摘要：新疆紫花苜蓿（Medicago sativa L.）在返青期常遭受低溫和干旱雙重脅迫。本研究以新疆主栽品種‘新牧4號(hào)’為材料，研究低溫和干旱雙重脅迫對(duì)苜蓿葉片光系統(tǒng)II（PSII）的影響。以商業(yè)種‘WL525HQ’為對(duì)照，進(jìn)一步分析雙重脅迫對(duì)不同低溫抗性的苜蓿PSII具體的影響位點(diǎn)。結(jié)果表明：低溫下PSII最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、單位反應(yīng)中心捕獲的用于電子傳遞的能量（ETO/RC）顯著降低，OJIP曲線中J點(diǎn)熒光上升，表明低溫導(dǎo)致PSII活性下降是由于受體側(cè)和反應(yīng)中心受損；干旱導(dǎo)致Fv/Fm顯著降低，OJIP曲線中J，K，L點(diǎn)熒光上升且重度干旱導(dǎo)致單位反應(yīng)中心吸收的光能（ABS/RC）、單位反應(yīng)中心捕獲的用于還原QA的能量（TRO/RC）、單位反應(yīng)中心耗散掉的能量（DIO/RC）增加，表明干旱導(dǎo)致PSII活性下降是由于PSII供/受體側(cè)、復(fù)合體受損及重度干旱PSII反應(yīng)中心受損；雙重脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的順-3-乙烯醇可緩解單一脅迫對(duì)PSII的傷害程度；在秋眠級(jí)較低的‘新牧4號(hào)’中，雙重脅迫可緩解干旱對(duì)PSII供體側(cè)的傷害，在‘WL525HQ’中，雙重脅迫可緩解低溫對(duì)PSII反應(yīng)中心及受體側(cè)的傷害，同時(shí)緩解干旱對(duì)PSII供體側(cè)、反應(yīng)中心的傷害。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；PSII；低溫脅迫；干旱脅迫；雙重脅迫

中圖分類號(hào)：S963.22+3.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-0435（2024）04-1120-11

Effects of Low Temperature and Drought Stress on Photosystem II of Alfalfa Leaves

ZHAO Yao-yao， LIU Mei-jun*， ZHANG Zheng， WANG Jie， WANG Yu-xiang， AN Chang-qi， WANG Tiao-xia

Abstract：Alfalfa often suffers from dual stresses of low temperature and drought during its turning green period in Xinjiang. In this study，the effects of low temperature and drought stress on the photosystem II （PSII） of alfalfa leaves were studied by using the main cultivar ‘Xinmu 4’ in Xinjiang as object. Taking the commercial species ‘WL525HQ’ as the control，the specific influencing sites on PSII of alfalfa with different low temperature resistance were further analyzed. The results showed that the maximum photochemical efficiency of PSII （Fv/Fm） and the energy captured per reaction center for electron transfer （ETO/RC） significantly decreased at low temperature，and the fluorescence of J point in the OJIP curve increased，indicating that the decrease of PSII activity caused by low temperature was due to the damage of the acceptor side and the reaction center;Drought caused a significant decrease in Fv /Fm，and the fluorescence of J，K，and L points in the OJIP curve increased. Severe drought led to an increase in light energy absorbed by the unit reaction center （ABS/RC），energy captured by the unit reaction center for reducing QA （TRO/RC），and energy dissipated by the unit reaction center （DIO/RC），indicating that the decrease in PSII activity caused by drought was due to damage to the PSII donor/acceptor side，complexus，and the reaction center of severe drought PSII;The induced production of cis-3-Hexen-1-ol under dual stresses alleviated the degree of damage to the PSII complexus caused by a single stress;In Xinmu No.4 with a lower autumn dormancy level，dual stresses alleviated the damage caused by drought to the PSII donor side. In WL525HQ，dual stresses alleviated the damage caused by low temperature to the PSII response center and receptor side，and also alleviated the damage caused by drought to the PSII donor side and response center.

Key words：Alfalfa;PSII;Low temperature stress;Drought stress;Dual stress

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）作為“牧草之王”在新疆廣泛種植［1］。新疆春季“倒春寒”頻繁發(fā)生，使苜蓿常遭受冷害和凍害的威脅，嚴(yán)重影響苜蓿的生長(zhǎng)發(fā)育，從而影響苜蓿的順利返青以及第一茬草產(chǎn)量［2］。此外，新疆地理生態(tài)環(huán)境特殊，水資源分布不均，該地區(qū)土壤以鹽堿性較強(qiáng)的棕漠土為主，保水能力較弱。春季氣候干旱，尤其是南疆地區(qū)春季大風(fēng)頻發(fā)，引起上層土壤水分蒸發(fā)，降低了土壤含水量。返青期是苜蓿生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期［3］，也是水分敏感期［4］，該階段土壤水分情況對(duì)后期產(chǎn)量的形成有重要的影響［5］。因此，新疆地區(qū)苜蓿在早春常常遭受低溫和干旱雙重脅迫，嚴(yán)重影響了苜蓿產(chǎn)業(yè)在新疆的發(fā)展。

光合作用是植物生長(zhǎng)過(guò)程中最重要的生理過(guò)程之一，直接影響植物的生長(zhǎng)及產(chǎn)量［6］，植物葉片葉綠體類囊體膜上的光系統(tǒng)I（Photosystem I，PSI）和光系統(tǒng)II（Photosystem II，PSII）進(jìn)行著光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化，對(duì)光合作用至關(guān)重要［7］。PSII是光合作用對(duì)環(huán)境變化最為敏感的部位之一［8］，相較于PSII，PSI的活性在環(huán)境脅迫下相對(duì)穩(wěn)定［9］。低溫破壞葉綠體結(jié)構(gòu)導(dǎo)致葉綠素含量降低，進(jìn)而使凈光合速率（Net photosynthetic rate，Pn）和PSII最大光化學(xué)效率（Maximum photochemical efficiency of PSII，F(xiàn)v/Fm）降低［10-11］。干旱導(dǎo)致葉片含水量降低、損害了光合相關(guān)基因的表達(dá)引起光合速率下降進(jìn)而導(dǎo)致植物生物量下降［12］。此外，還有研究表明，低溫光脅迫加重PSII活性的下降，低溫預(yù)處理能夠提高植株的抗旱性［13-14］，干旱預(yù)處理能夠提高玉米幼苗的耐冷性［15］。目前，國(guó)內(nèi)外大多數(shù)研究集中于低溫、干旱單一脅迫或低溫、干旱預(yù)處理對(duì)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的影響，但雙重脅迫對(duì)植物可能會(huì)出現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)或拮抗效應(yīng)不能視作是簡(jiǎn)單的疊加效應(yīng)［16］。因此，低溫和干旱雙重環(huán)境脅迫對(duì)苜蓿光合作用的影響機(jī)制尚不明確，低溫干旱雙重脅迫對(duì)紫花苜蓿PSII活性的影響變化及其電子傳遞的情況有待進(jìn)一步研究，低溫和干旱雙重脅迫對(duì)PSII影響的機(jī)制差異性有待進(jìn)一步分析。

本文以新疆主栽品種‘新牧4號(hào)’紫花苜蓿為試驗(yàn)材料，研究了低溫和干旱雙重脅迫對(duì)紫花苜蓿葉片光系統(tǒng)II（PSII）的影響。此外，由于苜蓿秋眠級(jí)與其抗寒性有關(guān)，秋眠級(jí)越高抗寒能力越弱［17］，為了進(jìn)一步研究雙重脅迫下低溫和干旱脅迫的相互作用機(jī)制，本研究選用了秋眠級(jí)較高的商業(yè)種‘WL525HQ’為對(duì)照，進(jìn)一步分析了低溫和干旱雙重脅迫對(duì)不同低溫抗性的紫花苜蓿葉片PSII具體的影響位點(diǎn)，以期豐富紫花苜?？购?、抗旱的機(jī)理，為紫花苜?？购?、抗旱品種的選育提供理論依據(jù)，對(duì)新疆地區(qū)選育適應(yīng)性品種具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以抗寒性較強(qiáng)的新疆主栽品種‘新牧4號(hào)’（秋眠級(jí)3～4級(jí)）［18］紫花苜蓿為試驗(yàn)材料，同時(shí)以抗寒性較弱的高秋眠級(jí)商品種‘WL525HQ’（秋眠級(jí)8級(jí)）［19］紫花苜蓿為對(duì)照，‘新牧4號(hào)’由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院2022年收獲并提供，‘WL525HQ’購(gòu)買(mǎi)于北京中種草業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

挑選大小均勻，顆粒飽滿的兩品種苜蓿種子，將其均勻的點(diǎn)播到裝滿營(yíng)養(yǎng)土的黑色塑料育苗盤(pán)（54 cm×28 cm，21孔）中，放入人工氣候培養(yǎng)箱（光強(qiáng)為300 μmol·m-2·s-1，光照培養(yǎng)16 h，暗培養(yǎng)8 h，恒定溫度25℃），期間正常澆水，待種子萌發(fā)并生長(zhǎng)14 d后挑選生長(zhǎng)狀況好、長(zhǎng)勢(shì)均勻的10株幼苗移栽到裝滿蛭石的塑料花盆（8 cm×11 cm×8 cm）中，采用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，待其適應(yīng)11 d后調(diào)整人工氣候培養(yǎng)箱溫度（光強(qiáng)和光周期不變）進(jìn)行為期3 d的低溫和干旱處理，每個(gè)品種每個(gè)處理6盆共計(jì)96盆。通過(guò)人工氣候培養(yǎng)箱控制溫度，采用PEG6000模擬干旱。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在10℃低溫處理3 d后，紫花苜蓿葉片PSII活性有顯著的下降，因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置25℃室溫（TR），10℃低溫（TL）2個(gè)溫度處理以及0%（D0），5%（D1），15%（D2），25%（D3）PEG6000的4個(gè)干旱處理進(jìn)行交叉脅迫，共計(jì)8個(gè)處理，分別標(biāo)記為T(mén)R+D0，TR+D1，TR+D2，TR+D3，TL+D0，TL+D1，TL+D2，TL+D3，處理3 d后測(cè)定相關(guān)熒光指標(biāo)，每個(gè)處理10個(gè)重復(fù)，此外，本試驗(yàn)還用順-3-己烯醇（100 mmol·L-1）外源噴施驗(yàn)證雙重脅迫的交互作用。

1.3 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.3.1 葉片干重及含水量測(cè)定 處理結(jié)束后隨機(jī)剪取各單盆中10株植株所有復(fù)葉，稱量苜蓿葉片鮮重（Wf），隨后將苜蓿放入烘箱105℃殺青20 min，然后將烘箱調(diào)至80℃烘至恒重，稱量干重（Wd）。

葉片含水量=（Wf－Wd）/Wf×100%

1.3.2 快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線（Rapid chlorophyll fluorescence induction kinetic curve，OJIP曲線）測(cè)定 參照Schansker等［20］與Zhang等［21］的方法，選擇頂端以下第二片復(fù)葉，測(cè)量前將葉片暗適應(yīng)20 min，利用多功能植物效率儀m-PEA（Hansatech，英國(guó)）測(cè)定處理3 d兩品種紫花苜蓿葉片OJIP曲線，由5 000 μmol·m-2·s-1的紅光誘導(dǎo)，熒光信號(hào)記錄從10 μs開(kāi)始，至2 s結(jié)束，記錄的初始速率為每秒105個(gè)數(shù)據(jù)，導(dǎo)出數(shù)據(jù)并按照Strasser等［22］的方法分析葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)，分別對(duì)OJIP曲線中O-P段、O-J段和O-K段按照以下方法標(biāo)準(zhǔn)化并將處理與對(duì)照做差，清晰分析曲線變化：

O-P段標(biāo)準(zhǔn)化：VO-P=（Ft-Fo）/（Fm-Fo）。

O-J段標(biāo)準(zhǔn)化：VO-J=（Ft-Fo）/（FJ-Fo），ΔVO-J=Δ［（Ft-Fo）/（FJ-Fo）］。

O-K段標(biāo)準(zhǔn)化：VO-K=（Ft-Fo）/（Fk-Fo），ΔVO-K=Δ［（Ft-Fo）/（Fk-Fo）］。

按照以下公式計(jì)算相關(guān)參數(shù)［23-24］：

PSII最大光化學(xué)效率：Fv/Fm=TRO/ABS=1-（Fo/Fm）。

以吸收光能為基礎(chǔ)的性能指數(shù)（Performance index based on absorbing light energy，PIABS）：PIABS=（RC/ABS）×［φPo/（1－φPo）］×［ψO/（1－ψO）］，其中φPo=Fv/Fm，ψO=ETO/TRO=（1－VJ）。

J點(diǎn)的相對(duì)可變熒光強(qiáng)度（The relative variable fluorescence intensity of J point，VJ）：VJ=（FJ－Fo）/（Fm－Fo）。

單位反應(yīng)中心吸收的光能（Light energy absorbed by unit reaction center，ABS/RC）：ABS/RC=MO×（1/VJ）×（1/φPo）其中MO=4（F300 μs－Fo）/（Fm－Fo）。

單位反應(yīng)中心捕獲的用于還原QA的能量（The energy captured by the unit reaction center for reducing QA，TRO/RC）：TRO/RC=MO×（1/VJ）。

單位反應(yīng)中心捕獲的用于電子傳遞的能量（Energy captured by unit reaction center for electron transfer，ETO/RC）：ETO/RC=MO×（1/VJ）×ψO。

單位反應(yīng)中心耗散掉的能量（The energy dissipated by the unit reaction center，DIO/RC）：DIO/RC=（ABS/RC）－（TRO/RC），其中TRO/RC=MO×（1/VJ）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Office Excel 2019對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算整理，采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示測(cè)定結(jié)果，分別對(duì)室溫和低溫不同干旱濃度間采用單因素方差分析（One-way ANOVA）以及對(duì)相同干旱濃度室溫和低溫間采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，并用Duncan多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，在α=0.05水平上，采用雙因素方差分析（Two-way ANOVA）比較溫度、干旱濃度及二者交互作用對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)的影響和差異顯著性，采用Origin2022作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫和干旱對(duì)紫花苜蓿葉片生長(zhǎng)以及光合性能的影響

與室溫正常供水相比，低溫正常供水下，在‘新牧4號(hào)’中葉片干重和含水量無(wú)顯著性差異，在‘WL525HQ’中顯著降低（Plt;0.05）。室溫下隨著干旱脅迫程度的增加，葉片干重和含水量逐漸降低且差異顯著（Plt;0.05），干旱脅迫下，低溫處理的葉片干重和含水量相較于室溫處理顯著上升（Plt;0.05）（圖1A，1B，1G，1H）。

與室溫正常供水相比，低溫正常供水下葉片光合性能指數(shù)（PIABS）和PSII最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）顯著降低（Plt;0.05），同時(shí)，室溫下Fv/Fm和PIABS隨著干旱濃度增加顯著降低（Plt;0.05）。相較于‘WL525HQ’，低溫對(duì)‘新牧4號(hào)’Fv/Fm和PIABS影響程度較低，而干旱對(duì)其影響較大。干旱脅迫下，低溫處理的‘新牧4號(hào)’Fv/Fm和PIABS相較于單一干旱脅迫部分有所升高，而在‘WL525HQ’中，干旱處理的苜蓿葉片F(xiàn)v/Fm和PIABS相對(duì)于單一低溫部分有所升高（圖1C，D，E，F(xiàn)）。這表明，在‘新牧4號(hào)’中低溫干旱雙重脅迫時(shí)低溫緩解了干旱對(duì)PSII活性的影響，在‘WL525HQ’中是雙重脅迫下的干旱緩解了低溫對(duì)PSII活性的影響。

2.2 低溫和干旱對(duì)紫花苜蓿葉片PSII受體側(cè)的影響

與室溫正常供水相比，低溫正常供水和室溫干旱脅迫后苜蓿葉片的快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線（OJIP曲線）J-P段發(fā)生明顯變化（圖2A，2C），這表明不同處理直接影響了苜蓿葉片光合機(jī)構(gòu)的活性，為了進(jìn)一步分析不同脅迫對(duì)光合機(jī)構(gòu)的傷害位點(diǎn)，對(duì)OJIP曲線O-P段標(biāo)準(zhǔn)化得到VO-P曲線Vt（圖2B，2D），VJ表示J點(diǎn)的相對(duì)可變熒光，可以反映2 ms時(shí)有活性反應(yīng)中心的關(guān)閉程度以及受體側(cè)變化。

由圖可知，與室溫正常供水相比，低溫正常供水和室溫干旱下J點(diǎn)的相對(duì)可變熒光顯著增加（Plt;0.05），與‘WL525HQ’相比，在‘新牧4號(hào)’中，雙重脅迫相較于低溫正常供水J點(diǎn)的熒光及相對(duì)可變熒光無(wú)顯著性差異，在‘WL525HQ’中，雙重脅迫相較于低溫正常供水J點(diǎn)的熒光及相對(duì)可變熒光顯著降低（Plt;0.05），而相較于室溫干旱顯著增加（Plt;0.05）（圖2E，2F）。這表明，相較于低溫，在‘新牧4號(hào)’中雙重脅迫對(duì)PSII受體側(cè)無(wú)顯著影響，而在‘WL525HQ’中，雙重脅迫減輕了低溫對(duì)PSII受體側(cè)的影響，而加重了干旱對(duì)PSII受體側(cè)的影響。

2.3 低溫和干旱對(duì)紫花苜蓿葉片PSII供體側(cè)的影響

K點(diǎn)是OJIP曲線中大約300 μs處的熒光值［23］，先對(duì)不同處理OJIP曲線O-J段進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，再將不同處理OJIP曲線中O-J段曲線與對(duì)照O-J段曲線做差，得到ΔVO-J曲線，這樣可以更直觀的分析K點(diǎn)熒光，用來(lái)反映放氧復(fù)合體活性的變化及PSII供體側(cè)的變化。結(jié)果表明，與室溫正常供水相比，低溫正常供水下K點(diǎn)熒光為負(fù)值，室溫干旱下K點(diǎn)熒光為正值且隨著干旱濃度增加K點(diǎn)熒光逐漸增大，在‘新牧4號(hào)’中，低溫重度干旱雙重脅迫下K點(diǎn)熒光為正值但低于中度干旱和重度干旱處理，在‘WL525HQ’中除了中度干旱和重度干旱時(shí)K點(diǎn)熒光為正值，其余處理均為負(fù)值（圖3A，3B）。這表明，低溫正常供水不會(huì)影響苜蓿葉片放氧復(fù)合體的活性，室溫干旱顯著傷害了放氧復(fù)合體的活性，雙重脅迫部分緩解了重度干旱對(duì)PSII供體側(cè)的傷害。

2.4 低溫和干旱對(duì)紫花苜蓿葉片PSII復(fù)合體各單元交聯(lián)程度的影響

OJIP曲線中大約100～120 μs處的熒光值被稱為L(zhǎng)點(diǎn)，可以反映PSII復(fù)合體各單元的交聯(lián)程度［25］，為了更清晰的分析L點(diǎn)的變化，對(duì)OJIP曲線O-K段標(biāo)準(zhǔn)化，然后將不同處理OJIP曲線O-K段與對(duì)照O-K段曲線做差，得到ΔVO-K曲線。結(jié)果表明，與室溫正常供水相比，室溫干旱下L點(diǎn)熒光為正值且隨著干旱濃度增加逐漸增加，在‘新牧4號(hào)’中，低溫正常供水下L點(diǎn)熒光為負(fù)值，低溫重度干旱雙重脅迫（TL+D3）L點(diǎn)熒光為正值且小于TR+D2和TR+D3。在‘WL525HQ’中，低溫正常供水下L點(diǎn)熒光為正值，雙重脅迫L點(diǎn)熒光均低于低溫下L點(diǎn)熒光（圖4A，4B）。這表明，干旱導(dǎo)致PSII復(fù)合體各單元的交聯(lián)程度受到傷害；在‘新牧4號(hào)’中，低溫對(duì)其無(wú)顯著影響，雙重脅迫緩解了干旱對(duì)PSII復(fù)合體各單元交聯(lián)程度的傷害；在‘WL525HQ’中，低溫導(dǎo)致PSII復(fù)合體各單元的交聯(lián)程度受到傷害，雙重脅迫緩解了低溫對(duì)其造成的傷害。

2.5 低溫和干旱對(duì)紫花苜蓿葉片光能吸收、捕獲、電子傳遞和PSII反應(yīng)中心的影響

與室溫正常供水相比，在‘新牧4號(hào)’中，低溫正常供水下ABS/RC，DIO/RC差異不顯著，TRO/RC，ETO/RC顯著降低（Plt;0.05），室溫干旱下隨著干旱脅迫增加ABS/RC，TRO/RC，DIO/RC逐漸增加且差異顯著（Plt;0.05），ETO/RC降低且差異顯著（Plt;0.05）。雙重脅迫相較于對(duì)應(yīng)單一干旱（TR+D2，TR+D3），TL+D2，TL+D3下ABS/RC，TRO/RC，ETO/RC，DIO/RC均顯著降低（Plt;0.05）（圖5A，5C，5E，5G）。在‘WL525HQ’中，低溫正常供水下ABS/RC，DIO/RC顯著增加（Plt;0.05），TRO/RC差異不顯著，ETO/RC顯著降低（Plt;0.05）。此外，室溫下除了重度干旱會(huì)導(dǎo)致ABS/RC，TRO/RC，DIO/RC顯著上升（Plt;0.05）外，其余干旱對(duì)ABS/RC，TRO/RC，DIO/RC，ETO/RC無(wú)顯著影響，相較于低溫，雙重脅迫增加了ETO/RC以及降低了DIO/RC且差異顯著（Plt;0.05）（圖5B，5D，5F，5H）。這表明，在‘WL525HQ’中，雙重脅迫緩解了單一低溫對(duì)反應(yīng)中心的影響，在‘新牧4號(hào)’中，雙重脅迫緩解了單一干旱對(duì)反應(yīng)中心的影響。此外，低溫導(dǎo)致反應(yīng)中心受損是由于單位反應(yīng)中心捕獲的用于電子傳遞的能量減少，且秋眠級(jí)較高的‘WL525HQ’受損更嚴(yán)重，同時(shí)，干旱對(duì)秋眠級(jí)較高的‘WL525HQ’的影響小于秋眠級(jí)較低的‘新牧4號(hào)’。

2.6 順-3-己烯醇對(duì)低溫和干旱下紫花苜蓿葉片PSII活性的影響

低溫誘導(dǎo)植物產(chǎn)生的順-3-己烯醇（（Z）-3-hexenol，z3HOL）可以提高植物在低溫下的抗旱性，為進(jìn)一步研究低溫干旱雙重脅迫對(duì)苜蓿的交互作用，通過(guò)外源噴施z3HOL研究該物質(zhì)對(duì)苜蓿單一干旱或低溫脅迫下的傷害的影響。結(jié)果表明，重度干旱（TR+D3）下外源噴施z3HOL時(shí)（TR+D3+z3HOL）Fv/Fm顯著上升（Plt;0.05），低溫（TL+D0）下噴施z3HOL時(shí)（TL+D0+z3HOL）Fv/Fm顯著上升（Plt;0.05），這表明低溫誘導(dǎo)的z3HOL顯著減輕了干旱對(duì)苜蓿PSII的傷害，此外，外源噴施z3HOL顯著減輕了低溫對(duì)苜蓿PSII的傷害。

根據(jù)表1雙因素方差分析可知，除了在‘WL525HQ’中TRO/RC和ABS/RC的交互作用不顯著外，溫度脅迫、干旱脅迫以及二者交互作用對(duì)紫花苜蓿葉片干重、各項(xiàng)熒光指標(biāo)的影響顯著（Plt;0.01），即二者之間的作用可以共同緩解單一脅迫對(duì)紫花苜蓿葉片干重以及各項(xiàng)熒光指標(biāo)的影響。

3 討論

低溫、干旱以及雙重脅迫對(duì)紫花苜蓿PSII的影響部位及損傷程度不同。雙重脅迫降低了單位反應(yīng)中心捕獲的用于電子傳遞的能量，PSII反應(yīng)中心受損，QA-QB的電子傳遞受阻［26］，受體側(cè)受到損傷。低溫同樣導(dǎo)致PSII反應(yīng)中心和受體側(cè)受損，但相較于低溫，雙重脅迫沒(méi)有增加PSII反應(yīng)中心和受體側(cè)受到的傷害反而有一定緩解作用。干旱導(dǎo)致放氧復(fù)合體（Oxygen evolving complex，OEC）受損［27］、PSII復(fù)合體各單元發(fā)生解離［28］以及QA-QB的電子傳遞受阻，造成PSII供/受體側(cè)以及復(fù)合體受損且隨著干旱濃度增加傷害加重。輕度干旱對(duì)苜蓿葉片反應(yīng)中心無(wú)顯著的傷害，中度和重度干旱時(shí)過(guò)剩電子產(chǎn)生，從而對(duì)反應(yīng)中心造成傷害。而雙重脅迫導(dǎo)致ETO/RC降低，同時(shí)加重了PSII受體側(cè)受到的傷害，但雙重脅迫緩解甚至消除了干旱對(duì)PSII供體側(cè)及復(fù)合體受到的損傷，從而造成了與干旱不同的結(jié)果。

前人研究表明，低溫導(dǎo)致PSII受體側(cè)、PSII復(fù)合體以及反應(yīng)中心受損，這可能是由于低溫導(dǎo)致線性電子傳遞和二氧化碳固定能力下降［29］。同時(shí)，低溫不影響供體側(cè)而產(chǎn)生的大量電子堆積在反應(yīng)中心，最終PSII反應(yīng)中心過(guò)剩激發(fā)能的積累導(dǎo)致單線態(tài)氧和其他活性氧的產(chǎn)生并破壞PSII［30］，有活性的反應(yīng)中心數(shù)目下降以及PSII核心蛋白（D1）降解大于合成導(dǎo)致QA-QB電子傳遞受阻而引起受體側(cè)限制［26］，最終對(duì)PSII的活性造成傷害。大量研究表明，干旱會(huì)引起植株水分虧缺以及活性氧清除酶活性下降［31］，同時(shí)，破壞葉綠體結(jié)構(gòu)導(dǎo)致光合作用下降［32］，這可能是由于水分虧缺影響了PSII供體側(cè)的水裂解產(chǎn)生的電子數(shù)量以及光合機(jī)構(gòu)對(duì)光能的捕獲、能量轉(zhuǎn)化和傳遞進(jìn)一步影響反應(yīng)中心活性以及PSII受體側(cè)［33］。

雙重脅迫下，低溫可以導(dǎo)致苜蓿葉片氣孔關(guān)閉，有利于植株保水，減輕干旱對(duì)植物的影響［34］。Jin等指出低溫誘導(dǎo)的揮發(fā)性物質(zhì)順-3-己烯醇通過(guò)UGT85A53介導(dǎo)的ABA糖苷化合成整合茶樹(shù)低溫和干旱兩種脅迫，有效提高茶樹(shù)在低溫下的抗旱能力，減輕雙重脅迫下干旱對(duì)茶樹(shù)的傷害［35］，本文也進(jìn)一步驗(yàn)證了外源噴施順-3-己烯醇可以減輕干旱對(duì)苜蓿的傷害。此外，Jin等還發(fā)現(xiàn)低溫和干旱均可誘導(dǎo)順-3-己烯醇的產(chǎn)生［35］，而外源噴施順-3-己烯醇，可顯著提高苜蓿在低溫下的抗寒能力。這可能就是雙重脅迫緩解單一脅迫對(duì)苜蓿的影響的原因。

本研究表明，雙重脅迫下，苜蓿對(duì)低溫的響應(yīng)會(huì)影響干旱對(duì)其的傷害。因此推測(cè)，在對(duì)不同抗寒性的紫花苜蓿中，低溫和干旱雙重脅迫對(duì)苜蓿PSII活性的緩解的方式和程度不同。有研究指出，苜蓿秋眠級(jí)與其抗寒性有關(guān)［36］，秋眠級(jí)較低的‘新牧4號(hào)’抗寒性較強(qiáng)，對(duì)低溫敏感性較低，對(duì)干旱脅迫較為敏感。本文發(fā)現(xiàn)在雙重脅迫下，抗寒性較強(qiáng)的苜蓿中，低溫可緩解干旱對(duì)PSII供體側(cè)、復(fù)合體的傷害。而秋眠級(jí)較高的‘WL525HQ’抗寒性較差，但干旱對(duì)其傷害較小，僅重度干旱能對(duì)其造成顯著傷害；在低抗寒品種苜蓿中，低溫干旱雙重脅迫緩解了低溫對(duì)其PSII受體側(cè)、復(fù)合體以及反應(yīng)中心的傷害，同時(shí)緩解了干旱對(duì)PSII供體側(cè)、復(fù)合體的傷害。

4 結(jié)論

低溫和干旱對(duì)PSII活性的影響位點(diǎn)及程度不同，雙重脅迫可以緩解單一脅迫對(duì)苜蓿PSII復(fù)合體的傷害程度，但不同抗寒性苜蓿中其緩解位點(diǎn)不同。在高抗寒性的‘新牧4號(hào)’中，雙重脅迫還可緩解干旱對(duì)PSII供體側(cè)的傷害，而在低抗寒性的‘WL525HQ’中，雙重脅迫可緩解低溫對(duì)PSII反應(yīng)中心以及受體側(cè)的傷害，同時(shí)緩解干旱對(duì)PSII供體側(cè)、反應(yīng)中心的傷害。

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（責(zé)任編輯 閔芝智）

收稿日期：2023-08-27；修回日期：2023-11-08

基金項(xiàng)目：農(nóng)業(yè)生物育種重大專項(xiàng)-新疆地區(qū)耐鹽堿抗旱高產(chǎn)苜蓿新品種設(shè)計(jì)與培育（2022ZD0401104）；新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2022D01A185）；國(guó)家自然科學(xué)基金（32360346）資助

作者簡(jiǎn)介：趙堯堯（1998-），男，漢族，貴州遵義人，碩士研究生，主要從事植物逆境生理研究，E-mail：1963635954@qq.com；*通信作者 Author for correspondence，E-mail：Lebaby7@163.com