[摘要]"目的"探究β-谷甾醇對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖和凋亡的影響及其對(duì)磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide"3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein"kinase"B，PKB，又稱Akt）信號(hào)通路的調(diào)控作用。方法"體外培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116并分為β-谷甾醇高（240μmol/L）、中（120μmol/L）、低劑量（60μmol/L）組，設(shè)置空白對(duì)照組（0μmol/L）。應(yīng)用不同濃度的β-谷甾醇處理HCT116細(xì)胞。24h后應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（cell"counting"kit-8，CCK-8）法檢測(cè)β-谷甾醇對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響，并在顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化；應(yīng)用Hoechst"33342細(xì)胞核染色法檢測(cè)β-谷甾醇對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡的影響；應(yīng)用細(xì)胞克隆集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HCT116細(xì)胞的集落形成能力；應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)HCT116細(xì)胞中PI3K、磷酸化Akt、Akt、抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax等相關(guān)蛋白的表達(dá)情況；利用AutoDock軟件實(shí)現(xiàn)β-谷甾醇與PI3K和Akt蛋白的分子對(duì)接。結(jié)果"與對(duì)照組比較，β-谷甾醇可濃度依賴性地抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的增殖，抑制細(xì)胞的集落形成能力，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡；抑制HCT116細(xì)胞中磷酸化Akt、PI3K、Bcl-2蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Bax蛋白的表達(dá)；β-谷甾醇與PI3K、Akt蛋白的結(jié)合均較為穩(wěn)定。結(jié)論"β-谷甾醇可通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)HCT116細(xì)胞的增殖與凋亡。

[關(guān)鍵詞]"β-谷甾醇；結(jié)腸癌；增殖；凋亡；信號(hào)通路

[中圖分類號(hào)]"R285""""""[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.09.019

Effects"of"β-sitosterol"on"proliferation"and"apoptosis"of"colon"cancer"cell"HCT116

CHEN"Xi，"LI"Ruonan，"LI"Jing，"ZHAO"Lina，"XU"Zhili

College"of"Pharmacy，"Liaoning"University"of"Traditional"Chinese"Medicine，"Dalian"116600，"Liaoning，"China

[Abstract]"Objective"To"investigate"the"effects"of"β-sitosterol"on"the"proliferation"and"apoptosis"of"colon"cancer"cell"HCT116，"and"its"regulation"of"on"phosphoinositide"3-kinase/protein"kinase"B"（PI3K/Akt）"signaling"pathway."Methods"Cultivated"colon"cancer"cells"HCT116"in"vitro"and"divided"them"into"β-sitosterol"High"（240μmol/L）、medium"（120μmol/L）"and"low-dose"（60μmol/L）"groups，"set"control"group"（0μmol/L）."Applied"different"concentrations"of"β-sitosterol"treatment"of"HCT116"cells."And"24h"later，"the"cell"proliferation"and"activity"were"determined"by"cell"counting"kit-8"（CCK-8）"method，"the"morphological"changes"observed"under"a"microscope;"Cell"apoptosis"was"observed"by"Hoechst"33342"nuclear"staining;"Used"cell"colony"formation"assy"to"detect"the"colony"forming"ability"of"HCT116"cells;"and"Western"blot"was"used"to"evaluate"the"expression"of"PI3K，"p-Akt，"Akt，"Bcl-2"and"Bax"in"cells."Used"AutoDock"software"for"molecular"docking"of"β-sitosterol"with"Akt"and"PI3K."Results"Compared"with"the"control"group，"β-sitosterol"could"inhibit"the"proliferation"of"colon"cancer"HCT116"cells"in"a"concentration"dependent"manner"，inhibit"their"colony"forming"ability"and"promote"cell"apoptosis"and"inhibit"the"expression"of"p-Akt、"PI3K、and"Bcl-2"proteins"in"HCT116"cells"and"promotes"the"expression"of"Bax"protein."The"binding"of"β-sitosterol"with"PI3K"and"Akt"proteins"is"relatively"stable."Conclusion"β-sitosterol"may"regulate"the"proliferation"and"apoptosis"of"HCT116"through"inhibiting"PI3K/Akt"signaling"pathway.

[Key"words]"β-sitosterol;"Colon"cancer;"Proliferation;"Apoptosis;"Signaling"pathway

結(jié)腸癌（colon"cancer，CRC）是全球第3大高發(fā)腫瘤，其患病率和病死率逐年增加[1]。據(jù)估計(jì)，2030年全球新發(fā)CRC患者將增至220萬例[2]。目前，手術(shù)治療、化療、免疫治療等在CRC的臨床診治中獲得較好效果，但腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或產(chǎn)生嚴(yán)重并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)仍較高。而中醫(yī)藥相關(guān)研究與藥物研發(fā)成為CRC臨床和基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)之一。

β-谷甾醇呈白色粉末狀，多種中藥材可分離出β-谷甾醇，其分子式為C29H50O[3-4]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇具有抑制多種類型腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性，如卵巢癌、結(jié)腸癌、前列腺癌及肺癌[5-8]。本研究旨在探討β-谷甾醇對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖和凋亡的影響，并探索其對(duì)磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide"3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein"kinase"B，PKB，又稱Akt）信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。

1""材料與方法

1.1""材料

人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；β-谷甾醇（純度≥98%，貨號(hào)：SS8580）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（cell"counting"kit-8，CCK-8，貨號(hào)：CA1210）、胎牛血清（貨號(hào)：S9020）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Hoechst"33342染色液、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Akt、PI3K、磷酸化Akt（p-Akt）、促凋亡蛋白Bax、抑凋亡蛋白Bcl-2、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體、辣根過氧化物酶（horseradish"peroxidase，HRP）標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin"G，IgG）二抗購(gòu)自沈陽(yáng)萬類生物科技有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic"acid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；全蛋白提取檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：20201120）購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司；McCoy's"5A完全培養(yǎng)基（貨號(hào)：PM150710）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司；熒光倒置顯微鏡購(gòu)自尼康科技有限公司；電泳儀購(gòu)自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；半干法轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；MR-96A型酶標(biāo)儀購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.2""方法

1.2.1""細(xì)胞培養(yǎng)""將人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116培養(yǎng)于含1%青霉素、1%鏈霉素、10%胎牛血清的McCoy’s"5A培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。給藥組分為β-谷甾醇高（240μmol/L）、中（120μmol/L）、低劑量（60μmol/L）組，并設(shè)置對(duì)照組（0μmol/L）。根據(jù)CCK-8法增殖實(shí)驗(yàn)，本研究確定60μmol/L、120μmol/L、240μmol/L為β-谷甾醇的有效給藥濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2""細(xì)胞形態(tài)觀察""收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至8×104個(gè)/ml，接種于24孔板中培養(yǎng)過夜。對(duì)照組加入適量培養(yǎng)基，給藥組分別加入等體積的含有濃度為60μmol/L、120μmol/L、240μmol/L的β-谷甾醇培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，在熒光倒置顯微鏡下觀察對(duì)照組及給藥組細(xì)胞的形態(tài)，并拍照記錄。

1.2.3""CCK-8法檢測(cè)HCT116細(xì)胞增殖""將HCT116細(xì)胞接種于96孔板中（空白孔不接種細(xì)胞），設(shè)置對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用β-谷甾醇濃度分別為15、30、60、120、240μmol/L的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。24h后每孔中加入10μl的CCK-8試劑，在培養(yǎng)箱中孵育2h。使用酶標(biāo)儀測(cè)量450nm波長(zhǎng)處各孔細(xì)胞的光密度（optical"density，OD）值，并計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=[（給藥組OD值–對(duì)照組OD值）/（對(duì)照組OD值–空白孔OD值）]×100%。

1.2.4""克隆集落形成實(shí)驗(yàn)""將密度為5×103個(gè)/ml的細(xì)胞接種于6孔板中并培養(yǎng)過夜。給藥方法同1.2.2，孵育24h后，更換新鮮培養(yǎng)基再培養(yǎng)14d，其間每3d換液1次。待細(xì)胞集落形成至合適大小時(shí)，吸棄原培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（phosphate"buffer"solution，PBS）洗滌2次，然后將細(xì)胞集落固定于4%多聚甲醛中30min，棄液后PBS洗滌2次，蘇木精溶液染色15min，棄染色液，PBS洗滌2～3次，用光鏡計(jì)數(shù)含有50個(gè)以上細(xì)胞的集落數(shù)。

1.2.5""Hoechst33342細(xì)胞核染色法""將密度為2×104個(gè)/ml的細(xì)胞接種于24孔板中并培養(yǎng)過夜。給藥方法同1.2.2，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min，PBS洗滌2次，每孔加入100μl的Hoechst33342，于室溫避光染色15min，去除染色液并用PBS洗滌2次，使用熒光倒置顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.2.6""蛋白質(zhì)印跡（Western"blot，WB）檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)""調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml接種于6孔板中，給藥方法同1.2.2，24h后提取總蛋白。用預(yù)冷的1×PBS溶液洗滌3次后，根據(jù)說明書按比例加入含PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解30min，4℃環(huán)境中以12"000轉(zhuǎn)/min離心15min，小心吸取上清液得全蛋白提取物。BCA法調(diào)整各組蛋白濃度，使各組蛋白樣品終濃度統(tǒng)一。應(yīng)用WB技術(shù)檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。采用恒壓法進(jìn)行電泳，樣品在濃縮膠中電壓控制為80V，當(dāng)樣品開始進(jìn)入分離膠時(shí)改電壓為120V，上樣蛋白量30μg。電泳結(jié)束后，進(jìn)行半干法轉(zhuǎn)膜，以“濾紙-PVDF膜-凝膠-濾紙”順序從下到上疊好，接通電源，25V轉(zhuǎn)膜，依據(jù)分子量大小確定轉(zhuǎn)膜時(shí)間。用5%脫脂奶粉溶液封閉2h，加入相應(yīng)的一抗（1∶500）孵育（4℃冰箱過夜）。PBST洗膜（4次），HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（1∶800）室溫孵育2h，PBST洗膜（4次），ECL化學(xué)發(fā)光法顯影并采集圖像，Image"J軟件進(jìn)行灰度值分析并計(jì)算各個(gè)蛋白條帶的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.7""分子對(duì)接""在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中下載β-谷甾醇的2D結(jié)構(gòu)、RSCBPDB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載PI3K/Akt蛋白的2D結(jié)構(gòu)[9-10]。利用AutoDock"4.2軟件對(duì)基因分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行半柔性結(jié)合分子對(duì)接。

1.3""統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS"21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（"）表示，采用單因素方差分析。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2""結(jié)果

2.1""β-谷甾醇對(duì)HCT116細(xì)胞形態(tài)影響的比較

對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞邊界清晰；與給藥組比較，對(duì)照組細(xì)胞的密度最大；給藥組隨著β-谷甾醇給藥濃度的增加，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生不同程度的變化，如細(xì)胞邊界模糊、細(xì)胞皺縮變小的程度逐漸加深，細(xì)胞貼壁能力減弱，細(xì)胞膜破裂、胞質(zhì)降解的程度逐漸加深，見圖1。

2.2""β-谷甾醇對(duì)HCT116細(xì)胞增殖影響的比較

與對(duì)照組比較，給藥組處理人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞24h時(shí)，細(xì)胞增殖抑制作用的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。半數(shù)抑制濃度（half"maximal"inhibitory"concentration，IC50）為192.21μmol/L，見圖2。

與對(duì)照組比較，給藥組的HCT116細(xì)胞集落形成能力受到顯著抑制，且隨劑量的增加，集落形成能力逐漸減弱，見圖3。

2.3""β-谷甾醇對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡影響的比較

與對(duì)照組比較，給藥組的HCT116細(xì)胞表現(xiàn)出凋亡早期染色質(zhì)濃密的特征，發(fā)出亮藍(lán)色熒光的細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，細(xì)胞核分布不均且相對(duì)集中的程度逐漸加深。Hoechst33342細(xì)胞核染色結(jié)果見圖4。

2.4""相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

與對(duì)照組比較，給藥組的HCT116細(xì)胞中PI3K蛋白的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01），各濃度組的p-Akt與Bcl-2蛋白的表達(dá)水平逐漸降低（Plt;0.01），Bax蛋白的表達(dá)水平逐漸升高（Plt;0.01）。p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白在β-谷甾醇濃度為240μmol/L時(shí)變化最為顯著，見圖5。結(jié)果表明，β-谷甾醇可調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)而誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡。

2.5""分子對(duì)接

β-谷甾醇與PI3K和Akt的對(duì)接結(jié)果分別為–7.48kcal/mol和–8.19kcal/mol。β-谷甾醇與PI3K的殘基ASPA∶316和PROA∶313存在氫鍵結(jié)合，有利于結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。β-谷甾醇與PI3K和Akt殘基間存在Alkyl和Pi-Alkyl相互作用。上述作用力使結(jié)合能降低、親和力增加，見圖6。

3""討論

結(jié)腸癌是一種惡性上皮腫瘤，由多種因素誘發(fā)，包括遺傳、環(huán)境污染和其他致癌因素。全球每年新發(fā)病例超過4萬例，占所有惡性腫瘤的10%～15%[11]。研究表明，中草藥在腫瘤治療的整個(gè)過程中發(fā)揮重要作用，其可抑制腫瘤進(jìn)展、緩解手術(shù)并發(fā)癥、增加化學(xué)治療和放射治療的敏感度、減輕手術(shù)等治療的損害[12]。

PI3K/Akt信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡中扮演重要角色[13]?；罨腁kt可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、運(yùn)動(dòng)、存活和凋亡。研究表明，磷酸酶及張力蛋白同源物等突變均可導(dǎo)致PI3K信號(hào)通路的異常激活[14]。因此，上述信號(hào)通路是結(jié)腸癌治療的潛在靶點(diǎn)。臨床研究表明，靶向PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制劑對(duì)腫瘤的治療有積極作用[15]。

本研究結(jié)果表明，β-谷甾醇可降低HCT116細(xì)胞的活力，抑制HCT116細(xì)胞的增殖，且可降低HCT116細(xì)胞的集落形成能力。WB研究表明，β-谷甾醇可降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，增加促凋亡蛋白Bax的表達(dá)。上述結(jié)果表明，HCT116是結(jié)腸癌的潛在抗癌劑。基于PI3K/Akt信號(hào)通路、細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，推斷β-谷甾醇可靶向調(diào)控PI3K相關(guān)分子，并可能參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。β-谷甾醇與PI3K和Akt蛋白分子對(duì)接結(jié)果良好。綜上，β-谷甾醇是治療結(jié)腸癌的潛在藥物，其機(jī)制可能是通過影響PI3K/Akt信號(hào)通路的相關(guān)蛋白。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻(xiàn)]

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