摘要：本研究旨在探討添加益生菌和葡萄糖對發(fā)酵八仙草（Galium aparine）品質(zhì)的影響及飼用效果評價。將采集的八仙草分為自然發(fā)酵組、益生菌組、糖+益生菌組、糖組，分別在第0，7，15，30，60，120 天測定八仙草品質(zhì)的變化，在發(fā)酵第120天檢測分析微生物群落并進(jìn)行飼用效果評價。結(jié)果表明，與自然發(fā)酵組相比，在發(fā)酵120天后，各試驗(yàn)組的pH值均顯著降低（Plt;0.05）；菌群分析顯示，與自然發(fā)酵組相比，糖+益生菌組菌群分類單元的數(shù)量增加，厚壁菌門相對豐度降低，變形菌門和擬桿菌門相對豐度提高，乳酸菌屬比例增加。飼用效果評價顯示，日糧中添加20%發(fā)酵八仙草干粉對小鼠各指標(biāo)無顯著影響。綜上，益生菌和糖可提升發(fā)酵后八仙草的品質(zhì)，降低pH值，提高菌群的豐度，可部分代替飼料使用。

關(guān)鍵詞：益生菌；糖；八仙草；菌群結(jié)構(gòu)；生物活性

中圖分類號：S816.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-0435（2024）04-1285-10

Effects of Probiotics and Sugar on the Quality of Fermented Galium aparine and Evaluation of Feeding Effect

ZHU Wen-juan1， CHEN Xiao-yu1， SHEN Rui-xue1， CHEN Cun-wu2*

Abstract：The aim of this study was to investigate the effects of probiotics and sugar on the quality of fermented Galium aparine and evaluate feeding effect. The four test groups were divided，including natural fermentation group，probiotic group，glucose-probiotic group，and glucose group. The variation of pH value and nutrient composition of Galium aparine were measured at 0，7th，15th，30th，60th，and 120th day，respectively，and the microbial community and bioactivity were evaluated at the 120th day of fermentation. The results showed that the pH values of all experimental groups were significantly lower than that in the natural fermentation group after 120 days of fermentation （Plt;0.05）;Analysis of the bacterial flora showed that compared with the natural fermentation group，the number of bacterial operational taxonomic units （OUTs） increased in the sugar+probiotic group，the relative abundance of the thick-walled phylum decreased，the relative abundance of the Proteobacteria and Bacteroidetes phylum increased，and the proportion of the Lactobacillus spp. increased. Evaluation of feeding effect showed that the addition of 20% fermented Galium aparine dry powder to the diet had no significant effect on the indicators of mice. In conclusion，probiotics and sugar enhanced the quality of fermented Galium aparine，reduced pH value，increased the abundance of bacterial flora，and could be used to partiallyreplace feed.

Key words：Probiotics;Glucose;Galium aparine;Flora structure;Biological activity

隨著人們生活水平的提高，畜禽產(chǎn)品占的消費(fèi)比重逐漸增加，較10年前上升超過20%，飼料糧需求也隨之增長，糧食消費(fèi)呈現(xiàn)口糧消耗量逐年減少、飼料糧消耗量持續(xù)攀升的特點(diǎn)［1］。據(jù)統(tǒng)計，我國2022年飼用糧食消費(fèi)量約占消費(fèi)總量的48%，按照當(dāng)前我國飼料轉(zhuǎn)化水平估算，2035年我國玉米等能量飼料缺口將超過8 800萬t，大豆等蛋白質(zhì)飼料缺口將超過1.24億t［1］。為此，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也發(fā)布了農(nóng)辦牧〔2023〕9號文件關(guān)于《飼用豆粕減量替代三年行動方案》，降低飼料中豆粕用量占比，提高替代類飼料的產(chǎn)量，包括飼草、餐桌殘余、微生物蛋白等非常規(guī)飼料［2］。這樣既能填補(bǔ)糧食短缺，又能提高資源利用率，符合綠色環(huán)保發(fā)展理念。發(fā)酵飼料近年來非?；馃?，主要以秸稈、牧草及加工副產(chǎn)物等原料為底物，以酵母、芽孢、乳酸菌等為發(fā)酵菌種，經(jīng)過一段時間厭氧發(fā)酵制得［3］。研究表明，發(fā)酵飼料可改善飼料的適口性、降低飼料中的毒素及抗?fàn)I養(yǎng)因子含量、調(diào)節(jié)畜禽腸道菌群及免疫功能、提高飼料消化率等［4-5］，在畜禽養(yǎng)殖上具有廣泛的應(yīng)用前景。

八仙草（Galium aparine）為一年生草本植物，是常見雜草，別名拉拉藤、爬拉殃等，《滇南本草》《貴州民間方藥集》《湖南藥物志》《云南中草藥》等記載八仙草具有清熱、解毒、消炎和利尿等功效［6］。現(xiàn)代藥理研究表明，其含有黃酮類、萜類、酚類和有機(jī)酸類等多種活性物質(zhì)［7-8］。本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)八仙草干物質(zhì)中粗蛋白含量約占20%，高于具有“牧草之王”之稱的苜蓿，可作為草料飼喂家畜，具有一定的飼用價值。然而，八仙草的適口性較差，制約了其進(jìn)一步在畜牧業(yè)中的推廣應(yīng)用。利用益生菌發(fā)酵不僅有利于牧草的保存，還可改善適口性，是飼草常見的一種處理方式。劉戰(zhàn)霞等［9］發(fā)現(xiàn)，利用益生菌發(fā)酵油菜秸稈，可提高甜味氨基酸含量，明顯改善油菜秸稈的營養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)。殷雨洋等［10］表明，與常規(guī)發(fā)酵相比，添加益生菌發(fā)酵可提高豆渣的乳酸含量，降低pH值以及乙酸和丁酸含量，改善發(fā)酵品質(zhì)。為此，本試驗(yàn)以發(fā)酵的方式處理八仙草，并添加糖和益生菌，比較發(fā)酵前后的營養(yǎng)成分差異，結(jié)合其中的菌群結(jié)構(gòu)差異，對發(fā)酵八仙草進(jìn)行飼用效果評價，以期為植物類發(fā)酵飼料的開發(fā)及八仙草的利用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 新鮮八仙草（采自皖西學(xué)院藥用植物園，31°45′ N，116°28′ E）；植物乳桿菌（ACCC11016）；MRS肉湯培養(yǎng)基（青島博奧生物科技有限公司）；小鼠維持日糧（江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司）；小鼠免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）、免疫球蛋白M（Immunoglobulin M，IgM） ELIAS試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；生化試劑盤（成都斯馬特科技有限公司）。

1.1.2 儀器設(shè)備 ATN-100凱氏定氮儀（上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司）；HR-F-1200馬弗爐（洛陽華熔窖爐有限公司）；DHG-9030A鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；CXC-06粗纖維測定儀（武漢格萊莫檢測設(shè)備有限公司）；SMT-120VP自動獸用生化分析儀（成都斯馬特科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)分組與設(shè)計

將新鮮八仙草用鍘刀切成2 cm左右的小段，分成4大組，自然發(fā)酵組（Z）、益生菌組（Y）、糖+益生菌組（TY）、糖組（T）。自然發(fā)酵組添加2%的蒸餾水；糖組添加1%葡萄糖和1%的蒸餾水；益生菌組添加1%益生菌和1%的蒸餾水；糖+益生菌發(fā)酵組添加1%葡萄糖和1%益生菌。每大組分6小組，每小組3個重復(fù)，每個重復(fù)200 g，共計4×6×3=72袋。裝入密封袋中（300 mm ×340 mm），壓實(shí)并抽干袋內(nèi)剩余空氣，室溫放置發(fā)酵，期間若發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣及時抽出。分別在發(fā)酵第0，7，15，30，60和120 d進(jìn)行取樣，并測定八仙草營養(yǎng)成分，發(fā)酵120 d后進(jìn)行微生物群落檢測分析。

1.3 八仙草發(fā)酵相關(guān)指標(biāo)檢測

發(fā)酵八仙草pH值測定：采用pH計檢測新鮮發(fā)酵八仙草的pH值。

干物質(zhì)（Dry matter，DM）含量測定：精確稱取烘干的發(fā)酵八仙草100 g（M），置于105℃烘箱中干燥至恒量（M1），計算干物質(zhì)含量（DM=M1/M×100）。

粗蛋白（Crude protein，CP）含量測定：參照GB/T 6432-2018《飼料中粗蛋白測定方法》［11］，采用凱氏定氮法測定發(fā)酵八仙草中的氮含量，并根據(jù)氮含量×6.25計算粗蛋白含量。

粗脂肪（Ether extract，EE）含量測定：參照GB/T 6433-2006《飼料中粗脂肪測定方法》［12］測定粗脂肪含量。

粗纖維（Crude fibre，CF）含量測定：參照GB/T 6434-2022《飼料中粗纖維的含量測定》［13］，采用過濾法測定粗纖維含量。

粗灰分（Crude ash，CA）含量測定：參照GB/T 6438-2007《飼料中粗灰分的測定》［14］，樣品在550℃下灼燒后所得殘渣質(zhì)量，用質(zhì)量百分率來表示。

1.4 發(fā)酵八仙草菌群分析

取各組發(fā)酵120 d的樣品，每組取3份，送至南京擎科生物科技有限公司檢測，基于Illumina Novaseq測序平臺進(jìn)行16S rRNA二代測序。依次使用Trimmomatic v0.33軟件對測得序列進(jìn)行質(zhì)量控制，Usearch v10軟件拼接，UCHIME v4.2軟件去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)，使用QIIME2軟件，對樣品alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行評估。對結(jié)果進(jìn)行分類單元（Operational taxonomic units，OTU）分析、豐度分析、alpha多樣性分析、顯著物種差異分析、相關(guān)性分析、KEGG功能預(yù)測分析等，進(jìn)一步挖掘樣品之間的差異。

1.5 八仙草生物活性分析

雌性ICR小鼠20只（許可證號SCXK（豫）2020-0005），6周齡體質(zhì)量為（18±2） g，隨機(jī)分成4組，每組5只，分別為空白組和八仙草低、中、高劑量組。低、中、高劑量組分別在日糧中添加10%，20%，40%的1%葡萄糖和1%益生菌發(fā)酵120 d的八仙草干粉，空白組飼喂維持日糧，試驗(yàn)期間自由采食，分別在第1，7，15，30 d稱重，第30 d后采集血液，分離血清檢測生化指標(biāo)，包括總蛋白（Total protein，TP）、白蛋白（Albumin，ALB）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase-glutamate pyruvic transaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，γ-GGT）、尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（Creatinine，CRE）和血清IgG，IgM抗體水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

部分?jǐn)?shù)據(jù)以均值或均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 21.0進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加益生菌和糖對發(fā)酵八仙草pH值的影響

如表1所示，在發(fā)酵第7 d和15 d后，與自然發(fā)酵組相比，各組的pH值顯著降低（Plt;0.05）；發(fā)酵30 d后，自然發(fā)酵組與益生菌組pH值無顯著差異；發(fā)酵60 d后，各組之間差異顯著（Plt;0.05）；發(fā)酵120 d后，各組的pH值比發(fā)酵60 d升高，其中自然發(fā)酵組最高。整個發(fā)酵過程中，同時添加益生菌和糖組的pH值最低。

2.2 添加益生菌和糖對發(fā)酵八仙草營養(yǎng)成分的影響

如表2所示，比較在發(fā)酵過程中各時間段的營養(yǎng)成分變化，在120 d時，發(fā)酵八仙草的粗灰分和粗纖維降低，粗脂肪、粗蛋白及干物質(zhì)含量略微升高，其中以添加1%糖和1%益生菌組的效果最佳。

2.3 發(fā)酵八仙草中菌群OTUs聚類分析

結(jié)果如圖1所示，自然發(fā)酵組含有的OTU最少，為157個，添加益生菌和糖組OTU最多，為263個。其中，四組中共有的OTU為79個。

2.4 發(fā)酵八仙草中菌群alpha多樣性分析

結(jié)果如表3所示，各組之間的ACE，Chao1，PD_whole_tree，Coverage指數(shù)差異不顯著。與自然發(fā)酵組相比，1%糖組、1%糖和1%益生菌組的Simpson，Shannon指數(shù)顯著升高（Plt;0.05），益生菌組差異不顯著。

2.5 發(fā)酵八仙草中菌群群落結(jié)構(gòu)分析

由圖2可知，在門水平上，各組的菌群結(jié)構(gòu)以厚壁菌門為主，其中自然發(fā)酵組門水平菌群的相對豐度最高；添加糖組的菌群以擬桿菌門豐度升高為主，添加1%糖和1%益生菌組的變形菌門、擬桿菌門、放線菌門相對豐度升高。

由圖3可知，比較菌群屬水平相對豐度，自然發(fā)酵組主要以乳桿菌屬為主，其次為片球菌屬；1%益生菌組以乳桿菌屬為主；1%糖和1%益生菌組以其它屬細(xì)菌相對豐度最高；糖添加組主要為以乳桿菌屬和片球菌屬較多。

2.6 發(fā)酵八仙草中菌群豐度聚類分析

如圖4所示，添加糖和益生菌組的菌群豐度最高，其次為糖添加組。與自然發(fā)酵組相比，處理組的厚壁菌門菌群相對豐度降低，但疣微菌門（Verrucomicrobiota）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、放線菌門（Actinobacteriota）、脫硫菌門（Desulfobacterota）等菌群相對豐度增多。

2.7 發(fā)酵八仙草中菌群主成分分析

如圖5所示，比較組間差異，各組樣本分布在不同區(qū)域，各組間差異十分明顯；比較組內(nèi)差異，以1%糖和1%益生菌組的主成分差異最小，1%益生菌組內(nèi)的主成分差異最大。與自然發(fā)酵組相比，添加糖+益生菌組距離最遠(yuǎn)，表明該組的菌群主成分差異最大。

2.8 發(fā)酵八仙草中菌群KEGG功能預(yù)測分析

結(jié)果如圖6所示，在菌群20種門水平上預(yù)測了45種功能，其中全球和概覽圖、氨基酸代謝、碳水化合物代謝、膜運(yùn)輸、輔助因子和維生素的代謝等為主要的代謝通路。

2.9 發(fā)酵八仙草粉對小鼠體重的影響

如圖7所示，與空白組相比，飼料中添加10%，20%，40%的發(fā)酵八仙草對小鼠第1 d，7 d，15 d，30 d的體重影響不顯著。

2.10 發(fā)酵八仙草粉對小鼠血清生化指標(biāo)的影響

如表4所示，與空白組相比，高劑量組小鼠的TP和ALB水平顯著降低（Plt;0.05），ALT，AST，ALP，γ-GGT水平顯著升高（Plt;0.05）；低劑量組小鼠的各項指標(biāo)差異并不顯著；中劑量組小鼠僅AST顯著升高（Plt;0.05），其余各項指標(biāo)差異并不顯著。

2.11 發(fā)酵八仙草粉對小鼠血清抗體水平的影響

如圖8所示，與空白組相比，低劑量組和中劑量組小鼠血清IgG水平升高，高劑量組則表現(xiàn)出降低，但差異并不顯著，各組小鼠血清IgM水平均未表現(xiàn)出顯著差異。

3 討論

發(fā)酵飼料主要是利用多種有益微生物，如酵母菌、乳桿菌、芽孢菌等，利用飼料中養(yǎng)分生長繁殖并產(chǎn)生大量的代謝物所制備的一類新型飼料［15］。在發(fā)酵過程中，大分子營養(yǎng)物質(zhì)被降解成易吸收的小分子物質(zhì)，如氨基酸、多肽、短鏈脂肪酸等［16］。不僅如此，有些益生菌還可產(chǎn)生豐富的有機(jī)酸、短鏈脂肪酸等，軟化飼料改善適口性。研究證實(shí)，有機(jī)物在微生物的作用下被分解為氨基酸、單糖及脂肪酸等小分子物質(zhì)，產(chǎn)酸菌利用這些物質(zhì)進(jìn)一步厭氧發(fā)酵，產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸等有機(jī)酸類及醇類［17］，從而降低pH值。Wang等［18］在研究乳酸菌發(fā)酵辣木葉的過程中發(fā)現(xiàn)，添加乳酸菌后的整個發(fā)酵過程辣木葉的pH值均顯著降低。本研究結(jié)果顯示，添加糖和益生菌的八仙草發(fā)酵一周后pH值顯著降低。營養(yǎng)成分是評價飼料的重要指標(biāo)之一，包括粗蛋白、粗脂肪、粗灰分等指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中八仙草的營養(yǎng)成分變化并不顯著，僅在發(fā)酵120 d時，粗蛋白和粗脂肪有略微提高。這一結(jié)果與Wang和韓紅燕等［19-20］報道的結(jié)果一致。楊勁松等［21］在開展不同菌種和發(fā)酵時間對殘次棗營養(yǎng)成分影響時發(fā)現(xiàn)，添加植物乳桿菌及丁酸鈉發(fā)酵60 d可顯著提高殘次棗中粗蛋白含量，并降低粗纖維含量。因此，發(fā)酵過程中營養(yǎng)成分的改變可能主要與發(fā)酵菌種、底物及發(fā)酵時間有關(guān)。

不同的微生物在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物，從而影響發(fā)酵效果。乳酸菌作為常見產(chǎn)酸菌，是用于發(fā)酵的主要菌種之一。劉輝等［22］報道，添加乳酸菌可降低飼料的pH值，有利于提高飼料品質(zhì)。本研究選擇植物乳桿菌作為發(fā)酵菌株，發(fā)酵八仙草中菌群OTU聚類分析結(jié)果顯示，添加糖和益生菌組的聚類數(shù)增多，物種豐度增加，可能與發(fā)酵環(huán)境的改變有關(guān)。Eikmeyer等［23］分析自然發(fā)酵14 d和58 d牧草的菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)厚壁菌門為優(yōu)勢菌門，本研究中自然發(fā)酵組的結(jié)果與該報道結(jié)果一致。在添加糖和/或益生菌之后，在門水平上，變形菌門、擬桿菌門、放線菌門增多，在屬水平上以慢乳桿菌屬和片球菌屬增多為主。Liu等［24］在添加乳酸菌發(fā)酵大麥過程中發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門及變形菌門為優(yōu)勢菌門，乳酸菌屬的豐度增加。這可能與添加乳酸菌改變發(fā)酵環(huán)境密不可分。微生物在存活期間的代謝活動會產(chǎn)生多種多樣的代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物可能是其發(fā)揮生物功能的重要體現(xiàn)。本研究對菌群KEGG功能預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)各菌門的功能比較接近，均是以氨基酸代謝、碳水化合物代謝、膜運(yùn)輸?shù)葹橹?，這與冼芳瑩等［25］報道的結(jié)果一致。

血清生化指標(biāo)是反映機(jī)體組織器官狀態(tài)的常見指標(biāo)之一，在對發(fā)酵八仙草活性評價中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加量達(dá)到40%時，小鼠的多項生化指標(biāo)發(fā)生變化。TP是肝臟合成分泌的蛋白，包括白蛋白和球蛋白，通常作為評價肝功能和免疫功能的常用指標(biāo)［26-27］。本研究中發(fā)現(xiàn)，飼喂添加40%發(fā)酵八仙草粉的飼料后，小鼠血清中TP和ALB顯著降低，表明飼喂發(fā)酵八仙草粉對小鼠肝臟蛋白的合成分泌產(chǎn)生一定的影響。AST和ALT主要分布于肝細(xì)胞中，當(dāng)肝細(xì)胞破壞時，會急劇上升幾倍甚至數(shù)十倍，是評價肝功能的重要指標(biāo)。ALP和γ-GGT雖然在全身組織均有分布，但血清中的主要來源于肝臟，因此常用來作為評價肝功能的主要指標(biāo)［28-29］。本研究結(jié)果顯示，高劑量組小鼠血清中AST，ALT，ALP和γ-GGT均顯著升高，結(jié)合TP和ALB升高，說明飼喂高劑量發(fā)酵八仙草粉對小鼠的肝功能造成一定的影響，這與Sahin等［30］研究結(jié)果相悖，其研究表明八仙草可保護(hù)對乙酰氨基酚造成的肝臟損傷，這可能和使用的量密切相關(guān)，本研究中，飼喂低、中劑量發(fā)酵八仙草粉對小鼠肝功能未造成不良影響。由于未見八仙草損傷肝功能的相關(guān)文獻(xiàn)報道，具體原因還有待進(jìn)一步研究。BUN和CRE是機(jī)體氮代謝的主要產(chǎn)物，可通過腎小球?yàn)V過經(jīng)尿液排出體外。試驗(yàn)小鼠血清中BUN，CRE，IgG，IgM未發(fā)生顯著變化，表明發(fā)酵八仙草對小鼠腎功能及血清抗體水平未造成影響。

4 結(jié)論

添加糖和益生菌可顯著降低發(fā)酵過程中的pH值，發(fā)酵120天后八仙草的粗纖維和粗灰分降低，粗脂肪、粗蛋白及干物質(zhì)含量提高，發(fā)酵八仙草的菌群豐度增加，改變優(yōu)勢菌群的結(jié)構(gòu)，以厚壁菌門、變性菌門及擬桿菌門增多為主；這些菌群與氨基酸的代謝、糖類的水解合成等功能密切相關(guān)。高劑量發(fā)酵八仙草對小鼠肝功能有輕微影響，但對腎功能和血清抗體水平無不良影響。

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（責(zé)任編輯 閔芝智）

收稿日期：2023-09-16；修回日期：2023-12-28

基金項目：安徽省科技廳重大專項（202003c08020004）資助

作者簡介：朱文娟（1983-），女，漢族，安徽六安人，碩士研究生，副教授，主要從事生物發(fā)酵工程研究，E-mail：zhuwenjuan1205@126.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：328169974@qq.com