【摘要】目的 探討T細(xì)胞介導(dǎo)的分子免疫學(xué)機(jī)制在兒童干燥閉塞性陰莖頭炎（BXO）疾病進(jìn)展中的作用，為臨床提供參考。方法 收集2020年1月至2023年12月于深圳市坪山區(qū)婦幼保健院實(shí)施包皮手術(shù)且包皮標(biāo)本送病理學(xué)檢查的病例資料（50例），按病理診斷分為5組：早期BXO組（10例），中期BXO組（10例），晚期BXO組（10例），排除BXO的病理性包莖組[10例，陽性對(duì)照組（C組）]，生理性包莖組[10例，陰性對(duì)照組（N組）]。應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)CD4+、CD8+、叉頭框蛋白P3（FOXP3+）T淋巴細(xì)胞，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2（TGF-β2）在BXO早期組、BXO中期組、BXO晚期組、排除BXO的病理性包莖組和生理性包莖組中的表達(dá)情況，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果 BXO早期、中期、晚期組中CD4+、CD8+、FOXP3+T淋巴細(xì)胞均有表達(dá)。與生理性包莖組比較，BXO典型皮損組織中CD4+、CD8+、FOXP3+T淋巴細(xì)胞明顯增多（Plt;0.01），其中CD4+T淋巴細(xì)胞百分比明顯增高（Plt;0.01）。與BXO早期、晚期組比較，BXO中期組中CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增多（Plt;0.01）。與生理性包莖組比較，INF-γ在BXO晚期組中的表達(dá)量增加（Plt;0.05）；TGF-β2在BXO早期、BXO中期組中表達(dá)量均明顯增加（Plt;0.01）；與生理性包莖組比較，IL-4在BXO晚期組中的表達(dá)量明顯增加（Plt;0.01）。結(jié)論 兒童BXO的病理過程可能與T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答相關(guān)，且可能是CD4+T細(xì)胞可能起主導(dǎo)作用；IFN-γ、TGF-β2、IL-4可能是T細(xì)胞在BXO的疾病進(jìn)展中產(chǎn)生的重要細(xì)胞因子。兒童BXO早期、中期可能以細(xì)胞免疫模式（Th1型）為主，在兒童BXO晚期常見的免疫應(yīng)答為Th1型、體液免疫模式（Th2型）。

【關(guān)鍵詞】干燥閉塞性陰莖頭炎；兒童；T細(xì)胞；細(xì)胞因子

【中圖分類號(hào)】R697+.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2096-2665.2024.07.0013.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2024.07.005

干燥閉塞性陰莖頭炎（balanitis xerotica obliterans，BXO）是一種發(fā)生在包皮、陰莖、尿道的伴皮膚萎縮、慢性纖維化病變的疾病，易復(fù)發(fā)，臨床診治較為困難。近年來的研究表明，BXO在兒童期也有較高的發(fā)病率[1]，且是繼發(fā)性包莖（secondary penile，SP）的重要誘因。有一項(xiàng)應(yīng)用全基因組微陣列的研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)增加的基因大多與免疫應(yīng)答相關(guān)，包括抗原處理、淋巴細(xì)胞活化、趨化因子活性、T細(xì)胞活化調(diào)節(jié)和凋亡，并認(rèn)為包皮硬化苔蘚可能是一種慢性特異性炎癥性疾病，但其病因及發(fā)展機(jī)制尚不明確[2]。本研究觀察CD4+、CD8+、叉頭框蛋白P3（FOXP3+）T細(xì)胞及干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2（TGF-β2）在兒童BXO包皮組織中的表達(dá)情況，以了解T細(xì)胞及其介導(dǎo)的分子免疫學(xué)機(jī)制在兒童BXO疾病進(jìn)展中的作用，為進(jìn)一步探索兒童BXO的病因及建立針對(duì)病因及發(fā)病機(jī)制的診治策略提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2020年1月至2023年12月深圳市坪山區(qū)婦幼保健院實(shí)施包皮手術(shù)并送病理檢查的病例資料及送檢組織（50例）。按病理診斷分為5組：早期BXO組（10例），中期BXO組（10例），晚期BXO組（10例），排除BXO的病理性包莖組[10例，陽性對(duì)照組（C組）]，生理性包莖組[10例，陰性對(duì)照組（N組）]。本研究經(jīng)深圳市坪山區(qū)婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴年齡≤14歲；⑵在深圳市坪山區(qū)婦幼保健院行包皮手術(shù)且包皮標(biāo)本送病理學(xué)檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴術(shù)前包皮有外傷或藥物應(yīng)用病史者；⑵有包皮手術(shù)史者。

1.2 試劑 CD4+T細(xì)胞鼠抗人單克隆抗體、CD8+T細(xì)胞鼠抗人單克隆抗體、FOXP3+T細(xì)胞鼠抗人單克隆抗體均購于Abcam。酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（IFN-γ、IL-4、TGF-β2）購于上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè) 取包皮組織于10%甲醛固定、石蠟包埋、切片、脫蠟、水化，乙二胺四乙酸修復(fù)，3%過氧化氫封閉；一抗孵育（CD4+1∶200；CD8+1∶250；FOXP3+1∶150），于4 ℃濕盒中封閉過夜；二抗（山羊抗兔FITC 1∶50）室溫60 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染1 min，脫水、封片，待干后置于顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍片記錄。

1.3.2 ELISA檢測(cè) 按照相應(yīng)ELISA試劑盒說明書，檢測(cè)包皮組織IFN-γ、IL-4、TGF-β2水平，于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值并計(jì)算。

1.3.3 結(jié)果判定 CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)定位于T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜/漿，F(xiàn)OXP3+主要表達(dá)于T淋巴細(xì)胞核中，細(xì)胞漿僅見少數(shù)表達(dá)。陽性細(xì)胞染色呈棕褐色或棕黃，分布定位于真皮層。利用MetaMorph顯微圖像分析系統(tǒng)在20倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野下的陽性細(xì)胞，計(jì)算平均數(shù)值。

1.4 觀察指標(biāo) ⑴比較CD4+、CD8+、FOXP3+T淋巴細(xì)胞在BXO典型皮損組織中的數(shù)量、比例變化情況。⑵比較IFN-γ、IL-4、TGF-β2在BXO典型皮損組織中的表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（x）表示，行t檢驗(yàn)。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以Plt;0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD4+、CD8+、FOXP3+T淋巴細(xì)胞在BXO典型皮損組織中的數(shù)量、比例變化情況比較 利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD4+、CD8+、FOXP3+T淋巴細(xì)胞在BXO早期、中期、晚期組中均有表達(dá)，見圖1。與生理性包莖組比較，BXO典型皮損組織中CD4+、CD8+、FOXP3+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量明顯增多，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.01）；在各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)，與CD8+、FOXP3+T淋巴細(xì)胞比較，CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增多，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01）；與BXO早期、晚期組比較，在BXO中期組中CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增多，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01），見圖2。

2.2 IFN-γ、IL-4、TGF-β2在BXO典型皮損組織中的表達(dá)情況比較 利用 ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與生理性包莖組比較，INF-γ在BXO晚期組中的表達(dá)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；TGF-β2在BXO早期、BXO中期組的表達(dá)量均明顯增加，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01）。與生理性包莖組比較，IL-4在BXO晚期組中的表達(dá)量明顯增加，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01），見圖3。

3 討論

BXO又稱男性生殖器硬化性苔蘚樣?。╩ale genital lichen sclerosus，MGLSc），是一種伴有皮膚萎縮硬化的慢性疾病，在疾病早期，患者可能沒有明顯的癥狀。然而，隨著病情的發(fā)展，可能會(huì)出現(xiàn)一些明顯的體征和癥狀，包括包皮口瘢痕狹窄，上翻包皮困難，反復(fù)出現(xiàn)排尿疼痛、 出血等，此外，包皮皮膚黏膜可能會(huì)分泌膿性分泌物，并伴有瘙癢、刺痛、燒灼感。BXO還可能導(dǎo)致一些嚴(yán)重的并發(fā)癥，如病損可能侵犯尿道外口，導(dǎo)致外口狹窄，進(jìn)而引發(fā)廣泛纖維化，形成尿道狹窄，可能會(huì)影響患者的排尿功能，導(dǎo)致尿頻、尿急等癥狀。在嚴(yán)重的情況下，甚至可能出現(xiàn)膀胱殘余尿增多、上尿路積水，甚至腎功能損害的情況[2]。

BXO涵蓋了三個(gè)主要的臨床病理表現(xiàn)，分別是陰莖龜頭的慢性炎癥、病變部位異常干燥的外觀和陰莖頭皮下的動(dòng)脈內(nèi)膜炎表現(xiàn)。既往研究認(rèn)為，組織病理檢查是診斷BXO的金標(biāo)準(zhǔn)，典型的病理改變?yōu)楸砥み^度角化，淋巴細(xì)胞浸潤帶以上真皮層可見大量的膠原均質(zhì)化改變[3]。同時(shí)，也有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)臨床疑似病例中，BXO的病理學(xué)診斷陽性率差別較大，在0%～88%[2]。在臨床工作中發(fā)現(xiàn)部分疑似病例中未見典型BXO組織病理學(xué)改變，僅出現(xiàn)基底細(xì)胞空泡化改變，基底細(xì)胞下淋巴細(xì)胞呈巢狀分布。在近3年的隨訪中發(fā)現(xiàn)這些疑似病例陸續(xù)出現(xiàn)尿線細(xì)、排尿時(shí)間延長(zhǎng)、尿道外口膜狀狹窄，證實(shí)BXO病例的診斷需臨床與病理相結(jié)合，早期BXO僅表現(xiàn)為基底細(xì)胞改變及少量淋巴細(xì)胞浸潤[3]。

兒童BXO發(fā)病率在逐年升高[1]，Alyami等[4]研究發(fā)現(xiàn)BXO占所有行包皮病理檢查的35%，說明了兒童BXO的發(fā)病率不容小覷。但目前對(duì)于兒童BXO的發(fā)病機(jī)制仍不明確。有研究發(fā)現(xiàn)兒童BXO基因表達(dá)譜中表達(dá)增加的基因大多與免疫應(yīng)答相關(guān)，包括抗原處理、淋巴細(xì)胞活化、趨化因子活性、T細(xì)胞活化調(diào)節(jié)和凋亡，并認(rèn)為兒童BXO可能是一種慢性特異性炎癥性疾病[2]。在臨床中也發(fā)現(xiàn)應(yīng)用抑制T細(xì)胞功能的藥物（如糠酸莫米松乳膏、醋酸氟輕松軟膏等）對(duì)BXO治療有益[5-6]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BXO早期、中期、晚期組中CD4+、CD8+、FOXP3+T淋巴細(xì)胞均有表達(dá)，BXO典型皮損組織中CD4+、CD8+、FOXP3+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量明顯增多。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)，與CD8+、FOXP3+T淋巴細(xì)胞比較，CD4+T細(xì)胞數(shù)量明顯增多。以上結(jié)果說明兒童BXO的病理過程可能與T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答相關(guān)，免疫應(yīng)答中CD4+T細(xì)胞可能起主導(dǎo)作用，可調(diào)節(jié)和協(xié)調(diào)免疫系統(tǒng)的應(yīng)答。這與既往和BXO有類似皮損病變的外生殖器硬化性苔蘚樣病（lichen sclerosus，LS）的研究一致[7]。在既往研究中發(fā)現(xiàn)臨床和病理診斷BXO的病例在術(shù)后被確診為過敏性紫癜，因此推測(cè)兒童BXO病變可能與LS有類似的發(fā)病機(jī)制，可能與自身免疫狀態(tài)存在相關(guān)性，可以考慮采用與LS相似的治療手段來治療兒童BXO[8]。未來的研究應(yīng)致力于進(jìn)一步闡明BXO與LS之間的確切關(guān)系，并開發(fā)針對(duì)性的治療方案。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，INF-γ在BXO晚期組中的表達(dá)量增加，這與BXO晚期大體標(biāo)本中典型的包皮口環(huán)狀瘢痕增生以及真皮層均質(zhì)化的膠原增生一致。推測(cè)INF-γ可能誘導(dǎo)并維持BXO的炎癥反應(yīng)，并通過促纖維化或抗纖維化作用影響B(tài)XO纖維化及瘢痕形成[9-10]。Th1細(xì)胞能合成IFN-γ、白細(xì)胞介素2（IL-2）等介導(dǎo)細(xì)胞毒效應(yīng)起到抗胞內(nèi)感染作用，支持BXO的病理過程與Th1細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答密切相關(guān)。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，IL-4在BXO晚期組中的表達(dá)量明顯增加。IL-4是主要介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖、分化為漿細(xì)胞[11]，IL-4作為一種關(guān)鍵的細(xì)胞因子，在體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮著不可替代的作用，其通過促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的增殖和分化為漿細(xì)胞，增強(qiáng)了機(jī)體的抗體產(chǎn)生能力，從而幫助機(jī)體更好地清除病原體，其水平升高說明在兒童BXO晚期可能體液免疫模式（Th2型）參與免疫應(yīng)答。

TGF-β2作為具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子，決定T細(xì)胞分化結(jié)局。高濃度TGF-β2可誘導(dǎo)具有免疫應(yīng)答低下和免疫抑制功能特征的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）表達(dá)FOXP3，產(chǎn)生FOXP3+T細(xì)胞[12-13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGF-β2在BXO早期、BXO中期組中表達(dá)量均明顯增加，與FOXP3+T細(xì)胞的表達(dá)一致。

本研究發(fā)現(xiàn)包皮組織微環(huán)境中T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量及功能與疾病的發(fā)生、發(fā)展密切關(guān)聯(lián)。CD4+T細(xì)胞在兒童BXO疾病發(fā)生、發(fā)展中可能起主要作用，IFN-γ、TGF-β2、IL-4可能是T細(xì)胞在BXO的疾病進(jìn)展中產(chǎn)生的重要細(xì)胞因子。兒童BXO早期、中期可能以Th1型為主，在兒童BXO晚期常見的免疫應(yīng)答為Th1型、Th2型。

參考文獻(xiàn)

張羽萌.干燥閉塞性陰莖頭炎臨床研究進(jìn)展[J].臨床泌尿外科雜志， 2015， 30（2）： 183-187.

EDMONDS E， BARTON G， BUISSON S， et al. Gene expression profiling in male genital lichen sclerosus[J]. Int J Exp Pathol， 2011， 92（5）： 320-325.

趙冬艷，唐達(dá)星，徐珊，等.干燥性閉塞性龜頭炎兒童時(shí)期發(fā)病特點(diǎn)分析[J].臨床小兒外科雜志， 2018， 17（1）： 34-37.

ALYAMI F A， BATENI Z H， ODEH R， et al. Routine histopathological examination of the foreskin after circumcision for clinically suspected lichen sclerosus in children： Is it a waste of resources？ [J]. Can Urol Assoc J， 2018， 12（5）： E231-E233.

RUSSO T， CURRò M， BARBERA A， et al. Expression of transglutaminase in foreskin of children with balanitis xerotica obliterans[J]. Int J Mol Sci， 2016， 17（9）： 1551.

季鈴華，陳書清，曹國鋒，等.兒童病理性包莖184例臨床分析[J].交通醫(yī)學(xué)， 2023， 37（1）： 95-97.

呂軍，黃曉東.男性生殖器硬化性苔蘚樣病的診治現(xiàn)狀[J].中華男科學(xué)雜志， 2014， 20（7）： 579-585.

王玉蕓，林海.兒童病理性包莖的臨床特征分析[J].中華泌尿外科雜志， 2023， 44（7）： 529-532.

張鏇，鄧濤，張九鴻，等.兒童干燥閉塞性陰莖頭炎8例及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)[J].臨床小兒外科雜志， 2018， 17（7）： 514-518.

CURRò M， RUSSO T， FERLAZZO N， et al. Antiinflammatory and tissue regenerative effects of topical treatment with ozonated olive oil/vitamin e acetate in balanitis xerotica obliterans[J]. Molecules， 2018， 23（3）： 645.

NGUYEN A T M， HOLLAND A J A. Balanitis xerotica obliterans： An update for clinicians[J]. Eur J Pediatr， 2020， 179（1）： 9-16.

CHARLTON O A， SMITH S D. Balanitis xerotica obliterans： A review of diagnosis and management[J]. Int J Dermatol， 2019， 58（7）： 777-781.

金重睿，撒應(yīng)龍，張炯，等.男性生殖器硬化性苔蘚樣變致尿道狹窄合并尿道癌診治分析[J].中華泌尿外科雜志， 2021， 42（10）： 763-767.

基金項(xiàng)目：深圳市坪山區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)科研項(xiàng)目（編號(hào)：202086）；深圳市坪山區(qū)衛(wèi)生健康系統(tǒng)科研項(xiàng)目（編號(hào)：202270）

作者簡(jiǎn)介：平紅艷，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：先天性泌尿生殖系統(tǒng)疾病的診療。

通信作者：張鏇，博士研究生，主任醫(yī)師，研究方向：先天性泌尿生殖系統(tǒng)疾病的診療。E-mail：zhxuan2006@126.com