摘要：試驗(yàn)采用羅丹明B作顯色劑測定了古代養(yǎng)生方劑中常見的紅棗、當(dāng)歸、黃芩、五味子等4種中藥水提取物的抗氧化能力。結(jié)果表明，這些中藥水提取物對·OH都具有較強(qiáng)的清除作用，呈量效關(guān)系，其中紅棗的清除能力最強(qiáng)。據(jù)此評價(jià)其水提取物的抗氧化能力大小順序?yàn)椋杭t棗>當(dāng)歸>黃芩>五味子。

關(guān)鍵詞：中藥養(yǎng)生方劑；水提取物；·OH；抗氧化能力

中圖分類號：TQ461 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）18-4484-02

在中國古代，人們都很重視養(yǎng)生，出現(xiàn)了很多養(yǎng)生中藥方劑。這些方劑可以調(diào)節(jié)人體機(jī)體狀態(tài)，增進(jìn)健康，延緩衰老。中醫(yī)認(rèn)為，人體健康長壽很重要的條件是先天稟賦強(qiáng)盛，后天營養(yǎng)充足。脾胃為后天之本，氣血生化之源，機(jī)體生命活動(dòng)需要的營養(yǎng)，都要靠脾胃供給[1]。正因?yàn)槿绱?，眾多的養(yǎng)生方劑中護(hù)脾養(yǎng)胃類的中藥使用較多，本研究采用分光光度法測定了常見的4種護(hù)脾養(yǎng)胃中藥養(yǎng)生方劑水提取物對羥基自由基的清除能力，據(jù)此評價(jià)其抗氧化能力，操作簡便，測定快速。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：TU-1800PC型紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析公司）；PXS-270型精密離子計(jì)（上海精密儀器公司）；HH-1型恒溫水浴鍋（上海比朗儀器公司）。

試劑：H2O2（分析純）；羅丹明B（分析純）；FeSO4·7H2O（分析純）；鄰苯二甲酸氫鉀（分析純）；鹽酸（分析純）；去離子水。

樣品：紅棗、當(dāng)歸、黃芩、五味子均購于中藥房。

1.2 試驗(yàn)方法

樣品抗氧化能力的測定以H2O2和FeSO2·7H2O體系產(chǎn)生的·OH為檢測對象，通過在554 nm處檢測捕獲劑羅丹明B的吸光度進(jìn)行評價(jià)。由于·OH氧化能力強(qiáng)，可以快速地使羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度降低為A0，通過試驗(yàn)證明其降低的程度與·OH的含量有一定量效關(guān)系，因此可以通過這種降低程度實(shí)現(xiàn)對·OH的測定。中藥的水提取物可以有效清除體系產(chǎn)生的·OH，加入這些水提取物于羅丹明B體系中，使體系溶液吸光度下降的程度降低，其吸光度為AS，羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度為A，則清除率D按以下公式計(jì)算：

D=（AS-A0）/（A-A0）×100%[2]

從清除率的計(jì)算結(jié)果大小即可評價(jià)其抗氧化能力。

1.3 ·OH生成量的測定

準(zhǔn)確移取羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液7.00 mL（2×10-4 mol/L）和鄰苯二甲酸氫鉀-HCl溶液10.0 mL（pH 2.5）2份于兩支50 mL容量瓶中，向其中一容量瓶再加入FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0 mL（5×10-3 mol/L）和H2O2標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0 mL（2×10-2 mol/L），另一容量瓶不加，以去離子水定容至50 mL，靜置5 min待反應(yīng)充分后，在554 nm處分別測定這兩種溶液的吸光度A0和A，間接測定體系中的·OH。

1.4 樣品的測定

1.4.1 樣品的提取 取4種中藥樣品若干，經(jīng)過烘干粉碎后，分別準(zhǔn)確稱取1.00 g于4個(gè)錐形瓶中，各加去離子水100 mL，用文火煮沸40 min后，趁熱過濾，濾液轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，并將濾渣用熱水沖洗3次，與濾液合并，待溶液冷卻后以去離子水定容[3]。

1.4.2 樣品測定 將提取好的樣品溶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋測定即：紅棗（0.10 g/L）、當(dāng)歸（0.20 g/L）、黃芩（0.40 g/L）、五味子（0.40 g/L）。在測定·OH生成量體系中分別加入稀釋后的樣品溶液各0.20、0.50 、1.00、2.00 mL，在554 nm處測定其吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳檢測波長的確定

分別測定羅丹明B溶液和羅丹明B-Fe2+-2H2O2體系溶液的紫外可見吸收光譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)光譜圖的最大吸收波長均出現(xiàn)在554 nm處，而且羅丹明B-Fe2+-2H2O2體系的譜圖中的吸光度比羅丹明B溶液體系小，說明由Fe2+和H2O2作用產(chǎn)生的·OH與羅丹明B發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致吸光度下降，因此在554 nm處即可對·OH進(jìn)行測定。

2.2 酸度的選擇

用配制好的緩沖溶液調(diào)節(jié)羅丹明B-Fe2+-2H2O2體系的pH分別為2.0、2.5、3.0、4.0、5.0。

測定在不同pH環(huán)境下體系的ΔA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在pH=2.5時(shí)ΔA值最大，確定試驗(yàn)在pH 2.5條件下進(jìn)行效果最佳。

2.3 FeSO4加入量的選擇

在其他測定條件不變情況下分別加入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液（5×10-3 mol/L），隨著體積的增加，體系ΔA值也不斷增大，但加入FeSO4體積達(dá)到5.0 mL時(shí)，ΔA的值趨于穩(wěn)定。故本試驗(yàn)中FeSO4溶液最佳用量為5.0 mL。

2.4 H2O2加入量的選擇

在最佳其他條件下，考察了H2O2加入量對檢測結(jié)果的影響，試驗(yàn)表明當(dāng)H2O2加入量達(dá)到5.00 mL后，繼續(xù)再增大加入體積，體系ΔA值基本不變，因此試驗(yàn)采用H2O2溶液最佳加入量為5.00 mL。

2.5 羅丹明B加入量的選擇

在以上最佳條件下分別加入不同體積的羅丹明B溶液，根據(jù)試驗(yàn)確定的檢測方法測定空白參比溶液和·OH反應(yīng)體系的吸光度。結(jié)果表明，ΔA值隨羅丹明B用量的增大而增大，但當(dāng)羅丹明B用量超過7.00 mL時(shí)，空白參比溶液的吸光度太大，超出正常讀數(shù)范圍，影響檢測結(jié)果，因此選擇羅丹明B最佳用量為7.00 mL。

2.6 試劑加入順序試驗(yàn)

由于·OH存在時(shí)間非常短，試驗(yàn)中各種試劑加入的先后順序?qū)y定結(jié)果有很大的影響，因此必須考慮加入試劑的順序。在該方法中羅丹明B是作為顯色劑來測定體系產(chǎn)生的·OH，試驗(yàn)中必須保證

·OH能與顯色劑羅丹明B充分發(fā)生反應(yīng)，所以顯色劑羅丹明B的加入應(yīng)該先于·OH產(chǎn)生之前加入，因此試驗(yàn)最后一步再加入H2O2以產(chǎn)生羥基自由基。

2.7 檢測時(shí)間確定

在上面所選定的最佳條件下對體系吸光度進(jìn)行測定，每隔1 min讀一次數(shù)值，觀察測定結(jié)果與時(shí)間的變化情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，在1～5 min內(nèi)，體系的吸光度迅速下降，在5～10 min范圍內(nèi)，吸光度基本無變化即反應(yīng)完全，所以選擇最佳的反應(yīng)時(shí)間為5 min。

2.8 測定結(jié)果

在試驗(yàn)所確定的最佳試驗(yàn)條件下分別測定了古代養(yǎng)生方劑中常見4種中藥水提取物對·OH的清除能力，其測定結(jié)果見表1。由表1可以看出，紅棗、當(dāng)歸、黃芩、五味子水提取物對·OH清除作用均呈量效關(guān)系，有較強(qiáng)的抗氧化能力，其中紅棗提取物的清除能力表現(xiàn)為最強(qiáng)，當(dāng)歸、黃芩次之，五味子最弱，據(jù)此評價(jià)了其抗氧化能力。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH，并與顯色劑羅丹明B發(fā)生反應(yīng)，使其吸光度降低。養(yǎng)生方劑中常見4種中藥水提取物可以清除體系產(chǎn)生的·OH，使體系吸光度下降程度減弱，減弱程度與樣品抗氧化能力有關(guān)。試驗(yàn)測定結(jié)果表明，4種中藥水提取物對·OH都具有較強(qiáng)的清除作用，而且所有樣品提取物清除率均隨其濃度的增大而增大呈現(xiàn)一定量效關(guān)系，具有很好的抗氧化能力，其中紅棗抗氧化能力最強(qiáng)。本試驗(yàn)選取了常用古代養(yǎng)生方劑中常見4種中藥，得到了其提取物的抗氧化能力大小順序，對養(yǎng)生方劑的養(yǎng)生機(jī)理的解釋有一定的幫助。該試驗(yàn)方法評價(jià)樣品抗氧化能力，操作簡便，測定快速，對尋找和篩選天然抗氧化劑資源很有實(shí)際意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張苗海.未病與漢方研究[J].國外醫(yī)學(xué)（中醫(yī)中藥分冊），2005， 26（4）：207-211.

[2] 王征帆.11種中草藥水提物抗氧化活性研究[J].應(yīng)用化工，2011，40（9）：1563-1568.

[3] 張愛梅，劉妮娜.羅丹明B-Mn2+-H2O2體系同步熒光分光光度法測定中藥的抗氧化活性[J].理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊，2007，43（4）：280-282.