摘" " " 要：以乙醇為溶劑，采用超聲波輔助法提取茜草根莖中的蒽醌類化合物。通過超聲時間、溶劑用量和溶劑濃度等單因素試驗探尋蒽醌的提取條件，并利用三因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面分析法試驗設(shè)計優(yōu)化提取工藝，得到最佳提取條件為超聲時間31.29 min、溶劑用量13.47 mL、溶劑濃度81.15%，茜草根莖中蒽醌提取率的理論預(yù)測值為7.64%。驗證試驗結(jié)果表明，此條件下茜草根莖中蒽醌提取率為7.62%，與理論預(yù)測值較為接近。因此，響應(yīng)面分析法可得到最優(yōu)的提取工藝。最后通過紫外和紅外光譜法對其結(jié)構(gòu)進行了表征。

關(guān)" 鍵" 詞：茜草根莖； 蒽醌； 超聲波； 響應(yīng)面法

中圖分類號：R284.2" 文獻標(biāo)識碼： A" " "文章編號： 1004-0935（2024）04-0501-06

中藥茜草[1-2]為多年再生植物，能夠在各種地勢存活，生命力頑強，存活率高，分布在不同的地域。在2020年版《中國藥典》[3]中記載了茜草的功效，其擁有活血化瘀、止血通經(jīng)的功效等。茜草之所以具有上述功效，是因為西草根莖中所含的主要成分是蒽醌類及苷類物質(zhì)[4-5]。

近年來大量的研究人員對茜草提取物進行了研究，挖掘茜草提取物更大的藥效價值和經(jīng)濟價值。王艷雙等[6]、Liu等[7]發(fā)現(xiàn)茜草提取物可以抑制肝癌細胞的生長且對癌細胞抑制性較好，并在前人研究的基礎(chǔ)上得出茜草提取物能夠抑制各種癌細胞的繁殖再生能力，能夠延緩癌細胞的生長，能夠提高患者的存活率的結(jié)論，促進了醫(yī)療技術(shù)水平的進一步發(fā)展；另外潘杰[8]對茜草提取物質(zhì)進行了初步的研究，得到的結(jié)果是從茜草中提取出的蒽醌具有一定的抗氧化和抗炎作用，對關(guān)節(jié)炎小鼠有較好的治療效果；此外蒽醌還可用于大量的水產(chǎn)品中，起保鮮作用，延緩了水產(chǎn)品的腐爛時間[9-10]，為水鮮市場帶來了一定的經(jīng)濟效益。

研究者在茜草中蒽醌類成分和抗腫瘤抗癌等[11-12]藥理作用上研究得比較多，但在試驗中，從茜草根莖中提取蒽醌的含量較低，不能高效率地獲得蒽醌。蘇靜慧等[13]、衛(wèi)亞麗等[14]均通過單因素結(jié)合正交試驗的方法研究茜草中蒽醌的最佳提取工藝條件。目前研究蒽醌的提取方法很多，但在這些試驗設(shè)計中，試驗處理方面仍比較復(fù)雜，存在提取時間較長破壞提取物的結(jié)構(gòu)的可能性，導(dǎo)致數(shù)據(jù)偏差較大[15]。研究表明響應(yīng)面分析法[16]可在試驗前對試驗數(shù)據(jù)進行回歸模擬，初步判定試驗的可行性，并對試驗數(shù)據(jù)進行精確分析，初步預(yù)測試驗的最佳工藝條件。通過Box-Behnken響應(yīng)面分析法在試驗前對試驗進行初步設(shè)計既能夠縮短試驗時間，且能有效地彌補傳統(tǒng)正交試驗設(shè)計的不足。因此，本項目將用乙醇作為溶劑，采用超聲波法[17-18]提取茜草根莖中的蒽醌并結(jié)合Box-Behnken[19-21]響應(yīng)面分析法優(yōu)化茜草根莖中蒽醌的提取工藝，為茜草根莖中蒽醌的工業(yè)化提取提供更加精確的數(shù)據(jù)。

1" 材料和方法

1.1" 材料與試劑

茜草根莖，體積分數(shù)為95%的乙醇，氫氧化鈉（粒），鹽酸，D101大孔吸附樹脂。

1.2" 儀器設(shè)備

KH-500DE數(shù)控超聲波清洗器，SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵，F(xiàn)W177高速萬能粉碎機，DZG6050SA真空干燥箱，AR1140電子分析天平，98-I-B電子調(diào)溫電熱套，TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，Thermofisher is5傅里葉紅外光譜儀。

1.3" 試驗方法

1.3.1" 超聲波提取法

1）提取流程：茜草根莖→粉碎→過篩→超聲提取→過濾→蒸餾→純化→真空干燥→干浸膏。

2）具體步驟：用高速萬能粉碎機把茜草根莖粉碎，用60目的篩子進行過篩得到茜草根莖粗粉，用分析天平稱取0.5 g茜草根莖粉，裝入錐形瓶中，量取一定量乙醇溶劑，倒入錐形瓶中與其混合，選擇超聲時間、溶劑用量、溶劑濃度三個單因素進行試驗。利用數(shù)控超聲波清洗器提取茜草根莖中的蒽醌，過濾，得到浸提液，蒸餾濃縮后純化，真空干燥后得到干浸膏，每組試驗重復(fù)3次。

3）計算公式：

式中：M—稱取茜草根莖粉的質(zhì)量，g;

Mi—提取干浸膏的質(zhì)量，g。

1.3.2" 單因素實驗

按照1.3.1的方法進行單因素實驗，因素水平表如表1所示。

1.3.3" 響應(yīng)面法優(yōu)化茜草根莖中蒽醌的提取條件

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，提取時間、溶劑用量和溶劑濃度三個因素當(dāng)作自變量，茜草根莖中蒽醌提取率作為響應(yīng)值，優(yōu)化從茜草中提取蒽醌的工藝條件。響應(yīng)面因素水平設(shè)計表見表2。

1.3.4" 茜草根莖浸提液的分離純化

1）大孔樹脂的預(yù)處理

取出足夠量的D101型大孔樹脂于燒杯中，用過量的蒸餾水漂洗、抽濾后，置于過量95％乙醇中進行充分的溶脹，溶脹完全后用大量的蒸餾水沖洗到?jīng)]有醇味，依次用5％鹽酸溶液和5％氫氧化鈉溶液浸泡2 h后，再用大量的蒸餾水沖洗至中性[22]。

2）分離純化

采用濕法將預(yù)處理后的大孔樹脂（10 mL）填充到柱中，取上柱液40 mL，另加體積分數(shù)為81%的乙醇60 mL，濕法拌樣。使大孔樹脂充分吸收藥液，不間斷搖勻，靜止放置12 h。待吸附12 h后，濕法裝柱，用81%的乙醇以1 mL·min-1的速度進行洗脫，收集洗脫后的乙醇液體，即得純化后產(chǎn)物。

1.3.5" 紅外和紫外表征

1）紫外光譜分析

純化后的浸提液經(jīng)適當(dāng)稀釋，使吸光度值在1.0以下以減小測量誤差。采用TU-1901雙光束紫外可見分光光度計在200～600 nm波長范圍內(nèi)自動掃描，得到吸收波長和吸光度值的譜圖。對得到的吸收光譜圖進行分析并確定提取物是否為蒽醌。

2）紅外光譜分析

純化后的浸提液真空干燥后得到干浸膏，采用Thermofisher is5傅里葉紅外吸收光譜儀進行分析，通過KBr壓片的方法在波數(shù)為4000～500 cm-1的范圍內(nèi)進行測試，對得到的吸收光譜圖進行分析進一步確定提取物是否為蒽醌。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 單因素實驗結(jié)果分析

各因素對茜草根莖中蒽醌提取率的影響如圖1所示。圖1a顯示當(dāng)提取時間為 30 min時，提取率最高。30 min后隨著提取時間的增長提取率呈現(xiàn)減小的趨勢，可能原因是超聲振蕩過久導(dǎo)致茜草根莖中有效的蒽醌組分被破壞，從而導(dǎo)致提取率降低，因此最佳提取時間為30 min。

從圖1b可以看出隨著乙醇用量的不斷增加，提取的蒽醌的提取率逐漸增大，當(dāng)乙醇用量從

12 mL增加到14 mL時，干浸膏有一個較大幅度的增長，當(dāng)溶劑用量繼續(xù)增加到16 mL時提取率與溶劑用量為14 mL的得率幾乎持平，蒽醌提取率沒有明顯增加。基于以上分析，當(dāng)溶劑用量非常少時，不能將茜草根莖粉充分浸溶，溶劑量過多時提取成本會增加。因此，在整個提取過程中乙醇用量為14 mL。

圖1c顯示隨著溶劑濃度的升高，提取率呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢，可能原因是乙醇濃度過高破壞了茜草根莖中有效的蒽醌結(jié)構(gòu)，提取率降低。當(dāng)選用80%的乙醇時，提取率最高。

2.2" 響應(yīng)面法優(yōu)化茜草根莖中蒽醌的提取條件結(jié)果分析

2.2.1" Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果分析

Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果分析如表3所示。利用 Design-Expert 13軟件，對試驗設(shè)計數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合：

提取率= -197.480 25+0.838 783×A+0.744 000× B+4.614 55×C+7.833×10-3AB-7.967×10-3AC+ 3.000× 10-3BC-4.248×10-3A2-0.039 562B2-0.027 430 C2，其中 A、B、C 分別表示提取時間、溶劑用量和溶劑濃度。

2.2.2" 二次多元回歸模型方差分析

利用Design-Expert 13軟件對上述二次多元回歸模型進行方差分析，結(jié)果如表 4。

根據(jù)上述回歸模型方差分析，P值=0.000 5lt;0.01，則表明與試驗數(shù)據(jù)相符，回歸模型高度極為顯著，缺少擬合項 = 0.161 1 gt; 0.050 0，表明方程與試驗結(jié)果擬合程度很好。該茜草根莖蒽醌的提取工藝具有可行性；復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為0.959 0，接近于1，表明回歸效果好，模型的平均CV方差為4.34%，突出響應(yīng)值的重復(fù)性很好。綜上所述，該模型適用于實際的分析，回歸模型可用于分析和預(yù)測測試結(jié)果。

由表4分析可知，一次項 A小于0.000 1，有極為顯著影響、交互項AC小于0.01，對提取率有極為顯著影響，二次項A2、C2小于0.01，從茜草根莖中提取蒽醌具有非常顯著的效果。回歸模型可以描述每個因素與固體產(chǎn)量之間的實際關(guān)系，并表明它們可用于確定最佳加工條件。

2.2.3" 響應(yīng)面曲線和等高線圖分析

響應(yīng)面曲線圖是將體系的響應(yīng)值（本試驗中的提取率）作為提取時間、溶劑用量和溶劑濃度其中兩個因素互交的函數(shù)，運用三維空間設(shè)計圖形技術(shù)繪制函數(shù)變化關(guān)系，從圖中可以更加直觀地來選擇試驗設(shè)計中的最優(yōu)化條件[23-24]。

響應(yīng)面曲線圖可以直觀顯示出響應(yīng)值隨著各試驗因素交互作用變化的連續(xù)過程，其陡度反映了試驗中各因素對響應(yīng)值的影響程度。等高線能夠直接反映試驗因素在二維方向上的相互作用，卵圓形表明兩因素的相互作用明顯，而圓形表明相互作用不明顯，等高線的密集程度可以反映出試驗因素的影響大小。[25]利用Design-Expert 13軟件繪制三維響應(yīng)曲線和二維等高線圖，結(jié)果如圖2所示。

茜草根莖中蒽醌提取率隨著提取時間、乙醇溶劑用量的增加，圖2a中通過彎曲程度可以直觀看出呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當(dāng)超聲振蕩時間為30 min，溶劑用量為14 mL時，提取率達最大值，隨后呈下降趨勢，由圖2b可得出超聲振蕩時間對提取率的影響大于溶劑用量對提取率的影響。

茜草根莖中蒽醌提取率隨著提取時間、乙醇溶劑濃度的增加，圖2c中通過彎曲程度可以直觀看出呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當(dāng)超聲振蕩時間為30 min，乙醇溶劑濃度為80%時，提取率達最大值。由圖2d可得超聲振蕩時間對提取率的影響程度大于乙醇溶劑濃度。

茜草根莖中蒽醌提取率隨著乙醇溶劑用量與乙醇溶劑濃度的增加，圖2e中通過彎曲程度可以直觀看出呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當(dāng)乙醇溶劑用量為14 mL，乙醇體積分數(shù)為80%時，提取率達最大值。由圖2f可得出乙醇溶劑濃度對提取率的影響大于溶劑用量。

綜上可得，三個因素對茜草根莖中蒽醌的提取率影響的大小順序為：提取時間＞溶劑濃度＞溶劑用量。

2.2.4" 最佳提取條件的預(yù)測與驗證

1）最佳提取條件的預(yù)測

通過上述分析該回歸模型具有可行性，對此進行最佳提取條件分析得出：超聲時間31.29 min、溶劑用量13.47 mL、溶劑濃度81.15%，此條件下茜草根莖中蒽醌提取率預(yù)測值為7.64%。

2）驗證試驗

為檢驗試驗結(jié)果與實際操作下的結(jié)果相符合的程度，以上述得到的最佳試驗條件為實際操作試驗條件，即：超聲時間31 min、溶劑用量13.50 mL、溶劑濃度81%。在此條件下進行驗證試驗，平行三次，測得實際茜草根莖蒽醌平均得率為7.62 % ，與理論預(yù)測值7.64 %的相對誤差僅為0.26%，驗證試驗結(jié)果與Box-Behnken試驗設(shè)計所得的理論預(yù)測值基本一致。說明Box-Behnken試驗設(shè)計RSM方案具有可行性，所得的茜草根莖中蒽醌的最佳提取工藝條件準確可靠。

2.3" 紅外光譜法和紫外光譜法表征結(jié)果分析

2.3.1" 紫外光譜法表征結(jié)果分析

對純化后的提取液進行了紫外可見吸收光譜測試，結(jié)果如圖3所示。

蒽醌在200～600 nm范圍內(nèi)，共有5個特征吸收峰[26]。多數(shù)帶有羥基的蒽醌在230 nm（圖中220 nm處）左右均有較強的吸收峰；240～260 nm（圖中240 nm處）是苯甲?；Y(jié)構(gòu)引起的吸收峰；262～295 nm（圖中275 nm處）是醌環(huán)的吸收峰；305～389 nm（圖中348 nm處）是苯環(huán)的吸收峰；400 nm（圖中469 nm處）以上為醌環(huán)結(jié)構(gòu)的吸收峰，是醌環(huán)結(jié)構(gòu)中的碳氧雙鍵所引起的。通過提取物的紫外可見吸收光譜的結(jié)果可以確認茜草根莖的提取物為蒽醌化合物。

2.3.2" 紅外光譜法表征結(jié)果分析

為進一步確定所得到的提取物為蒽醌化合物，對所得到的干浸膏固體樣品進行了紅外吸收光譜測試，結(jié)果如圖4所示。

醌的主要紅外光譜是羰基、雙鍵以及苯環(huán)的吸收峰。帶羥基的蒽醌類化合物在紅外區(qū)域有νOH（3600～3130 cm-1）、νC=O（1675～1653 cm-1）和ν芳環(huán)（1600～1480 cm-1）的吸收。茜草根莖中的提取物是帶有取代基的蒽醌化合物，在不同的取代基作用下，蒽醌的各個官能團的紅外吸收譜帶和吸收峰的尖銳程度均會發(fā)生變化[14]。在圖4中3 449 cm-1處出現(xiàn)的強而寬的吸收峰是νO-H的締合吸收峰，1680～1 610 cm-1（圖中1 620 cm-1）處的強吸收峰為νC=O的伸縮振動，1 430～1 365 cm-1（圖中1 383 cm-1）處的吸收峰為苯環(huán)的骨架振動峰，1 100～1 000 cm-1（圖中1073 cm-1）處的吸收峰為νC-OH的伸縮振動峰，820～600 cm-1（圖中605 cm-1）處為ν苯環(huán)取代峰。由圖4的紅外吸收光譜圖的結(jié)果可進一步確認本試驗的提取物為蒽醌化合物。

3" 結(jié) 論

1）使用Desing-Expert 13軟件對得到的實測數(shù)據(jù)進行分析和回歸模擬。通過對其回歸方程進行分析和比較，得出茜草根莖中蒽醌提取的最佳工藝參數(shù)：超聲時間31.29 min、溶劑用量13.47 mL、溶劑濃度81.15%，此條件下茜草根莖中蒽醌的理論預(yù)測值最高。

2）通過紫外可見吸收光譜和紅外吸收光譜進一步確認了提取物為蒽醌化合物。

3）本研究為中藥茜草根莖中蒽醌的工業(yè)化提取工藝提供了精確的參考數(shù)據(jù)與借鑒思路，為茜草的實際應(yīng)用奠定了一定的理論基礎(chǔ)，同時也為其他的工業(yè)提取提供了優(yōu)化工藝的方法和思路。

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Study on Extraction Process of Anthraquinone From Rhizomes of Rubia

CAO Lili1， RUAN Changqing1， GAO Jinling1， LI Xue，1 ZHAO Mi1， LI Qiang2

（1. College of Science， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing Heilongjiang 163319， China;

2.China University of Petroleum （Beijing） at Karamay， Karamay Xinjiang 834000， China）

Abstract： The anthraquinones in the rhizome of Rubia were extracted by ultrasonic assisted method using ethanol as the solvent. The extraction conditions of anthraquinone were explored by single-factor tests such as sonication time， solvent dosage and solvent concentration. A Box-Behnken response surface analysis test based on single-factor experiments of three factors at three levels was applied to optimize the extraction process. The optimum conditions were as follows： ultrasonic time 31.29 min， solvent dosage 13.47 mL， solvent volume fraction 81.15%. The highest theoretical prediction extraction rate of anthraquinone in the rhizomes of Rubia was 7.64%. The verification experiments under these conditions showed that the extraction rate of anthraquinone in the rhizomes of Rubia was 7.62%，which was close to the theoretical prediction. Therefore， the optimal extraction process can be obtained by the method of response surface analysis. Finally， the structure was characterized by UV and IR spectroscopy.

Key words： Rhizomes of Rubia; Anthraquinone; Ultrasonic; Response surface method