摘要：為探索鋁激活蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Aluminum-activated malate transporter，ALMT）在植物適應(yīng)酸性土壤鋁毒害中的重要作用，本研究以柱花草（Stylosanthes guianensis）為研究材料，克隆了柱花草SgALMT1基因，并進(jìn)行了生物信息學(xué)、亞細(xì)胞定位及基因表達(dá)分析。結(jié)果表明：SgALMT1基因全長(zhǎng)為1 350 bp，編碼450個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子量為50.6 kDa，包含6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域；亞細(xì)胞定位分析表明，SgALMT1蛋白定位在擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞膜上，為膜蛋白。定量PCR結(jié)果表明，SgALMT1基因在柱花草葉中的表達(dá)量高于根中的表達(dá)量；鋁處理增強(qiáng)了SgALMT1基因在柱花草根中的表達(dá)，表明SgALMT1基因可能參與了柱花草應(yīng)對(duì)鋁脅迫；另外，缺氮處理增強(qiáng)了SgALMT1基因在柱花草葉中的表達(dá)，而缺磷處理增強(qiáng)了SgALMT1在根中的表達(dá)。本研究結(jié)果為解析柱花草響應(yīng)鋁毒害和養(yǎng)分缺乏的機(jī)理提供了候選基因資源。

關(guān)鍵詞：柱花草；鋁毒害；基因表達(dá)；蘋果酸；亞細(xì)胞定位

中圖分類號(hào)：S541 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-0435（2024）04-1078-09

Cloning and Expression Analysis of SgALMT1 in Stylosanthes guianensis

MIAO Ye LIU Huai-jin1， LIU Li-ting1， LUO Li-juan1， CHEN Zhi-jian2，3*

Abstract：To investigate the important role of aluminum （Al）-activated malate transporter （ALMT） in plant adaptation to Al toxicity in acidic soils，SgALMT1 gene was cloned from stylo （Stylosanthes guianensis），its bioinformation，subcellular localization and expression pattern were subsequently analyzed in this study. The results showed that the SgALMT1 gene was 1 350 bp in length，encoding 450 amino acids. The SgALMT1 protein possessed a molecular weight of 50.6 kDa and was predicted to include six transmembrane domains. Subcellular localization analysis in Arabidopsis protoplasts showed that SgALMT1 was localized on the plasma membrane，suggesting it was a membrane protein. RT-qPCR analysis demonstrated that the expression of SgALMT1 in leaves was higher than that in roots. Al treatment enhanced the expression of SgALMT1 in roots of S. guianensis，suggesting that SgALMT1 may be involved in the response of S. guianensis to Al toxicity. In addition，the transcripts of SgALMT1 in leaves was increased by nitrogen deficient treatment，while its expression was up-regulated in roots by phosphorus deficiency. Taken together，the study provides a candidate gene for dissecting the adaptative mechanism of S. guianensis to Al toxicity and nutrient deficiency.

Key words：Stylosanthes guianensis;Aluminium toxicity;Gene expression;Malate;Subcellular localization

酸性土壤是pH值低于5.5的土壤，占全球耕地面積50%以上，并主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)［1-2］。在我國(guó)，酸性土壤主要分布在南方省區(qū)，約占全國(guó)耕地面積的21%［3］。在酸性土壤中，存在有影響作物產(chǎn)量的諸多不利因素，包括有機(jī)質(zhì)含量低、鋁（Al）和錳（Mn）元素毒害以及磷（P）、鈣（Ca）和鎂（Mg）等營(yíng)養(yǎng)元素缺乏［4］。其中，鋁毒害是酸性土壤中限制作物生長(zhǎng)的主要障礙因素之一。在低pH酸性條件下，土壤溶液中的鋁主要以3價(jià)鋁離子（Al3+）形式存在［5-6］，而鋁離子會(huì)抑制植物根尖細(xì)胞的伸長(zhǎng)，減少植物對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收［7］。植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成了內(nèi)部忍耐和外部排斥的耐鋁毒機(jī)制。內(nèi)部忍耐機(jī)制包括有機(jī)酸在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)螯合鋁和將鋁隔離在液泡等，而外部排斥機(jī)制包括根系分泌有機(jī)酸螯合鋁、提高根際pH值和細(xì)胞壁固定鋁等方面［2］。其中，根系分泌有機(jī)酸（如蘋果酸、檸檬酸和草酸）螯合鋁離子，阻止鋁進(jìn)入根尖細(xì)胞，減少鋁的吸收被認(rèn)為是植物耐鋁的重要機(jī)制［8-9］。

近年來(lái)，介導(dǎo)有機(jī)酸轉(zhuǎn)運(yùn)的基因已被克隆，其生物學(xué)功能也已被鑒定。例如，鋁激活蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Aluminum-activated malate transporter，ALMT）負(fù)責(zé)蘋果酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，而多藥物及毒性化合物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Multidrug and toxic compound extrusion，MATE）負(fù)責(zé)檸檬酸的轉(zhuǎn)運(yùn)［9］，它們?cè)谥参锬弯X中發(fā)揮重要作用。小麥（Triticum aestivum）TaALMT1是首個(gè)被克隆的植物ALMT基因。TaALMT1是細(xì)胞膜蛋白，該蛋白能被鋁離子激活表達(dá)，在鋁脅迫下參與根系蘋果酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而增強(qiáng)小麥的耐鋁能力［10］。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）［11-13］、油菜（Brassica napus）［14］、紫花苜蓿（Medicago sativa）［15］和大豆（Glycine max）［16-17］等植物中也相繼報(bào)道了ALMT的同源基因。例如，在擬南芥中，包含有14個(gè)AtALMTs基因［11-13］。AtALMT1也被發(fā)現(xiàn)具有介導(dǎo)蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)從而參與鋁耐受性的功能，而AtALMT6和AtALMT9參與了氣孔調(diào)節(jié)［11-13］。另外，在油菜中共鑒定到39個(gè)BnALMTs基因［18］，其中，BnALMT1和BnALMT2具有調(diào)控蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)的功能，外源表達(dá)BnALMT1和BnALMT2均增強(qiáng)了煙草（Nicotiana tabacum）細(xì)胞的耐鋁性［19］。因此，ALMT家族成員在響應(yīng)鋁脅迫、氣孔調(diào)節(jié)和陰離子平衡等方面發(fā)揮作用［20］。

柱花草（Stylosanthes guianensis）是重要的熱帶豆科牧草，起源于熱帶和亞熱帶地區(qū)。柱花草可廣泛用于綠肥覆蓋、果園間作和牧草飼料等方面［21］。因柱花草種植于熱帶亞熱帶地區(qū)，而這些地區(qū)同時(shí)也是酸性土壤分布的主要區(qū)域，表明柱花草對(duì)酸性土壤養(yǎng)分逆境脅迫具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，是研究植物適應(yīng)酸性土壤生長(zhǎng)的豆科先鋒牧草［22-23］。前期研究對(duì)不同柱花草的耐鋁能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)分析［24-25］，發(fā)現(xiàn)柱花草蘋果酸酶和蘋果酸脫氫酶具有調(diào)控根系蘋果酸合成的生物學(xué)功能，參與了柱花草響應(yīng)酸鋁脅迫［26-27］。然而，迄今為止，未有對(duì)柱花草蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)行克隆及分析的報(bào)道，蘋果酸參與柱花草耐鋁毒的分子機(jī)制仍不清楚。因此，本研究克隆了柱花草SgALMT1基因，并進(jìn)行了生物信息學(xué)、亞細(xì)胞定位及基因表達(dá)分析，為深入研究SgALMT1基因參與柱花草耐鋁毒的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用試驗(yàn)材料為‘熱研5號(hào)’圭亞那柱花草（Stylosanthes guianensis）。柱花草種子由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)材料培養(yǎng)及處理 柱花草種子去種皮后放入裝有去離子水的離心管中，并置于80℃水浴鍋中加熱3 min，隨后將種子平鋪在放有浸濕濾紙的培養(yǎng)皿中，避光萌發(fā)2～3 d。將萌發(fā)后的柱花草幼苗轉(zhuǎn)移至Hoagland營(yíng)養(yǎng)液（pH 5.8）中進(jìn)行培養(yǎng)［28］。柱花草正常培養(yǎng)28 d后，分別進(jìn)行以下處理：①收獲葉和根系樣品，并收獲距離根尖0～1 cm，1～2 cm和大于2 cm的不同根段樣品，用于基因組織表達(dá)分析［28］；②由于500 μmol·L-1CaCl2溶液可以有效維持細(xì)胞的滲透壓，因此，將柱花草轉(zhuǎn)移至含有0，100 μmol·L-1AlCl3，40 μmol·L-1CdCl3和20 μmol·L-1LaCl2的500 μmol·L-1CaCl2溶液（pH 4.2）中分別進(jìn)行鋁（Al）、鎘（Cd）和鑭（La）處理［29］，處理24 h后收獲根系樣品，用于分析不同金屬處理對(duì)基因表達(dá)的影響；③將柱花草置于0，100，200和400 μmol·L-1 AlCl3處理液（pH 4.2）中，處理48 h后收獲根系樣品，另外，將柱花草置于200 μmol·L-1 AlCl3處理液（pH 4.2）中，分別于處理第0，12，24，36和48 h收獲根系樣品，用于基因表達(dá)分析；④將柱花草置于缺氮（-N）、缺磷（-P）和缺鉀（-K）的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液（pH 5.8）中［27］，處理14 d后，收獲葉和根系樣品，用于分析不同缺素處理對(duì)基因表達(dá)的影響。以上處理均包括3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 柱花草RNA的提取與cDNA的合成 取0.1 g柱花草葉或根系樣品用TRIzol Universal RNA提取試劑（Tiangen，中國(guó)）提取總RNA，取2 μg總RNA使用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesie Kit試劑盒（Vazyme，中國(guó)）合成cDNA，cDNA置于—20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 SgALMT1基因的全長(zhǎng)克隆 參考Song等［27］方法，獲得SgALMT1基因全長(zhǎng)序列，根據(jù)基因序列信息設(shè)計(jì)全長(zhǎng)克隆引物SgALMT1-ORF-F/R（表1）。以柱花草cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：2 μL 10× PCR buffer，1.6 μL dNTP，1 μL引物（10 μmol·L-1），0.1 μL Ex Taq（Takara，中國(guó)），1 μL cDNA模板，補(bǔ)充dd H2O至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 4 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1.5 min，35次循環(huán)。獲得SgALMT1基因全長(zhǎng)片段，將PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上（Takara，中國(guó)）。通過(guò)熱擊法，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α（上海唯地生物技術(shù)有限公司，中國(guó)），將菌液涂布到含100 μg·mL-1氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基（10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl和15 g Agar）上，于37℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12 h，挑取單克隆于LB液體培養(yǎng)基（10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物和10 g NaCl）上，PCR鑒定陽(yáng)性克隆后，于生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.4 SgALMT1基因生物信息學(xué)分析 使用Expasy（https：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白基本信息；通過(guò)InterPro（https：//www.ebi.ac.uk/interpro）分析蛋白結(jié)構(gòu)域；使用MEGA6來(lái)構(gòu)建進(jìn)化樹，并使用Evolview（Evolview：Tree View）進(jìn)行進(jìn)化樹美化。

1.2.5 SgALMT1基因?qū)崟r(shí)熒光定量（RT-qPCR）分析 參考Song等［27］方法，用QuantStiduoTM Real-Time PCR（Thermo Fisher，美國(guó)）和SYBR Green（Vazyme，中國(guó)）進(jìn)行基因表達(dá)分析。RT-qPCR反應(yīng)體系為：10 μL 2×SYBR Green PCR master mix，6 μL dd H2O，1 μL引物（10 μmol·L-1），2 μL稀釋50倍的cDNA模板。RT-qPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 1 min，94℃ 15 s，58℃ 15 s，72℃ 30 s，40次循環(huán)。以SgEF1a為內(nèi)參基因計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。RT-qPCR引物如表1所示。

1.2.6 SgALMT1蛋白亞細(xì)胞定位分析 根據(jù)SgALMT1基因序列設(shè)計(jì)SgALMT1-GFP-F/R特異引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將PCR產(chǎn)物連接到pBWA（V）HS-ccdb-GLosgfp瞬時(shí)表達(dá)載體上［27］。參考Yoo等［30］制備原生質(zhì)的方法，即切取2～4片生長(zhǎng)3周的擬南芥葉片，并切成1 mm寬的長(zhǎng)條，迅速放入10～15 mL酶解液（20 mmol·L-1嗎啉乙磺酸，含1.5% 纖維素酶R10、0.4% 離析酶R10、0.4 mol·L-1甘露醇和 20 mmol·L-1 KCl，pH 5.7）中，27℃ 70 r·min-1反應(yīng)3 h。4℃ 100×g（離心力）離心2 min，棄上清液。加入5～10 mL預(yù)冷的W5溶液（2 mmol·L-1嗎啉乙磺酸含154 mmol·L-1 NaCl、125 mmol·L-1 CaCl2和5 mmol·L-1 KCl，pH 5.7），輕輕重懸沉淀，4℃ 100×g離心2 min，棄上清液。加入10 mL預(yù)冷的W5溶液，重懸沉淀，冰上靜置30 min，4℃ 100×g離心2 min，小心收集沉淀。加入適量預(yù)冷的MMG溶液（4 mmol·L-1 2-嗎啉乙磺酸含0.4 mol·L-1甘露醇和15 mmol·L-1 MgCl2，pH 5.7），小心重懸原生質(zhì)體。取10 μL質(zhì)粒加入至制備好的100 μL原生質(zhì)體中，加入110 μL PEG（聚乙二醇）/Ca2+溶液，輕輕混勻，室溫放置15 min。加入500 μL W5溶液，輕輕混勻，100×g離心2 min，棄上清，重復(fù)該步驟2次，加入1 mL W5溶液混勻，室溫避光培養(yǎng)12 h。采用激光共聚焦顯微鏡Nikon C2（Nikon，日本）進(jìn)行熒光觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2021進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。使用SPSS V26.0（SPSS Institute，美國(guó)）進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 柱花草SgALMT1基因全長(zhǎng)克隆

本研究首先根據(jù)SgALMT1基因序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)克隆引物，以柱花草cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得SgALMT1基因全長(zhǎng)片段。DNA凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)，PCR產(chǎn)物片段在1 000～1 500 bp之間（圖1），經(jīng)測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，SgALMT1基因全長(zhǎng)為1 350 bp。

2.2 SgALMT1蛋白特性和結(jié)構(gòu)分析

利用Expasy在線工具分析發(fā)現(xiàn)SgALMT1蛋白包含450個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子量為50.6 kDa，等電點(diǎn)為7.4，屬于親水性蛋白。利用InterPro在線工具分析發(fā)現(xiàn)SgALMT1蛋白屬于ALMT家族成員，包含ALMT蛋白的保守序列PF11744。此外，SgALMT1蛋白具有6個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，分別位于N端的40～58，65～87，97～116，123～140，150～167和180～202氨基酸。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，不同植物的ALMT蛋白可被分為3大組（圖2）。第1組包括擬南芥、大豆、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、小麥（Triticum aestivum），油菜等植物的ALMT蛋白；第2組包括大豆、水稻和擬南芥的ALMT蛋白；柱花草SgALMT1蛋白被分在第3組，與大豆的GmALMT3和水稻OsALMT1/3同源性較高，且與大豆GmALMT1、擬南芥的AtALMT3/4/5/6和繡球花（Hydrangea macrophylla）HmALMT9在同一大組中，表明其可能具有這些ALMT同源蛋白類似的功能。

2.4 SgALMT1蛋白亞細(xì)胞定位分析

本研究在擬南芥葉片原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)SgALMT1蛋白，分析SgALMT1的亞細(xì)胞定位情況。由圖3可以看出，空載體對(duì)照（35S∶GFP）的熒光信號(hào)在整個(gè)細(xì)胞中均可觀察到，并主要集中在細(xì)胞質(zhì)中，而SgALMT1蛋白（35S∶SgALMT1-GFP）的熒光信號(hào)定位在細(xì)胞膜上，表明SgALMT1為膜蛋白，可能具有轉(zhuǎn)運(yùn)功能。

2.5 柱花草SgALMT1基因組織表達(dá)分析

本研究進(jìn)一步通過(guò)RT-qPCR方法分析了SgALMT1基因在柱花草葉和根中的表達(dá)情況。從圖4A可以看出，SgALMT1基因在葉和根中均有表達(dá)，且在葉中的表達(dá)量高于根中的表達(dá)量。另外，SgALMT1基因在不同根段中的表達(dá)差異不顯著（圖4B）。

2.6 不同金屬處理對(duì)SgALMT1基因表達(dá)的影響

從圖5可以看出，與對(duì)照（CK）相比，鋁（Al）處理顯著增強(qiáng)了SgALMT1基因在柱花草根中的表達(dá)，而鎘（Cd）和鑭（La）處理對(duì)SgALMT1基因表達(dá)的影響不顯著；在鋁處理下，SgALMT1基因的表達(dá)量是對(duì)照處理的7.5倍，差異顯著（圖5）。結(jié)果表明SgALMT1基因特異地響應(yīng)金屬鋁毒害。

2.7 不同鋁濃度和鋁時(shí)間處理對(duì)SgALMT1基因表達(dá)的影響

由圖6A可以看出，隨著鋁處理濃度的增加，SgALMT1基因的表達(dá)量逐漸增加，當(dāng)鋁濃度為200 μmol·L-1時(shí)，SgALMT1表達(dá)量達(dá)到最高，是對(duì)照處理（0 μmol·L-1）的2.8倍；類似的，隨著鋁處理時(shí)間的延長(zhǎng)，SgALMT1基因的表達(dá)量逐漸增加，當(dāng)鋁處理48 h后，SgALMT1表達(dá)量最高，是0 h處理?xiàng)l件下的110.0倍，差異顯著（圖6B）。

2.8 不同缺素處理對(duì)SgALMT1基因表達(dá)的影響

本研究進(jìn)一步分析了缺氮（-N）、缺磷（-P）和缺鉀（-K）處理對(duì)SgALMT1基因在柱花草葉和根中表達(dá)的影響。如圖7A所示，與對(duì)照（CK）相比，缺氮處理顯著增強(qiáng)了SgALMT1基因在葉中的表達(dá)，而缺磷和缺鉀處理對(duì)SgALMT1基因表達(dá)的影響不顯著；與對(duì)照相比，缺磷處理顯著增加了SgALMT1基因在柱花草根中的表達(dá)，而缺氮和缺鉀處理對(duì)SgALMT1表達(dá)的影響不明顯（圖7B）。結(jié)果表明SgALMT1基因在葉和根中對(duì)缺素的響應(yīng)有所差異。

3 討論

3.1 柱花草SgALMT1具備植物ALMT膜蛋白的結(jié)構(gòu)特征

鋁毒害是酸性土壤中限制作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的重要障礙因素。在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，植物形成了多種耐鋁毒機(jī)制，其中，調(diào)節(jié)根系分泌蘋果酸是植物重要的耐鋁機(jī)制之一［2，31］。此外，蘋果酸也可作為滲透調(diào)節(jié)劑，參與氣孔調(diào)節(jié)、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)吸收、果實(shí)酸度和種子發(fā)育調(diào)節(jié)等過(guò)程［32］。鋁激活蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ALMT被報(bào)道具有轉(zhuǎn)運(yùn)蘋果酸的生物學(xué)功能［33-35］。因此，本研究克隆了柱花草SgALMT1基因，并對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。以往研究發(fā)現(xiàn)，ALMT家族成員具有高度保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)，包括含有5～6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的N端以及強(qiáng)親水性的C端［20］。N端由不同的基序組成，是離子通道并參與鋁信號(hào)傳導(dǎo)，而C端則調(diào)節(jié)了基因?qū)︿X離子的響應(yīng)，這些高度保守的結(jié)構(gòu)特征表明了它們對(duì)ALMT蛋白的重要性［32，36］。與已報(bào)道的植物ALMT蛋白相似，柱花草SgALMT1包含ALMT蛋白的保守序列，且其N端具有6個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，表明柱花草SgALMT1具備植物ALMT蛋白的典型結(jié)構(gòu)特征。亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，柱花草SgALMT1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)膜上（圖3），屬于膜蛋白，進(jìn)一步表明SgALMT1具有轉(zhuǎn)運(yùn)蘋果酸的生物學(xué)功能。

3.2 SgALMT1可能參與不同的生理過(guò)程

蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，柱花草SgALMT1蛋白與大豆、水稻、擬南芥、番茄和小麥等植物ALMT蛋白被分在第3組（圖2）。在該組中，大豆GmALMT1是一種質(zhì)膜定位的蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，鋁處理會(huì)增強(qiáng)其編碼基因的表達(dá)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)GmALMT1具有介導(dǎo)根系分泌蘋果酸，提高轉(zhuǎn)基因大豆和擬南芥耐鋁能力的功能［16］。在繡球花中，HmALMT9蛋白也具有增強(qiáng)酵母細(xì)胞耐鋁能力的功能［37］。另一方面，擬南芥AtALMT4，AtALMT6和AtALMT9均定位于液泡膜上，被報(bào)道參與調(diào)節(jié)了保衛(wèi)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)［38-39］。AtALMT4可以介導(dǎo)液泡釋放蘋果酸，并且響應(yīng)脫落酸而關(guān)閉氣孔，表明AtALMT4通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蘋果酸穩(wěn)態(tài)響應(yīng)干旱脅迫［39］。AtALMT6和AtALMT9也參與了液泡蘋果酸的運(yùn)輸，且它們?cè)谝号萏O果酸轉(zhuǎn)運(yùn)中存在功能冗余［38］。在番茄（Solanum lycopersicum）中，SlALMT5蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，可以轉(zhuǎn)運(yùn)蘋果酸和無(wú)機(jī)陰離子，如硝酸鹽和氯化物，超量表達(dá)SlALMT5提高了轉(zhuǎn)基因番茄成熟種子中蘋果酸和檸檬酸的含量，表明由SlALMT5介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)的蘋果酸影響了成熟種子中有機(jī)酸的含量［40］。因此，SgALMT1可能參與了柱花草不同的生理過(guò)程。

3.3 SgALMT1基因可能通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蘋果酸參與柱花草耐鋁毒和低磷脅迫

基因表達(dá)分析表明，鋁處理增強(qiáng)了SgALMT1基因在柱花草根系中的表達(dá)（圖5和6）。研究表明，鋁處理能增強(qiáng)小麥［41］、擬南芥［42-43］、大豆［16］、苜蓿［15］、油菜［19］和黑麥（Secale cereale）［44］等植物ALMT同源基因的表達(dá)。例如，在大豆中，不同鋁濃度和鋁時(shí)間處理增強(qiáng)了GmALMT1在根系中的表達(dá)，且GmALMT1基因表達(dá)與根系蘋果酸分泌密切相關(guān)［16］。在苜蓿中，不同鋁時(shí)間處理也增強(qiáng)了MsALMT1基因的表達(dá)，并且，超量表達(dá)MsALMT1促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因煙草根系蘋果酸分泌，并增加了鋁脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草的相對(duì)根長(zhǎng)［15，45］。在繡球花中，鋁處理增強(qiáng)了多個(gè)HmALMTs基因的表達(dá)，且外源表達(dá)HmALMT9能顯著增強(qiáng)酵母細(xì)胞的耐鋁能力［37］。以上結(jié)果表明，鋁誘導(dǎo)表達(dá)的ALMT基因具有轉(zhuǎn)運(yùn)蘋果酸、增強(qiáng)植物耐鋁能力的生物學(xué)功能。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，缺氮和缺磷處理分別增強(qiáng)了SgALMT1基因在柱花草葉和根中的表達(dá)（圖7），表明SgALMT1可能參與了柱花草響應(yīng)養(yǎng)分缺乏脅迫。類似的，大豆GmALMTs家族成員對(duì)磷饑餓表現(xiàn)出不同的響應(yīng)，其中，受缺磷增強(qiáng)表達(dá)的GmALMT5具有轉(zhuǎn)運(yùn)蘋果酸活化土壤難溶性磷的功能［17］。在柑橘（Citrus sinensis）中，缺磷處理也增強(qiáng)了CsALMT1的表達(dá)，表明其可能參與柑橘對(duì)磷饑餓的響應(yīng)［46］。小麥TaALMT1和擬南芥AtALMT1也被報(bào)道參與了植物對(duì)缺磷的響應(yīng)［47-48］。另一方面，SgALMT1基因在柱花草葉部的表達(dá)量高于根部，表明其在葉部中也發(fā)揮功能，但具體的生物學(xué)功能有待深入研究。

4 結(jié)論

本研究克隆了柱花草SgALMT1基因，發(fā)現(xiàn)SgALMT1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)膜上。鋁處理增強(qiáng)了SgALMT1基因在根中的表達(dá)，表明了SgALMT1可能參與柱花草響應(yīng)鋁毒害。本研究為深入解析SgALMT1介導(dǎo)蘋果酸參與柱花草耐鋁毒的生物學(xué)功能提供參考。

參考文獻(xiàn)

［1］UR RAHMAN S，HAN J C，AHMAD M，et al. Aluminum phytotoxicity in acidic environments：A comprehensive review of plant tolerance and adaptation strategies［J］. Ecotoxicology and Environmental Safety，2024，269：115791

［2］KOCHIAN LV，PIEROS MA，LIU J，et al. Plant adaptation to acid soils：the molecular basis for crop aluminum resistance［J］. Annual Review of Plant Biology，2015，66（1）：571-598

［3］鄧曉霞，李月明，姚堃姝，等. 植物適應(yīng)酸鋁脅迫機(jī)理的研究進(jìn)展［J］. 生物工程學(xué)報(bào)，2022，38（8）：2754-2766

［4］AO J，CHEN Z J，WU M，et al. Phosphorus fractions of red soils in guangdong province of south china and their bioavailability for five crop species［J］. Soil Science，2014，179（10-11）：514-521

［5］李交昆，唐璐璐. 植物抗鋁分子機(jī)制研究進(jìn)展［J］. 生命科學(xué)，2013，25（6）：588-594

［6］SUN L，ZHANG M，LIU X，et al. Aluminium is essential for root growth and development of tea plants （Camellia sinensis）［J］. Journal of Integrative Plant Biology，2020，62（7）：984-997

［7］吳佩，李浩，早浩龍，等. 植物對(duì)缺磷和鋁毒協(xié)同進(jìn)化應(yīng)答的分子生理機(jī)制［J］. 生物技術(shù)通報(bào)，2020，36（7）：170-181

［8］PEREIRA J F，RYAN P R. The role of transposable elements in the evolution of aluminium resistance in plants［J］. Journal of Experimental Botany，2019，70（1）：41-54

［9］LIU J，MAGALHAES J V，SHAFF J，et al. Aluminum-activated citrate and malate transporters from the MATE and ALMT families function independently to confer Arabidopsis aluminum tolerance［J］. Plant Journal，2010，57（3）：389-399

［10］SASAKI T，YAMAMOTO Y，EZAKI B，et al. A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter［J］. Plant Journal，2004，37（5）：645-653

［11］KOVERMANN P，MEYER S，HRTENSTEINER S，et al. The Arabidopsis vacuolar malate channel is a member of the ALMT family［J］. Plant Journal，2007，52（6）：1169-1180

［12］SASAKI T，ARIYOSHI M，YAMAMOTO Y，et al. Functional roles of ALMT-type anion channels in malate-induced stomatal closure in tomato and Arabidopsis［J］. Plant Cell and Environment，2022，45（8）：2337-2350

［13］SASAKI T，TSUCHIYA Y，ARIYOSHI M，et al. A chimeric protein of aluminum-activated malate transporter generated from wheat and Arabidopsis shows enhanced response to trivalent cations［J］. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes，2016，26（3）：1427-1435

［14］DIN I，ULLAH I，WANG W，et al. Genome-wide analysis，evolutionary history and response of ALMT family to phosphate starvation in Brassica napus［J］. International Journal of Molecular Sciences，2021，22（9）：4625

［15］CHEN Q，WU K H，WANG P，et al. Overexpression of MsALMT1，from the aluminum-sensitive medicago sativa，enhances malate exudation and aluminum resistance in tobacco［J］. Plant Molecular Biology Reporter，2013，31（3）：769-774

［16］LIANG C，PINEROS M A，TIAN J，et al. Low pH，aluminum，and phosphorus coordinately regulate malate exudation through GmALMT1 to improve soybean adaptation to acid soils［J］. Plant Physiology，2013，161（3）：1347-1361

［17］PENG W，WU W，PENG J，et al. Characterization of the soybean GmALMT family genes and the function of GmALMT5 in response to phosphate starvation［J］. Journal of Integrative Plant Biology，2018，60（3）：216-231

［18］LIGABA A，KATSUHARA M，SAKAMOTO W，et al. The BnALMT1 protein that is an aluminum-activated malate transporter is localized in the plasma membrane［J］. Plant Signaling Behavior，2007，2（4）：255-257

［19］LIGABA A，KATSUHARA M，RYAN P R，et al. The BnALMT1 and BnALMT2 genes from rape encode aluminum-activated malate transporters that enhance the aluminum resistance of plant cells［J］. Plant Physiology，2006，142（3）：1294-1303

［20］SHARMA T，DREYER I，KOCHIAN L，et al. The ALMT family of organic acid transporters in plants and their involvement in detoxification and nutrient security［J］. Frontiers in Plant Science，2016，7：1488

［21］劉國(guó)道，白昌軍，何華玄，等. 熱研5號(hào)柱花草選育研究［J］. 草地學(xué)報(bào)，2001，9（1）：1-7

［22］DU Y M，TIAN J，LIAO H，et al. Aluminium tolerance and high phosphorus efficiency helps Stylosanthes better adapt to low-P acid soils［J］. Annals of Botany，2009，103（8）：1239-1247

［23］CHEN Z，SUN L，LIU P，et al. Malate synthesis and secretion mediated by a manganese-enhanced malate dehydrogenase confers superior manganese tolerance in Stylosanthes guianensis［J］. Plant Physiology，2015，167（1）：176-188

［24］劉建樂(lè)，白昌軍，嚴(yán)琳玲，等. 16份柱花草材料的耐鋁性評(píng)價(jià)［J］. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2014，35（3）：476-482

［25］羅佳佳，向晨瑩，劉攀道，等. 柱花草SgSTOP1和SgSTOP2基因的克隆與表達(dá)分析［J］. 草業(yè)科學(xué)，2019，36（3）：704-712

［26］SUN L，LIANG C，CHEN Z，et al. Superior aluminium （Al） tolerance of Stylosanthes is achieved mainly by malate synthesis through an Al-enhanced malic enzyme，SgME1［J］. New Phytologist，2013，202（1）：209-219

［27］SONG J L，ZOU X Y，LIU P D，et al. Differential expressions and enzymatic properties of malate dehydrogenases in the response of Stylosanthes guianensis to nutrient and metal stresses［J］. Plant Physiology and Biochemistry，2022，170（1）：325-337

［28］王林杰，繆野，鄒曉燕，等. 柱花草SgLPR1基因克隆與表達(dá)分析［J］. 草業(yè)科學(xué)，2023，40（7）：1856-1865

［29］鄒曉燕，王林杰，黃杰，等. 柱花草SgNramp1和SgNramp2基因克隆與表達(dá)分析［J］. 草地學(xué)報(bào)，2022，30（6）：1388-1395

［30］YOO S D，CHO Y H，SHEEN J，et al. Arabidopsis mesophyll protoplasts：a versatile cell system for transient gene expression analysis［J］. Nature Protocols，2007，2（7）：1565-1572

［31］黃春瓊，陳振，劉國(guó)道，等. 暖季型草坪草狗牙根對(duì)酸鋁脅迫的生理響應(yīng)［J］. 草地學(xué)報(bào)，2017，25（4）：796-802

［32］魏志敏，李亞林，黃鑫，等. 植物陰離子通道鋁激活蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)體ALMTs在植物營(yíng)養(yǎng)與生理中的作用［J］. 植物生理學(xué)報(bào)，2023，59（6）：1072-1082

［33］PALMER A J，BAKER A，MUENCH S P. The varied functions of aluminium-activated malate transporters-much more than aluminium resistance［J］. Biochemical Society Transactions，2016，44（3）：856-862

［34］林亞蒙，王巧蘭，王承瀟，等. 鋁脅迫誘導(dǎo)的植物有機(jī)酸分泌研究進(jìn)展［J］. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)），2015，30（4）：634-641

［35］張亞楠，張兆英，陳奇. 鋁脅迫下植物有機(jī)酸通道蛋白基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)理研究進(jìn)展［J］. 分子植物育種，2017，15（12）：4899-4904

［36］DELHAIZE E，GRUBER B D，RYAN P R. The roles of organic anion permeases in aluminium resistance and mineral nutrition［J］. FEBS Letters，2007，581（12）：2255-2262

［37］QIN Z，CHEN S，F(xiàn)ENG J，et al. Identificationof aluminum-activated malate transporters （ALMT） family genesin hydrangea and functional characterization of HmALMT5/9/11 under aluminum stress［J］. PeerJ，2022，24（10）：14

［38］MEYER S，SCHOLZ STARKE J，DE ANGELI A，et al. Malate transport by the vacuolar AtALMT6 channel in guard cells is subject to multiple regulation［J］. Plant Journal，2011，67（2）：247-257

［39］EISENACH C，BAETZ U，HUCK N V，et al. ABA-induced stomatal closure involves ALMT4，a phosphorylation-dependent vacuolar anion channel of Arabidopsis［J］. Plant Cell，2017，29（10）：2552-2569

［40］SASAKI T，TSUCHIYA Y，ARIYOSHI M，et al. Two members of the aluminum-activated malate transporter family，SlALMT4 and SlALMT5，are expressed during fruit development，and the overexpression of SlALMT5 alters organic acid contents in seeds in tomato （Solanum lycopersicum）［J］. Plant and Cell Physiology，2016，57（11）：2367-2379

［41］LIGABA A，DREYER I，MARGARYAN A，et al. Functional，structural and phylogenetic analysis of domains underlying the Al sensitivity of the aluminum-activated malate/anion transporter，TaALMT1［J］. Plant Journal，2013，76（5）：766-780

［42］HOEKENGA O A，MARON L G，PIEROS M A，et al. AtALMT1，which encodes a malate transporter，is identified as one of several genes critical for aluminum tolerance in Arabidopsis［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，103（25）：9738-9743

［43］WANG J Q，YU X F，DING Z J，et al. Structural basis of ALMT1-mediated aluminum resistance in Arabidopsis［J］. Cell Research，2022，32（1）：89-98

［44］COLLINS N C，SHIRLEY N J，SAEED M，et al. An ALMT1 gene cluster controlling aluminum tolerance at the Alt4 locus of rye （Secale cereale L.）［J］. Genetics，2008，179（1）：669-682

［45］CHEN Q，ZHANG X D，WANG S S，et al. Transcriptional and physiological changes of alfalfa in response to aluminium stress［J］. Journal of Agricultural Science，2011，149（6）：737-751

［46］YANG L T，JIANG H X，QI Y P，et al. Differential expression of genes involved in alternative glycolytic pathways，phosphorus scavenging and recycling in response to aluminum and phosphorus interactions in Citrus roots［J］. Molecular Biology Reports，2012，39（5）：6353-6366

［47］DELHAIZE E，TAYLOR P，HOCKING P，et al. Transgenic barley （Hordeum vulgare L.） expressing the wheat aluminium resistance gene （TaALMT1） shows enhanced phosphorus nutrition and grain production when grown on an acid soil［J］. Plant Biotechnology Journal，2009，7（5）：391-400

［48］BALZERGUE C，DARTEVELLE T，GODON C，et al. Low phosphate activates STOP1-ALMT1 to rapidly inhibit root cell elongation［J］. Nature Communications，2017，8（15）：15300

（責(zé)任編輯 閔芝智）

收稿日期：2023-12-24;修回日期：2024-02-23

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31861143013，31672483）；財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-34）資助

作者簡(jiǎn)介：繆野（1999-），女，漢族，四川內(nèi)江人，碩士研究生，主要從事熱帶牧草抗逆研究，E-mail：3326848781@qq.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：jchen@scau.edu.cn