group＜resin group （P＜0.05）. Conclusion? iRoot BP Plus is good in root tip sealing， combining and looking.

Key words： iRoot BP Plus; retrograde filling; confocal laser scanning microscope; scanning electron microscope; research in vitro

顯微根尖外科手術(shù)是現(xiàn)階段治療難治性根尖炎、根尖囊腫的最好治療方法，但依然存在失敗案例[1-2]。術(shù)中根尖倒充填材料與根管壁之間不密合，感染未控制是導(dǎo)致手術(shù)失敗直接原因[3-4]。根尖封閉質(zhì)量是決定手術(shù)成功的重要因素，故選擇合適高效的根尖倒充填材料在手術(shù)中變得尤為重要。iRoot BP Plus作為一種新興生物陶瓷材料已逐漸應(yīng)用于根尖手術(shù)，但術(shù)后療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)和觀察期等方面均存在差異，遠(yuǎn)期療效尚待追蹤觀察。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于iRoot BP Plus的體外研究局限于描述性定性分析。故本實(shí)驗(yàn)不僅采用顯微鏡、掃描電鏡定性描述，還采用激光共聚焦顯微鏡（Confocal laser scanning microscope，CLSM）量化觀察iRoot BP Plus倒充填后離體牙的根尖封閉性和密合性，為進(jìn)一步保留天然牙，維護(hù)患牙美觀提供參考依據(jù)。

1? 材料和方法

1.1 離體牙收集：挑選60顆近期因牙周病或正畸減數(shù)拔除的下頜第二前磨牙、上下頜切牙和上頜尖牙，要求單直根管，根尖發(fā)育完整、牙根無(wú)齲壞、未做過(guò)牙髓治療，根管順暢，無(wú)根管內(nèi)外吸收，無(wú)裂紋，無(wú)鈣化。截冠后用刮治器和刀片清除牙根表面殘留的牙石及軟組織，在生理鹽水中室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 材料與設(shè)備：iRoot BP Plus（創(chuàng)新生物公司，加拿大）；MTA、牙膠尖、cc+銼、AH plus（Dentsply公司，美國(guó)）；3MZ350樹(shù)脂（3M公司，美國(guó)）；reciproc blue單支鎳鈦銼、5.25%次氯酸鈉溶液、熱牙膠膠囊、17%EDTA（VDW公司，德國(guó)）；TR21（MANI公司，日本）；垂直加壓器（豪孚迪，美國(guó)）；藻酸鹽印膜材（賀利氏古莎，德國(guó)）；P5超聲根管治療儀、P14D超聲尖、碧藍(lán)糊劑（艾龍公司，德國(guó)）；亞甲基藍(lán)溶液（索萊寶公司，中國(guó)）；羅丹明B熒光染液（Sigama公司，美國(guó)）；手術(shù)顯微鏡（zunmax，中國(guó)）；掃描電鏡（JSM-6390LV，日本）；激光共聚焦掃描顯微鏡（TCS-SP2，德國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 根管預(yù)備+根管充填：全部牙齒標(biāo)本都由一名經(jīng)過(guò)規(guī)范化培訓(xùn)的口腔專業(yè)型研究生進(jìn)行根管預(yù)備根管充填。開(kāi)髓后，用10#cc+銼測(cè)量工作長(zhǎng)度，reciproc blue25#單支鎳鈦銼行根管預(yù)備，5.25%次氯酸鈉溶液+17%EDTA行根管沖洗。AH plus根管封閉劑+熱牙膠膠囊連續(xù)波技術(shù)充填根管，最后使用光固化復(fù)合樹(shù)脂封閉根管口。X線片檢查根管充填狀況，確保樣本均充填致密。置于蒸餾水中保存。

1.3.2 根管倒預(yù)備+根管倒充填：全部牙齒標(biāo)本均由一名經(jīng)過(guò)規(guī)范化培訓(xùn)的主治醫(yī)師處理。金剛砂車針TR21垂直于牙根長(zhǎng)軸切除根尖約3 mm，P14D超聲尖行倒預(yù)備，洞深3 mm。使用吸潮紙尖干燥根管，將樣本隨機(jī)分為iRoot BP Plus組、MTA組、3MZ350樹(shù)脂組，每組20個(gè)。使用垂直加壓器行倒充填后置于濕潤(rùn)藻酸鹽硬膜材中保存7 d，使用高倍光學(xué)顯微鏡觀察根尖橫斷面材料及周圍牙本質(zhì)顏色變化。

1.3.3 染色、觀察、測(cè)量：待倒充填材料完化硬固后，將每組再次隨機(jī)分為兩個(gè)亞組，牙根表面涂布指甲油，只暴露根尖橫截面，其中一亞組置于2%亞甲基藍(lán)溶液中染色，浸泡2 d。用金剛砂車針TF21將牙根沿牙最長(zhǎng)縱軸方向劈開(kāi)，16倍手術(shù)顯微鏡下聯(lián)合Digimizer軟件測(cè)量滲漏值長(zhǎng)度。同時(shí)使用掃描電鏡觀察材料與根管壁結(jié)合形態(tài)，測(cè)量倒充填材料與牙本質(zhì)間微縫隙寬度。另一亞組置于1 g/L羅丹明B熒光染液中染色，浸泡2 d。激光共聚焦顯微鏡觀察根尖區(qū)域微滲漏熒光染色情況，同時(shí)使用LEICA TCS SP5分析軟件對(duì)熒光面積進(jìn)行測(cè)量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 體式顯微鏡下觀察：7 d后倒充填材料與牙體組織的顏色變化率結(jié)果顯示，MTA組根尖橫截面材料及周圍牙本質(zhì)均成淡灰色，顏色變化率為100%；iRoot BP Plus組所有樣本均未出現(xiàn)顏色變化，顏色變化率為0%；樹(shù)脂組所有樣本均未出現(xiàn)顏色變化，變化率為0%（見(jiàn)圖1）。三組美觀性比較：iRoot BP Plus組在顏色穩(wěn)定性、美觀性方面優(yōu)于MTA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與樹(shù)脂組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)根尖區(qū)染料滲透結(jié)果：牙根縱向劈開(kāi)后，光學(xué)顯微鏡下觀察到iRoot BP Plus組與對(duì)照組均有不同程度的染料滲透（見(jiàn)圖2）。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Digimizer軟件對(duì)牙根斷面至倒充填材料間染料滲透最長(zhǎng)距離進(jìn)行測(cè)量，染料滲透長(zhǎng)度越短說(shuō)明該材料的封閉性越好。iRoot BP Plus組染料滲透平均長(zhǎng)度為（1.06±0.28）mm，MTA組為（1.12±0.35）mm，樹(shù)脂組染料滲透平均長(zhǎng)度為（3.54±0.72）mm。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：iRoot BP Plus組和MTA組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與樹(shù)脂組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。iRoot BP Plus組和MTA組封閉性能優(yōu)于樹(shù)脂組。

2.3 掃描電鏡觀察倒充填材料與根管壁結(jié)合界面形態(tài)：在100倍鏡下觀察到iRoot BP Plus、MTA與牙本質(zhì)結(jié)合較為緊密，未見(jiàn)明顯縫隙，樹(shù)脂組可見(jiàn)較為清晰縫隙。在1 000倍和5 000倍鏡下觀察到iRoot BP Plus在牙本質(zhì)邊界處形成較小的突起類似偽足，依附嵌入牙本質(zhì)間隙，結(jié)合較好；MTA在牙本質(zhì)邊界處以斷層形式形成類似云朵狀不規(guī)則結(jié)晶體，與牙本質(zhì)間斷結(jié)合；樹(shù)脂與牙本質(zhì)邊界形成巨大鴻溝，各自邊界清晰，未見(jiàn)明顯結(jié)合。見(jiàn)圖3。在5000倍鏡下，用掃描電鏡分析標(biāo)尺對(duì)倒充填材料與牙本質(zhì)間最寬縫隙進(jìn)行距離測(cè)量（如綠色箭頭所示），iRoot BP Plus組為（1.24±0.72）μm，MTA組為（3.58±1.26）μm，樹(shù)脂組為（11.58±3.18）μm，三組間兩兩比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。iRoot BP Plus組與牙本質(zhì)間縫隙最小，邊緣結(jié)合性最好，密合性明顯優(yōu)于MTA組與樹(shù)脂組。

2.4 激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)根尖熒光染料滲透結(jié)果：CLSM下可見(jiàn)iRoot BP Plus組、MTA組、樹(shù)脂組根尖區(qū)域均有不同程度的熒光染色（見(jiàn)圖4）。同時(shí)使用LEICA TCS SP5分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行熒光面積測(cè)量，iRoot BP Plus組為（4.78±1.32）μm2，MTA組為（9.32±4.17）μm2，樹(shù)脂組為（27.45±7.19）μm2，三組間兩兩比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。iRoot BP Plus組熒光滲透面積最小，密合性明顯優(yōu)于MTA組與樹(shù)脂組。

3? 討論

3.1 研究iRoot BP Plus對(duì)根尖倒充填封閉效果的必要性：iRoot BP Plus是我國(guó)近5年出現(xiàn)的一種新型生物陶瓷材料。它的主要成分包括硅酸鈣、氧化鋯、磷酸鈣、氫氧化鈣和填料等[5]。在iRoot BP Plus出現(xiàn)前，MTA被廣大臨床醫(yī)生和學(xué)者定義為顯微根尖外科手術(shù)倒充填材料的金標(biāo)準(zhǔn)。大量實(shí)驗(yàn)研究證明了MTA具有良好的生物相容性和根尖封閉性［6］，無(wú)細(xì)胞毒性，且具有促進(jìn)軟組織再生、誘導(dǎo)骨細(xì)胞增殖作用［7］。但MTA固化時(shí)間長(zhǎng)，操作效率低，價(jià)格昂貴，有潛在變色等缺點(diǎn)，并且在倒充填初期受根尖周組織液的浸泡、沖刷，易造成流失[8]。近年來(lái)有研究結(jié)果表明，iRoot BP Plus硬固時(shí)間短，抗沖刷能力強(qiáng)，與MTA理化性能相當(dāng)，甚至較MTA具有更好的生物相容性和封閉性[9]。也有學(xué)者報(bào)道，認(rèn)為iRoot BP Plus的封閉性能較MTA差[10]。目前關(guān)于這兩種材料封閉性能綜合性比較研究較少且結(jié)論不一。

3.2 研究結(jié)果的創(chuàng)新性討論：體式顯微鏡下觀察到iRoot BP Plus不易使牙體組織變色，性能更穩(wěn)定，為維護(hù)患牙預(yù)后美觀提供理論基礎(chǔ)。這與iRoot BP Plus成分中不含引起牙變色的鋁和氧化鉍有關(guān)。而MTA及周圍牙本質(zhì)均變?yōu)榛液谏崾綧TA預(yù)后可能會(huì)引起牙齒漸進(jìn)性變色，不宜用于治療前牙。亞甲基藍(lán)染料滲透實(shí)驗(yàn)顯示iRoot BP Plus組和MTA組封閉性能優(yōu)于樹(shù)脂組，這與謝克賢等[14]研究的結(jié)果一致。掃描電鏡觀測(cè)結(jié)果顯示，iRoot BP Plus與根管壁間微縫隙寬度小于MTA，這可能與其成分具有更小粒徑有關(guān)。羅丹明滲透實(shí)驗(yàn)顯示，iRoot BP Plus組根尖區(qū)熒光染色面積小于MTA和樹(shù)脂組，且定量分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與本實(shí)驗(yàn)在體式顯微鏡下觀察到的亞甲基藍(lán)滲透實(shí)驗(yàn)結(jié)果有差別，提示可能與選用的染料分子大小性能不同有關(guān)。羅丹明B為低分子染料，且具有熒光性，可以滲透到根尖區(qū)細(xì)菌及蛋白質(zhì)無(wú)法滲透的部位，實(shí)驗(yàn)精確度更高，參考性更強(qiáng)。

3.3 本實(shí)驗(yàn)方法學(xué)的先進(jìn)性：方法學(xué)中目前公認(rèn)的微滲漏檢測(cè)方法有葡萄糖氧化酶蒽酮法[11]、微生物滲漏法、放射性核素滲透法[12]，以及染料線性滲漏法[13]等。其中，染料滲漏法是牙體微滲漏檢測(cè)中最為經(jīng)典直觀的方法之一[14]，且本實(shí)驗(yàn)采用的亞甲基藍(lán)和羅丹明B染料，均為分子級(jí)別顆粒，如果染料無(wú)法滲入，那么較大直徑的細(xì)菌和毒性代謝產(chǎn)物更加無(wú)法滲入。

滲透實(shí)驗(yàn)傳統(tǒng)利用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡進(jìn)行描述性觀察和定性研究，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)激光共聚焦顯微鏡結(jié)合圖像軟件計(jì)算根尖區(qū)微滲漏熒光染色面積，以定量的方法研究不同倒充填材料對(duì)根尖封閉性能的影響，更科學(xué)準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)根尖封閉能力，使結(jié)果更具客觀性，彌補(bǔ)了國(guó)內(nèi)激光共聚焦顯微鏡定量分析倒充填材料封閉效果研究這一空白。激光共聚焦顯微鏡突破了光學(xué)顯微鏡不能對(duì)組織內(nèi)部進(jìn)行定量檢測(cè)的限制，彌補(bǔ)了電鏡在宏觀和動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)研究等方面的不足，克服了制樣困難等方面的缺點(diǎn)。同時(shí)，CLMS也可運(yùn)用于口腔其他方面的研究。

3.4 新型生物陶瓷材料的未來(lái)展望：本次體外實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果是iRoot BP Plus具有良好的根尖封閉性和密合性，與牙本質(zhì)結(jié)合面的邊緣適應(yīng)性能優(yōu)于MTA，且iRoot BP Plus不宜使自身及牙體變色，凝固時(shí)間短，抗沖刷能力強(qiáng)，無(wú)需調(diào)制，隨取隨用，臨床操作效率高，價(jià)格低于MTA，有望替代MTA成為方便操作且性能優(yōu)良的根尖倒充填材料。國(guó)內(nèi)有學(xué)者[15-16]對(duì)iRoot BP Plus在臨床中作為倒充填材料的療效進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，1年治愈率達(dá)95%，療效優(yōu)于MTA，并能有效減輕術(shù)中術(shù)后局部紅腫、疼痛，控制根尖周病的病情，短期臨床療效較好。

目前關(guān)于新型倒充填材料封閉性能的研究大多為體外實(shí)驗(yàn)，臨床實(shí)驗(yàn)及樣本量均很少，其遠(yuǎn)期效果和臨床應(yīng)用還需進(jìn)一步研究及隨訪。故本課題組后續(xù)將開(kāi)展大樣本隨機(jī)臨床對(duì)照實(shí)驗(yàn)研究，為臨床療效進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]樊明文.牙體牙髓病學(xué)[M].4版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2015：308-332.

[2]王威棟，宋衛(wèi)健，王利群，等.羥基磷灰石生物陶瓷填充在口腔根尖囊腫切除骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2022，31（12）：95-98.

[3]Stephen Cohen， Richard C. Pathway of the pulp[M]. Beijing： World Book Inc， 2016： 769-801.

[4]張琛.根管充填的難點(diǎn)和誤區(qū)[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2017，35（3）：232-238.

[5]Lv F， Zhu L， Zhang J， et al. Evaluation of the in vitro biocompatibility of a new fast-setting ready-to-use root filling and repair material[J]. Int Endod J， 2016，50（6）：540-548.

[6]Solanki N P， Venkappa K K， Shah N C. Biocompatibility andsealing ability of mineral trioxide aggregate and biodentine as root end filling material：A systematic review[J]. J Conserv Dent， 2018，21（1）：10-15.

[7]Silva E， Carvalho N K， Prado M， et al. Pushout bond strength of fast setting mineral trioxide aggregate and Pozzolan based cements： Endocem MTA and endocem Zr[J]. J Endod， 2017，43（5）：801-804.

[8]Parirokh M. Mineral trioxide aggregate： a comprehensive literature review-part ⅲ：clinical applications，drawbacks，and mechanism of action[J]. J Endod， 2010，36（3）：400-413.

[9]Jeevani E， Jayaprakash T， Bolla N， et al. Evaluation of sealing ability of MM-MTA， Endosequence， and biodentineas furcation repair materials： UV spectroph otometric analyusis[J]. J Conserv Dent， 2014，17（4）：340-343.

[10]張俊領(lǐng)，何露，劉明饗，等.新型硅酸鈣基生物材料用于根尖倒充填的封閉性能和粘接強(qiáng)度的研究[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志，2021，19（1）：35-39.

[11]王密，尹世海，王奇，等.I Root BP修復(fù)磨牙髓室底穿孔的研究[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2013，32（3）：257-259.

[12]呂翱，林曉新，郭曉莉，等.三種根管封閉劑的根尖封閉性能體外比較研究[J].中國(guó)實(shí)用口腔科雜志，2022，15（3）：300-303.

[13]Kubo C H， Gomes A P， Mancini M N. In vitro evaluation of apical sealing in root apex treated with deminer alization agents and retrofiled with mineral trioxide aggregate through marginal dye leakage[J]. Braz Dent J， 2005，16（3）：187-191.

[14]謝克賢，黎遠(yuǎn)皋，王霄.倒充填材料IRoot BP Plus的根尖封閉性研究[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志，2019，17（3）：142-144.

[15]何琴，楊衛(wèi)東，黎景景，等.IRoot BP Plus材料結(jié)合顯微根尖手術(shù)治療難治性根尖周炎的療效觀察[J].口腔材料器械雜志，2021，30（3）：193-196.

[16]楊光，霍峰，尹雪蓮，等.MTA、iRoot BP Plus在難治性前牙根尖周病患者根管治療中的應(yīng)用比較[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2021，31（4）：81-85.

[收稿日期]2022-12-27

本文引用格式：李莎，杜麗娟，薛蕾，等.CLMS觀察iRoot BP Plus對(duì)根尖倒充填封閉效果的體外研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2024，33（6）：56-59.