王欣　董自亮　李紅亮　吳瑞軍　覃瑤　彭濤　秦少容　羅維早

【摘 要】目的：建立經(jīng)典名方金水六君煎物質(zhì)基準中半夏和陳皮的薄層鑒別方法。方法：以半夏對照藥材為對照，對金水六君煎中半夏進行薄層鑒別研究，以橙皮苷和陳皮對照藥材為對照，對金水六君煎中陳皮進行薄層鑒別研究，并對其進行方法學驗證。結(jié)果：建立的薄層色譜法能鑒別出半夏和陳皮，斑點對應(yīng)較好，陰性無干擾，方法學考察結(jié)果顯示，方法適應(yīng)性良好。結(jié)論：本法簡單可行、結(jié)果可靠、重復性好，可作為金水六君煎物質(zhì)基準的質(zhì)量控制方法。

【關(guān)鍵詞】金水六君煎；半夏；陳皮；橙皮苷；薄層色譜

【中圖分類號】

R284.1 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2024）06-0047-06

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.06.zgmzmjyyzz202406011

Study on the Thin Layer Identification of Pinelliae Rhizoma and Citri Reticulatae

Pericarpium in the Material Reference of Jinshui Liujun Decoction

WANG Xin^1，2DONG Ziliang^1，3LI Hongliang³WU Ruijun²QIN Yao²PENG Tao³QIN Shaorong²LUO Weizao^1，2*

1.Chongqing Institute of Chinese Materia Medica，Chongqing 400065，China;

2.Taiji Group Co.，Ltd.，Chongqing 401147，China;

3.Taiji Group Chongqingfulin Pharmaceutical Co.，LTD.，Chongqing 400800，China

Abstract：Objective Establishing the TLC identification methods of Pinelliae Rhizoma and Citri Reticulatae Pericarpium in the material reference of classical Jinshui Liujun Decoction （JLD）.Methods The TLC method for the identification of Pinelliae Rhizoma in JLD was established by using Pinelliae Rhizoma as the reference drug;A TLC method was established for the identification of Citri Reticulatae Pericarpium in JLD with hesperidin and Citri Reticulatae Pericarpium as the control，the methods were verified.Results The established thin-layer chromatography method can identify Pinelliae Rhizoma and Citri Reticulatae Pericarpium，and have the advantages of better spots on TLC with the same color，no interference in negative control.The results of the methodological investigation showed that the method had good adaptability.Conclusion The methods are simple and feasible，with high reproducibility，can be used as a quality control method of the material reference of JLD.

Key words：Jinshui Liujun Decoction（JLD）;Pinelliae Rhizoma;Citri Reticulatae Pericarpium;Hesperidin;Thin-layer Chromatography （TLC）

金水六君煎出自明代張景岳的《景岳全書》，為“新方八陣·和陣”首劑。全方由當歸、熟地、陳皮、半夏、茯苓、炙甘草和生姜七味藥組成，具有潤枯燥濕、益陰化痰的功效，主治肺腎虛寒、水泛為痰、或年邁陰虛、血氣不足、外受風寒、咳嗽嘔惡、喘逆多痰^［1-2］。

經(jīng)典名方物質(zhì)基準，是指以古代醫(yī)籍中記載的經(jīng)典名方制備方法為依據(jù)制備中藥藥用物質(zhì)的標準，除成型工藝外，其余制備方法應(yīng)與古代醫(yī)籍記載基本一致^［3-4］。經(jīng)典名方物質(zhì)基準是連接經(jīng)典名方傳統(tǒng)制法與現(xiàn)代生產(chǎn)工藝的中間過渡對照物^［5］。建立和完善金水六君煎物質(zhì)基準的質(zhì)量標準，可為金水六君煎復方制劑的質(zhì)量評價提供技術(shù)支撐。

近年來，國內(nèi)外對金水六君煎的化學成分、藥理活性和臨床應(yīng)用研究廣泛，但對質(zhì)量標準的報道較少。目前，有文獻報道了金水六君煎及其物質(zhì)基準中熟地、炙甘草和生姜的薄層鑒別方法學^［6-7］，尚未見金水六君煎物質(zhì)基準中半夏和陳皮的系統(tǒng)薄層鑒別方法學研究?，F(xiàn)有關(guān)于金水六君煎中半夏和陳皮的薄層鑒別方法，存在薄層樣品中干擾雜質(zhì)多、展開劑有劇毒物質(zhì)苯、薄層展開效果欠佳等問題。

為此，文章建立金水六君煎物質(zhì)基準中半夏和陳皮的薄層鑒別方法，

以期為金水六君煎的開發(fā)和質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 AE240萬分之一電子天平；XSE205十萬分之一電子天平；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器；CAMAG薄層色譜掃描儀。

1.2 試劑 石油醚（60～90 ℃）（20190301）、環(huán)己烷（20190601）、甲苯（20200301）、三氯甲烷（20180501）、乙酸乙酯（20190901、20191001）、丙酮（20150820）、無水乙醇（20200101）、甲醇（20200101）、甲酸（201801101），由重慶川東化工（集團）有限公司提供，均為分析純；水為重蒸水。

1.3 耗材 金水六君煎物質(zhì)基準樣品（批號：JS001～JS020）、缺半夏陰性物質(zhì)基準樣品、缺陳皮陰性物質(zhì)基準樣品，均由太極集團涪陵制藥廠提供。半夏對照藥材（121272-201806）、陳皮對照藥材（120969-201510）、橙皮苷（110721-201617）購自中國食品藥品檢定研究院。硅膠薄層板購自青島譜科分離材料有限公司和海浪硅膠干燥劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 金水六君煎物質(zhì)基準的制備 根據(jù)國家中醫(yī)藥管理局聯(lián)合國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《古代經(jīng)典名方關(guān)鍵信息表（25首方劑）》，取熟地黃14.92 g、陳皮5.60 g、炒甘草3.73 g、當歸、茯苓、清半夏各7.46 g、生姜5.00 g，加水400 mL，煎煮至140～160 mL。結(jié)合課題組前期預試驗，按處方量稱取藥材，置于陶瓷鍋中，加水400 mL，浸泡30 min，武火加熱至沸騰，文火繼續(xù)加熱約60 min，趁熱濾過，濾液放涼，冷凍干燥，得物質(zhì)基準凍干粉。

2.2 半夏的薄層鑒別

2.2.1 溶液的制備 供試品溶液：取金水六君煎物質(zhì)基準粉末10.0 g（批號：JS001），加乙酸乙酯超聲提取2次（50 mL、25 mL），每次超聲時間 30 min，濾過，合并乙酸乙酯液，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解。

半夏對照藥材溶液：取半夏對照藥材1.0 g，加乙酸乙酯25 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解。

陰性溶液：按照金水六君煎配方稱取除半夏外的其他藥材，按照“2.1”項下金水六君煎物質(zhì)基準制備方法，制成缺半夏陰性物質(zhì)基準。取缺半夏陰性物質(zhì)基準適量，按“2.2.1”項供試品溶液制備方法，制成缺半夏陰性溶液。

2.2.2 薄層色譜條件 照薄層色譜法^［8］試驗，吸取“2.2.1”項下供試品溶液和缺半夏陰性溶液各10 μL，半夏對照藥材溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯-丙酮-甲酸（30∶6∶4∶0.5）為展開劑，預飽和20 min，展開，取出，晾干，噴以香草醛硫酸試液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，在日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的主斑點；陰性對照溶液在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，無相同顏色的斑點（圖1）。

1.半夏供試品溶液；2.半夏對照藥

材溶液；3.缺半夏陰性溶液

2.2.3 薄層板的考察 取硅膠G薄層板，分別按“2.2.2 薄層色譜條件”試驗，兩種薄層板的薄層色譜信息基本一致（圖2），選定青島譜科的硅膠G薄層板。

2.2.4 供試品溶液點樣量考察 供試品溶液的點樣量分別為2 μL、6 μL、10 μL、14 μL，按“2.2.2 薄層色譜條件”試驗（圖3）。綜合考慮，供試品溶液點樣量為10 μL。

2.2.5 展開環(huán)境的耐用性考察 不同溫度的比較：分別在4 ℃、25 ℃和40 ℃，預飽和20 min，展開，其余條件同“2.2.2 薄層色譜條件”。結(jié)果表明，溫度在4～40 ℃范圍內(nèi)，對薄層鑒別無明顯影響（圖4）。

不同濕度的比較：在室溫25 ℃，分別在相對濕度75.3%、43.2%和18.0%預飽和20 min，展開，其余條件同“2.2.2 薄層色譜條件”。結(jié)果表明，相對濕度在18.0%～75.3%范圍內(nèi)，對薄層鑒別無明顯影響（圖5）。

薄層鑒別方法學試驗的結(jié)果表明，金水六君煎物質(zhì)基準中半夏的薄層鑒別方法重現(xiàn)性良好，分離效果較好，斑點清晰，陰性對照無干擾。

2.2.6 20批樣品的薄層鑒別 按“2.2.2 薄層色譜條件”試驗，對20批金水六君煎物質(zhì)基準進行薄層鑒別，20批供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點（圖6、圖7）。

2.3 陳皮的薄層鑒別

2.3.1 溶液的配制 供試品溶液：取金水六君煎物質(zhì)基準粉末10.0 g（批號：JS001），加三氯甲烷50 mL，超聲30 min，濾過，棄去三氯甲烷液，殘渣揮盡三氯甲烷，加無水乙醇超聲提取2次（50 mL，25 mL），每次30 min，濾過，合并無水乙醇液，濾液揮干，殘渣加無水乙醇1 mL使溶解。

陳皮對照藥材溶液：另取陳皮對照藥材0.50 g，加三氯甲烷50 mL，超聲30 min，濾過，棄去三氯甲烷液，殘渣揮盡三氯甲烷，加無水乙醇25 mL，超聲30 min，濾過，濾液揮干，殘渣加無水乙醇1 mL使溶解。

對照品溶液：另取橙皮苷對照品，加甲醇制成飽和溶液。

陰性溶液：按金水六君煎配方稱取除陳皮外的其他藥材，按“2.1”項下金水六君煎物質(zhì)基準制備方法，制成缺陳皮陰性物質(zhì)基準。取缺陳皮陰性物質(zhì)基準適量，按“2.3.1”項供試品溶液制備方法，制成缺陳皮陰性溶液。

2.3.2 薄層色譜條件 照薄層色譜法^［8］試驗，吸取“2.3.1”項下供試品溶液和缺陳皮陰性溶液各10 μL、對照藥材溶液2 μL和對照品溶液5 μL，分別點于同一用0.5%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100∶17∶13）為展開劑，預飽和20 min，展至約3 cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（20∶10∶1∶1）的上層溶液為展開劑，預飽和20 min，展至約8 cm，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜和對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點（圖8）。

2.3.3 不同薄層板考察 取0.5%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板，按“2.3.2 薄層色譜條件”試驗，種薄層板的薄層色譜信息基本一致，不影響該方法檢視結(jié)果，選定青島譜科0.5%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板（圖9）。

2.3.4 供試品溶液點樣量考察 供試品溶液點樣量分別為2 μL、6 μL、10 μL、14 μL，按“2.3.2 薄層色譜條件”試驗（圖10）。綜合考慮，供試品溶液點樣量為10 μL。

2.3.5 展開環(huán)境的耐用性考察 不同溫度的比較：分別在4 ℃、25 ℃和40 ℃，預飽和20 min，展開，其余條件同“2.3.2 薄層色譜條件”試驗。結(jié)果表明，溫度在4～40 ℃范圍內(nèi)，對薄層鑒別無明顯影響（圖11）。

不同濕度的比較：在室溫25 ℃下，分別在相對濕度75.3%、43.2%和18.0%預飽和20 min，展開，其余條件同“2.3.2 薄層色譜條件”試驗。結(jié)果表明，相對濕度在18.0%～75.3%范圍內(nèi)，對薄層鑒別無明顯影響（圖12）。

薄層鑒別方法學試驗結(jié)果表明，金水六君煎物質(zhì)基準中陳皮的薄層鑒別方法重現(xiàn)性良好，分離效果好，斑點清晰，陰性對照無干擾。

2.3.6 20批樣品的薄層鑒別 按“2.3.2 薄層色譜條件”試驗，對20批金水六君煎物質(zhì)基準進行薄層鑒別，20批供試品色譜中，在與橙皮苷色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點（圖13）。

3 討論

金水六君煎處方中，半夏為佐藥，辛溫，具有燥濕化痰的功效^［9］。回流法制備半夏薄層樣品，操作繁瑣，提取溶媒三氯甲烷和展開劑苯均毒性較大^［6］，不利于環(huán)保。該研究采用超聲法提取樣品，提取溶媒和展開劑均換成低毒性溶劑，方法簡便可行，所得供試品溶液重現(xiàn)性較好。結(jié)果顯示，半夏的薄層分離效果較好，主斑點清晰、Rf值適中。

陳皮為佐藥，苦辛溫散，具有消水化痰的功效^［9］。橙皮苷為陳皮的質(zhì)量標志物之一^［10］，具有抗氧化、抗炎、促胃動力作用等藥理活性^［11-14］，橙皮苷是陳皮藥材薄層鑒別的特征性成分。本實驗先用三氯甲烷超聲提取雜質(zhì)，再用無水乙醇超聲提取橙皮苷，供試品溶液重現(xiàn)性好。陳皮薄層鑒別經(jīng)二次展開，各斑點分離良好，主斑點清晰。

藁本內(nèi)酯和阿魏酸為當歸的化學成分。藁本內(nèi)酯具有揮發(fā)性，穩(wěn)定性較差，在金水六君煎物質(zhì)基準樣品和后期復方制劑制備、儲存時，易丟失，金水六君煎物質(zhì)基準的薄層鑒別未檢測出藁本內(nèi)酯；阿魏酸是當歸藥材薄層鑒別的特征性成分和含量測定的指標成分，但金水六君煎中當歸和陳皮藥材均含有阿魏酸，上述兩種成分均不能作為當歸藥材的薄層鑒別成分。在2020年版《中國藥典》（一部）茯苓、含茯苓藥材的成方制劑中，茯苓藥材的薄層鑒別均以茯苓為對照藥材，乙醚為提取溶媒，提取脂溶性成分。金水六君煎為水煎液，茯苓中脂溶性成分在其水煎液中含量極低，薄層試驗未檢測出。后期，應(yīng)重點關(guān)注金水六君煎及其藥材（當歸、茯苓）的化學成分研究進展，開展薄層鑒別試驗，力爭找到金水六君煎中當歸和茯苓的薄層鑒別特征性成分。

4 結(jié)論

本文建立的金水六君煎中半夏和陳皮的薄層鑒別方法，藥材特征斑點清晰，陰性無干擾。此方法簡單可行，重復性良好，為金水六君煎的質(zhì)量標準完善和提升提供參考。

參考文獻

［1］張景岳.景岳全書［M］.5版.上海：上?？茖W技術(shù)出版社，1984：986.

［2］董自亮，李紅亮，羅維早，等.經(jīng)典名方金水六君煎的古代文獻分析［J］.中國中藥雜志，2020，45（23）：5639-5644.

［3］國家藥品監(jiān)督管理局.關(guān)于發(fā)布古代經(jīng)典名方中藥復方制劑簡化注冊審批管理的規(guī)定的公告［EB/OL］.http：//www.nmpa.gov.cn/WS04/CL2093/228247.html，2018-05-29.

［4］國家藥品監(jiān)督管理局.公開征求古代經(jīng)典名方中藥復方制劑及其物質(zhì)基準申報資料要求（ 征求意見稿）意見［EB/OL］.http：//www.nmpa.gov.cn/WS04/CL2101/335926.html，2019-03-22.

［5］代云桃，勒如娜，吳治麗，等.基于標準湯劑（物質(zhì)基準）的經(jīng)典名方制備工藝和質(zhì)量標準研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2020，26（2）：164-174.

［6］胡小剛.金水六君煎質(zhì)量標準研究［D］.廣州：暨南大學，2001.

［7］王欣，董自亮，禹奇男，等.經(jīng)典名方金水六君煎物質(zhì)基準的薄層鑒別方法學研究［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2022，18（12）：58-67.

［8］國家藥典委員會編.2020年版中華人民共和國藥典（四部）［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020：59-60.

［9］馬向梅，丁元慶.張介賓金水六君煎釋義［J］.山東中醫(yī)雜志，2013，32（6）：436.

［10］許姍姍，許浚，張笑敏，等.常用中藥陳皮、枳實和枳殼的研究進展及質(zhì)量標志物的預測分析［J］.中草藥，2018，49（1）：35-44.

［11］HUANG Y S，HO S C.Polymethoxy flavones are responsible for the anti-inflammatory activity of citrus fruit peel ［J］.Food Chem，2010，119（3）：868-873.

［12］YI Z B，YU Y，LIANG Y Z，et al.In vitro antioxidant and antimicrobial activities of the extract of Pericarpium Citri Reticulatae of a new citrus cultivar and its main flavonoids ［J］.LWT-Food Sci Technol，2008，41（4）：597-603.

［13］李慶耀，梁生林，褚洪標，等.陳皮促胃腸動力有效部位的篩選研究［J］.中成藥，2012，34（5）：941-943.

［14］DU Q，CHEN H.The methoxyflavones in Citrus reticulata Blanco cv.Ponkan and their antiproliferative activity against cancer cells ［J］.Food Chem，2010，119（2）：567-572.

（收稿日期：2023-07-03 編輯：陶希睿）