王淑江 龍勝利

基金項(xiàng)目：貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究課題（編號(hào)：QZYY-2023-149）

作者簡介：王淑江（1997.7-），男，貴州安順人，碩士研究生，主要從事中醫(yī)骨傷科學(xué)（脊柱外科方向）研究

通訊作者：龍勝利（1969.7-），男，貴州榕江人，本科，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，副院長，主要從事脊柱外科方面的研究

摘要：目的? 利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù)探討烏頭湯治療腰椎間盤突出癥（LDH）的作用機(jī)制。方法? 使用TCMSP篩選出烏頭湯的有效活性成分和靶點(diǎn)信息，并將其轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的基因名；從GeneCard和OMIM數(shù)據(jù)庫中獲得LDH的靶點(diǎn)，利用Venny圖獲得二者共同靶點(diǎn)。利用Cytscape構(gòu)建“中藥-活性成分-疾病靶點(diǎn)”及PPI網(wǎng)絡(luò)圖，利用R軟件進(jìn)行GO和KEGG富集分析，最后對有效活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接。結(jié)果? 獲得烏頭湯治療LDH的有效活性成分151個(gè)、共同靶點(diǎn)52個(gè)。網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果顯示，核心活性成分包括槲皮素、山奈酚、木犀草素等，關(guān)鍵靶點(diǎn)包括IL6、TNF、AKT1、IL1B、VEGFA、MMP9等。KEGG通路主要涉及AGE-RAGE、IL-17、TNF等信號(hào)通路。分子對接結(jié)果顯示，有效活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間結(jié)合性良好。結(jié)論? 烏頭湯通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路來治療LDH，可為烏頭湯后續(xù)臨床應(yīng)用及研究提供依據(jù)與思路。

關(guān)鍵詞：烏頭湯；腰椎間盤突出癥；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對接

中圖分類號(hào)：R285? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.09.003

文章編號(hào)：1006-1959（2024）09-0016-07

Network Pharmacology Study on the Mechanism of Wutou Decoction

in the Treatment of Lumbar Disc Herniation

WANG Shu-jiang1，LONG Sheng-li2

（1.Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550002，Guizhou，China;

2.Guiyang Fourth People's Hospital，Guiyang 550007，Guizhou，China）

Abstract：Objective? To explore the mechanism of Wutou decoction in the treatment of lumbar disc herniation （LDH） by using network pharmacology and molecular docking technology.Methods? TCMSP was used to screen out the effective active ingredients and target information of Wutou decoction， and convert them into corresponding gene names; the targets of LDH were obtained from the GeneCard and OMIM databases， and the common targets of the two were obtained by Venny plot. Cytscape was used to construct a "Chinese medicine-active ingredient-disease target" and PPI network diagram， and R software was used to perform GO and KEGG enrichment analysis. Finally， molecular docking of effective active ingredients and key targets was performed.Results? A total of 151 effective active components and 52 common targets of Wutou decoction in the treatment of LDH were obtained. The results of the network diagram showed that the core active components included quercetin， kaempferol， luteolin， etc.， and the key targets included IL6， TNF， AKT1， IL1 B， VEGFA， MMP9， etc. The KEGG pathway mainly involved AGE-RAGE， IL-17， TNF and other signaling pathways. The results of molecular docking showed that the binding between the effective active components and the key targets was good.Conclusion? Wutou decoction treats LDH through multi-component， multi-target and multi-pathway， which can provide basis and ideas for the follow-up clinical application and research of Wutou decoction.

Key words：Wutou decoction;Lumbar disc herniation;Network pharmacology;Molecular docking

腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation， LDH）是指以腰椎間盤退變、纖維環(huán)破裂、髓核突出壓迫神經(jīng)根而引起以腰腿部疼痛為主要癥狀的一種疾病[1]。該病發(fā)病率為20%～30%，且呈不斷上升和年輕化發(fā)展趨勢，如不加以干預(yù)，將會(huì)影響患者生活質(zhì)量[2，3]。目前對于LDH的治療主要分為手術(shù)和保守兩種，由于手術(shù)具有創(chuàng)傷大、術(shù)后易復(fù)發(fā)、患者難以接受，且干預(yù)率高等特點(diǎn)，大多數(shù)情況下建議患者采取保守治療[4，5]。LDH屬于中醫(yī)“痹證”“腰痛”等范疇。《素問·痹論》曰“所謂痹者，各以其時(shí)，重感于風(fēng)寒濕之氣也”，認(rèn)為痹證的發(fā)生與風(fēng)寒濕邪之間密切相關(guān)。烏頭湯作為歷代醫(yī)家治療痛痹的經(jīng)典方，具有溫經(jīng)散寒、除濕止痛的治療效果。吳健放等[6]運(yùn)用烏頭湯加味對LDH患者進(jìn)行治療，結(jié)果顯示其療效確切。雖然烏頭湯對于LDH的治療具有明確效果，但作用機(jī)制尚不明確，原因可能為烏頭湯所含活性成分偏多且復(fù)雜有關(guān)，因此對其作用機(jī)制闡釋困難?；诖?，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析解烏頭湯治療LDH的機(jī)制，以期為藥物臨床應(yīng)用及后續(xù)研究提供依據(jù)與思路。

1資料與方法

1.1烏頭湯活性成分篩選及基因名轉(zhuǎn)換? 運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform）依次檢索川烏、麻黃、黃芪、白芍、甘草的化學(xué)成分。以O(shè)B≥30%、OL≥0.18為篩選條件，獲得烏頭湯的有效活性成分。使用TCMSP附加查找功能尋找上述5味中藥的靶點(diǎn)信息，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）對上述靶點(diǎn)進(jìn)行基因名轉(zhuǎn)換，從而獲得烏頭湯的潛在靶點(diǎn)。

1.2 LDH疾病靶點(diǎn)篩選? 運(yùn)用GeneCards（https：//www.genecards.org/）和OMIM（https：//omim.org/）數(shù)據(jù)庫篩選疾病靶點(diǎn)，以“l(fā)umbar disc herniation”作為檢索詞，分別獲取LDH的疾病靶點(diǎn)，將靶點(diǎn)進(jìn)行匯總，對重復(fù)出現(xiàn)的靶點(diǎn)進(jìn)行刪除，將獲得疾病靶點(diǎn)進(jìn)行整理，以備后續(xù)使用。

1.3共同靶點(diǎn)篩選及中藥-活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建? 繪制烏頭湯潛在靶點(diǎn)和LDH疾病靶點(diǎn)的韋恩圖，從而獲得二者共同靶點(diǎn)。通過構(gòu)建相應(yīng)網(wǎng)絡(luò)文件，借助Cytoscape3.7.2得到“中藥-活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)degree值大小篩選出排名靠前活性成分，degree越大，則該活性成分重要性越強(qiáng)。

1.4蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建? 將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String（https：//cn.string-db.org/）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相應(yīng)設(shè)置，以“tsv”文件導(dǎo)出，將文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.2中進(jìn)行分析，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)具體degree值篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)，degree越大，則該靶點(diǎn)在治療過程中重要性越強(qiáng)。

1.5 GO功能富集和KEGG通路富集分析? 將共同靶點(diǎn)結(jié)果放入DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行GO功能富集與KEGG通路富集分析（P＜0.05）。根據(jù)P值大小制作相應(yīng)文件，利用R軟件對分析結(jié)果進(jìn)行圖像可視化。

1.6分子對接? 篩選出烏頭湯治療LDH的核心有效成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)，利用PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）獲取6個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)；Pubchem（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取3個(gè)核心有效成分的2D結(jié)構(gòu)。對成分及靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)處理，使用Autodock Tools1.5.6進(jìn)行分子對接，選擇最優(yōu)對接結(jié)果，最后通過Pymol2.4和Maestro11.5軟件對分子對接結(jié)果進(jìn)行可視化。

2結(jié)果

2.1烏頭湯活性成分篩選及基因名轉(zhuǎn)換? 運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫對5味中藥進(jìn)行活性成分篩選，獲得川烏、麻黃、黃芪、白芍、甘草的活性成分分別為3、23、20、13、92個(gè)，見表1。使用TCMSP的“Related Targets”功能，找到川烏對應(yīng)靶點(diǎn)6個(gè)，麻黃對應(yīng)靶點(diǎn)368個(gè)，黃芪對應(yīng)靶點(diǎn)325個(gè)，白芍對應(yīng)靶點(diǎn)89個(gè)，甘草對應(yīng)靶點(diǎn)1115個(gè)。通過UniProt數(shù)據(jù)庫對靶點(diǎn)基因名稱進(jìn)行尋找、刪除未找到對應(yīng)基因名稱的靶點(diǎn)后，最終獲得烏頭湯的潛在靶點(diǎn)203個(gè)。

2.2 LDH疾病靶點(diǎn)篩選? 以“Lumbar disc herniation”為檢索詞，從GeneCards和OMIM兩個(gè)數(shù)據(jù)庫中分別獲取LDH的疾病靶點(diǎn)，經(jīng)匯總和刪除重復(fù)值后，最終獲得疾病靶點(diǎn)513個(gè)。

2.3共同靶點(diǎn)篩選及中藥-活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建? 將烏頭湯潛在靶點(diǎn)與LDH疾病相關(guān)靶點(diǎn)在Venny2.1在線工具中取交集，最終獲得烏頭湯治療LDH共同靶點(diǎn)52個(gè)，包括IL6、TNF、AKT1、PTGS2、F3等，見圖1。利用Cytoscape3.7.2得到“中藥-活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，degree值排名前3的活性成分為E1、F1、MH5，即槲皮素、山奈酚和木犀草素，其degree值分別為129、57、23，推測這3種活性成分在烏頭湯治療LDH過程中發(fā)揮重要作用，見圖2。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析? 將52個(gè)共同靶點(diǎn)放入String11.5數(shù)據(jù)庫中，得到“tsv”文件，并導(dǎo)入Cytscape3.7.2中，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果顯示該網(wǎng)絡(luò)由52個(gè)靶點(diǎn)蛋白和1566條邊組成，排名前6的核心靶點(diǎn)分別為IL6、TNF、AKT1、IL1B、VEGFA和MMP9，其degree值分別是49、48、47、47、46、45，見圖3。

2.5 GO功能富集和KEGG通路富集分析? 運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫對藥物與疾病交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG分析，利用R軟件對分析結(jié)果進(jìn)行呈現(xiàn)。GO富集分析共獲得503個(gè)富集結(jié)果，其中細(xì)胞組分（CC）39個(gè)，涉及細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞外間隙、高分子復(fù)合物等；分子功能（MF）74個(gè)，涉及酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞因子活性等；生物過程（BP）390個(gè)，主要涉及基因表達(dá)的正向調(diào)控、炎癥反應(yīng)、缺氧反應(yīng)等。獲得KEGG通路富集分析結(jié)果共140個(gè)，其中AGE-RAGE、IL-17、TNF等信號(hào)通路在治療LDH的研究中受到廣泛關(guān)注。以P值大小作為篩選條件，選擇GO排名前10及KEGG排名前20的結(jié)果進(jìn)行柱狀圖和氣泡圖的構(gòu)建，見圖4、圖5。

2.6分子對接? 槲皮素、山奈酚和木犀草素為烏頭湯的核心活性成分，作為核心配體備用。IL6、TNF、AKT1、IL1B、VEGFA和MMP9為關(guān)鍵靶點(diǎn)，作為核心受體備用，其蛋白PDB ID分別為1ALU、3CQU、1BKC、7Z3W、6Z3F、1GKD。將3個(gè)配體與6個(gè)受體之間進(jìn)行分子對接，共有18種對接結(jié)果，其中3個(gè)核心活性成分與6個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)之間結(jié)合能均小于-5 kcal/mol，說明結(jié)合性良好，且槲皮素與AKT1的結(jié)合性最強(qiáng)，達(dá)到-8.83 kcal/mol，見表2。對每組結(jié)合能最強(qiáng)的結(jié)果進(jìn)行可視化，具體對接模式為：木犀草素與IL6、槲皮素與AKT1、木犀草素與TNF、山奈酚與IL1B、木犀草素與VEGFA、木犀草素與MMP9。

3討論

3.1烏頭湯治療LDH的研究基礎(chǔ)? 烏頭湯出自于《金匱要略》，為治療寒濕痹痛的經(jīng)典方。全方共有5味藥物，川烏祛風(fēng)除濕，溫經(jīng)止痛，為君；麻黃疏散風(fēng)寒、發(fā)汗宣痹，為臣；黃芪益氣固表，甘草、白芍緩急止痛，且甘草能夠緩解川烏的毒副作用，三者為臣。全方配伍嚴(yán)謹(jǐn)，功效顯著，對于LDH的治療具有明確效果[7]。覃接龍[8]對加減烏頭湯配合電針治療腰椎間盤突出癥的療效進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與單純使用電針組相比，觀察組在VAS評分、JOV評分、臨床療效方面更具優(yōu)勢。許力勇[9]研究發(fā)現(xiàn)，小針刀松解術(shù)聯(lián)合烏頭湯加味治療3周后，可改善腰椎間盤突出癥患者腰椎功能，減輕腰部疼痛。郭秋巖等[10]通過藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，烏頭湯能夠提高痛域值，降低炎性因子表達(dá)，對于神經(jīng)病理性疼痛具有治療作用。

3.2關(guān)鍵活性成分結(jié)果分析? LDH的病因相對復(fù)雜，其發(fā)病與椎間盤退變緊密相關(guān)。有研究表明[11]，炎性反應(yīng)是加速椎間盤退變進(jìn)程的原因之一。在此研究中，根據(jù)“中藥-活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖顯示，槲皮素、山奈酚和木犀草素度值較高，說明這3種成分在LDH的治療過程中可能發(fā)揮重要作用。槲皮素廣泛存在于黃芪、麻黃、甘草之中。研究表明[12，13]，槲皮素通過抑制TNF信號(hào)通路，降低TNF-α、IL6等相關(guān)炎癥介質(zhì)相對表達(dá)量，減輕炎性反應(yīng)；同時(shí)，其也能通過抑制MAPK/TLR4信號(hào)通路，減少炎性因子產(chǎn)生，最終達(dá)到減輕炎癥程度的作用[13]。山奈酚來源于麻黃、白芍、黃芪、甘草之中。研究發(fā)現(xiàn)[14，15]，山奈酚能夠通過抑制MAPK通路來緩解因IL1β刺激所引起的炎癥反應(yīng)。同時(shí)，其還可以通過降低促炎細(xì)胞因子IL6水平和通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB的細(xì)胞核易位，進(jìn)而增加抗炎細(xì)胞因子IL10的含量來減輕炎癥。木犀草素在麻黃中含量豐富，可以通過激活A(yù)MPK-Nrf2信號(hào)，抑制H2O2誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和氧化損傷，達(dá)到保護(hù)軟骨細(xì)胞、減輕骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展進(jìn)程的效果[16]。且木犀草素通過減少ROS和活性氮的產(chǎn)生，通過介導(dǎo)NF-κB、MAPK及AP-1等多種炎癥信號(hào)通路和減少花生四烯酸釋放，達(dá)到抑制炎癥細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)表達(dá)的作用[17]。

3.3關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)果分析? 在PPI網(wǎng)絡(luò)中顯示，IL6、TNF、AKT1、IL1B、VEGFA、MMP9可能是烏頭湯治療LDH的關(guān)鍵靶點(diǎn)。IL6作為一種常見炎癥介質(zhì)，與腰腿痛密切相關(guān)，通過降低機(jī)體的IL6水平可以達(dá)到減輕疼痛癥狀的作用[18]。IL6可以激活JAK/STAT3通路，增加COX-2和MMP-13的表達(dá)，引起椎間盤退變的發(fā)生[19]。TNF參與全身系統(tǒng)性炎癥，而TNF-α作為TNF基因家族中的重要成員，通過加速ECM的降解、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、自噬和細(xì)胞增殖來加快椎間盤退變的過程[20]。Wang Y等[21]研究發(fā)現(xiàn)，抗TNF-α療法能夠有效降低椎間盤炎癥反應(yīng)，對椎間盤退變具有減緩作用。AKT1作為一種常見的蛋白激酶，通過多種信號(hào)通路參與炎癥和細(xì)胞代謝，具有改善NP細(xì)胞退化的作用[22，23]。相關(guān)研究證實(shí)[24]，AKT1與機(jī)體血管損傷有關(guān)，病理過程為血管受到腰椎間盤壓迫，容易導(dǎo)致神經(jīng)根的血液循環(huán)障礙、促使炎性水腫、酸性代謝產(chǎn)物產(chǎn)生、神經(jīng)根的傳導(dǎo)能力下降，從而引發(fā)機(jī)體腰腿痛。實(shí)驗(yàn)證實(shí)[25]，通過抑制p38、JNK和ERK通路能夠減弱IL1β誘導(dǎo)的NP細(xì)胞和ECM的降解和凋亡，對于椎間盤退變的治療具有潛在應(yīng)用。退變的椎間盤通過釋放IL1β等炎性因子，加劇腰椎間盤突出癥的發(fā)生，導(dǎo)致腰腿痛等癥狀[26]。研究證明[27]，椎間盤退變的程度與血管芽的喪失和VEGFA及其受體的下調(diào)具有相關(guān)性。VEGFA的增加對椎間盤中淋巴管和血管的再生具有推動(dòng)作用，能夠加快椎間盤組織的修復(fù)與重建，有利于減緩椎間盤退變程度和減輕腰腿部疼痛癥狀[28]。MMP-9作為細(xì)胞外基質(zhì)代謝過程中最為關(guān)鍵的酶，其表達(dá)的增加可以加速椎間盤退變進(jìn)程[29]。研究發(fā)現(xiàn)[30]，MMP9在miR-133a的調(diào)控下導(dǎo)致Ⅱ型膠原蛋白減少，對椎間盤退變產(chǎn)生嚴(yán)重影響。

3.4關(guān)鍵信號(hào)通路結(jié)果分析? KEGG通路富集分析顯示，作為烏頭湯治療LDH相關(guān)通路，主要包括AGE-RAGE、IL17、TNF等信號(hào)通路。AGE-RAGE信號(hào)通路容易在糖尿病性多發(fā)性神經(jīng)病中激活，該信號(hào)通路的過度表達(dá)會(huì)加劇周圍神經(jīng)元的退行性疾病[31]。研究發(fā)現(xiàn)[32]，可以通過激活RAGE來引起與衰老密切聯(lián)系的全身性輕度炎癥。研究表明[33]，AGE-RAGE信號(hào)通路的激活可能通過加速基質(zhì)金屬肽酶2（MMP2）的表達(dá)，從而引起椎間盤退變。IL17信號(hào)通路可以加快NF-κB通路的激活，使其釋放炎性因子，幫助椎間盤中細(xì)胞因子、趨化因子和細(xì)胞外基質(zhì)降解因子的產(chǎn)生，進(jìn)而達(dá)到減緩椎間盤退變的作用[34-36]。He WS等[37]研究發(fā)現(xiàn)，IL17A作為IL17常見亞型之一，通過激活PI3K/Akt/Bcl-2信號(hào)通路影響細(xì)胞自噬，加快椎間盤的退變。TNF信號(hào)通路對炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程具有調(diào)節(jié)作用[38]。TNF是腫瘤壞死因子，具有強(qiáng)大的致炎作用，TNF-α作為TNF其中一個(gè)亞型，與椎間盤退變密切相關(guān)。在加速椎間盤退變、誘導(dǎo)NP細(xì)胞凋亡方面，TNF-α扮演著重要作用，NF-κB信號(hào)通路可以抑制SHOX2的表達(dá)并促進(jìn)椎間盤退變和加劇腰痛[39，40]。

3.5分子對接結(jié)果分析? 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過篩選得到的3個(gè)核心活性成分與6個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)成功完成分子對接，且結(jié)合能均小于-5 kcal/mol，說明成分與靶點(diǎn)之間結(jié)合性良好。

綜上所述，烏頭湯可能通過槲皮素、山奈酚、木犀草素等主要活性成分作用于IL6、TNF、AKT1、IL1B、VEGFA、MMP9等靶點(diǎn)基因來調(diào)控AGE-RAGE、IL17、TNF等信號(hào)通路，通過抗炎、免疫調(diào)節(jié)等機(jī)制達(dá)到治療LDH的作用，體現(xiàn)了烏頭湯治療LDH具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)，為烏頭湯的臨床應(yīng)用及后續(xù)研究提供依據(jù)與思路。然而，本研究僅在理論上探討了烏頭湯治療LDH的藥理作用機(jī)制，其具體機(jī)制尚未探索清楚，還需后期大量實(shí)驗(yàn)研究加以驗(yàn)證。

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收稿日期：2023-06-09；修回日期：2023-06-21

編輯/杜帆