王一波 孫泓希 史普想 孫繼軍 韓寧 任亮 張麗麗 王海新

王一波，孫泓希，史普想，等. 環(huán)介導等溫擴增技術在農業(yè)病害檢測中的應用綜述［J］. 江蘇農業(yè)科學，2024，52（7）：17-24.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.07.003（遼寧省沙地治理與利用研究所，遼寧阜新 123000）

摘要：環(huán)介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型核酸等溫擴增技術，其原理是當溫度為60～65 ℃時，DNA處于動態(tài)平衡狀態(tài)，DNA雙鏈打開，此時依賴Bst DNA聚合酶的鏈置換活性，使DNA可以在60～65 ℃的恒溫下進行合成。其擴增引物是基于靶基因的6個特異性區(qū)域設計的，擴增階段需要引物與樣品DNA完全結合，才可以進行擴增，所以LAMP技術具有高特異性與高靈敏性。其反應溫度恒定，不需要額外的控溫設備，理想條件下僅需保溫杯，即可進行DNA擴增。在田間檢測時，只需提取樣品總DNA，即可于田間進行病害檢測，縮短了檢測流程及時間，使病害檢測更高效更便捷。在反應前或反應后加入特定染色劑，即可通過染色劑的變色情況進行反應結果的判定，使反應結果可視化。目前該技術已憑借其特異性高、靈敏性高、所用儀器簡單（恒溫水浴鍋或保溫杯即可）、檢測效率高和檢測結果可視化等優(yōu)點，廣泛應用于臨床病原微生物檢測、食品微生物檢測、環(huán)境微生物檢測、植物或微生物基因鑒定等領域。在農業(yè)病害的病原微生物（真菌、細菌、病毒、線蟲）快速檢測和診斷領域，已有很多研究針對各種病害建立了相應的LAMP檢測技術。本文簡要綜述了LAMP技術原理、反應結果判定、優(yōu)缺點和該技術目前在農業(yè)常見病原物檢測中的應用，并對LAMP技術的應用前景進行了進一步的展望。

關鍵詞：環(huán)介導等溫擴增技術；農業(yè)病害；檢測；應用

中圖分類號：S431.9；S432.4? 文獻標志碼：A? 文章編號：1002-1302（2024）07-0017-07

傳統(tǒng)的病害檢測和鑒定，主要依據科赫法則，對病原菌進行分離回接鑒定，但這種方法會耗費大量的時間和人力，同時要求實驗人員具有很高的操作技能和知識儲備［1］。隨著分子生物學的發(fā)展，在聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術基礎上發(fā)展出多種病害鑒定技術，比如熒光定量PCR、巢氏PCR、多重PCR等［2-4］。原理是使用特異性引物進行DNA擴增，以PCR反應結果鑒定病害，但這些基于PCR原理的檢測方法都需要依賴昂貴的控溫設備，反應時間較傳統(tǒng)檢測雖然大大縮短，但仍然需要較長的時間，并且對實驗人員的操作技能也有一定要求，這些原因限制了PCR檢測在基層的大范圍應用。因此，各種不需要依賴控溫設備的恒溫擴增技術被發(fā)明出來，目前成熟的恒溫擴增技術有很多，比如基于核酸序列的擴增（NASBA，也稱為轉錄介導的擴增，TMA）、解旋酶依賴性擴增（HDA）、重組酶聚合酶擴增（RPA）、滾環(huán)擴增（RCA）、多重置換擴增（MDA）、環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）和鏈置換擴增（SDA）［5-11］。恒溫擴增技術的普遍優(yōu)點是操作簡單、檢測費用相對低廉、對DNA質量要求低。但是，NASBA技術的檢測時間一般在2 h左右［12］；HDA技術因為解旋酶的擴增速度和連續(xù)性限制，只能擴增相對小的片段［13］；RPA技術有時會有非特異性擴增［14］；RCA技術的靈敏性也較低，同時反應進行前需要熱變性步驟［15］；MDA技術對基因中的高GC區(qū)域敏感，容易造成擴增不均勻，同時嵌合體和非特異擴增現象也比較嚴重［9］；SDA技術也是只能擴增較短的片段，同時也需要熱變性步驟［16］。而LAMP技術因其高特異性、高靈敏性、檢測時間適當、可以擴增較長的基因片段等綜合優(yōu)勢，已廣泛應用于臨床病原微生物檢測、食品微生物檢測、環(huán)境微生物檢測、植物或微生物基因鑒定等領域［11］。在農業(yè)領域中，該技術已經應用于農業(yè)病害的病原生物快速檢測和診斷，具有廣闊的應用前景。本文就該技術的原理、方法及已有的應用研究進展綜述如下。

1 環(huán)介導等溫擴增技術簡介

1.1 LAMP 技術特點及原理

2000年，日本學者報道了一種新型的核酸等溫擴增技術——環(huán)介導等溫擴增技術，其原理是DNA在60～65 ℃的環(huán)境內處于動態(tài)平衡狀態(tài)，在這種環(huán)境下，DNA雙鏈打開，依賴Bst DNA聚合酶的鏈置換活性和特異性引物，使DNA可以在60～65 ℃進行合成并不停地自我循環(huán)［17］。其特異性引物是基于靶基因序列的6個不同位點特殊設計而成的2對引物（內、外引物），其中2條內引物分別是由2個DNA片段鏈接而成的。此外還可以設計額外的環(huán)引物，其通過在反應過程中與中間產物的頸環(huán)結構雜交，進而加快反應速率（圖1）［18］。

LAMP反應過程可以分為3個階段：首先起始物合成階段，DNA在所有引物和Bst聚合酶的作用下，合成并形成啞鈴狀DNA，作為下一階段的模板；隨后進入環(huán)擴增階段，在內引物和聚合酶的作用下，合成并形成發(fā)卡狀DNA，并作為下一階段的模板；最后進入延伸和循環(huán)擴增階段，由之前形成的DNA模板，在內引物和聚合酶的作用下，最終合成長短不同的莖環(huán)狀DNA組成的混合物。

1.2 LAMP技術的引物設計

LAMP技術的關鍵在于靶基因的選擇和篩選特異性引物。根據檢測目標的不同，選擇不同保守程度的靶基因。例如，檢測同屬不同種的病害，選擇在種內高度保守而在種間有足夠差異的靶基因；檢測同屬同種但是不同亞種的病害，則需要選擇各個亞種間有足夠差異的靶基因。引物設計一般采用由日本榮研株式會社開發(fā)的PrimerExplorer v5（http：//primerexplorer.jp/e/）在線設計引物，若輸入的DNA片段超過2 000 bp會報錯。LAMP技術反應過程中主要擴增的DNA片段是F2位點的5′末端到B2位點的5′末端，引物設計要求這段DNA片段一般是在120～160 bp，因此LAMP引物設計完成后，反應最長擴增片段（F3位點5′末端到B3位點5′末端）約為300 bp。靶基因一般不超過 500 bp，即可獲得多套引物。若靶基因過長（1 000 bp），會生成過多套引物，增加引物篩選的難度及試驗工作量。引物分別為雙向內引物（FIP、BIP）和雙向外引物（F3、B3）。其中正向內引物FIP由F2區(qū)和F1c區(qū)組成，反向內引物BIP由B1c（B1區(qū)反向互補序列）和B2區(qū)域組成。相比于PCR引物設計，LAMP引物要考慮的因素更多，要求更高。一般要求F1c和B1c的Tm值相較于F2、F3、B2、B3的Tm值高 5 ℃ 較好。引物末端的穩(wěn)定性由自由能改變值（ΔG）來衡量，一般要求引物末端的ΔG小于或等于-4 kcal/mol，其中F2、B2、F3、B3為3′端，F1c、B1c為5′端。另外，設計的引物自身或引物間要求不能形成2級結構。

Nagamine等發(fā)現，在LAMP反應體系中加入環(huán)引物（LF、LB）能夠明顯加快反應速度，提高檢測效率［18］。因此，若對檢測效率有較高要求，可以通過PrimerExplorer v5另行設計環(huán)引物，并加入反應體系中。

1.3 LAMP反應條件優(yōu)化

LAMP反應體系中一般涉及引物、Bst DNA聚合酶、DNA擴增緩沖液、dNTP、甜菜堿、Mg2SO4和水等條件要素。通常需要對引物及其濃度、反應溫度、反應時間、甜菜堿和Mg2+最適濃度等反應條件進行優(yōu)化。引物設計的不同、DNA質量差異等因素，均會對LAMP體系中各組分的最優(yōu)濃度、反應溫度及時間造成影響，所以對以上這些條件均需要逐一優(yōu)化。

1.4 LAMP 反應結果的判定

1.4.1 肉眼觀察法

LAMP反應過程中，從dNTP析出的焦磷酸根離子，會與反應溶液中的Mg2+結合，從而產生乳白色焦磷酸鎂沉淀（圖2-A）。所以在理想的條件下，可以通過用肉眼觀察反應管中是否有白色沉淀來判斷結果。若能觀察到白色沉淀，則反應結果為陽性，否則為陰性。但大多數情況下，檢測過程并不能達到最理想的條件，導致焦磷酸鎂沉淀較少，白色沉淀不明顯，通過肉眼判定反應結果會造成較大的人為誤差，所以一般通過其他方法來判斷反應結果［19］。

1.4.2 染色檢測法

該方法是LAMP反應結果判定最常用的方法，依據染色劑顏色變化判定反應結果（圖2-B至圖2-H）。根據染色劑是否會干擾LAMP反應過程，染色劑可分為反應前加入和反應后加入2類。最常使用的染料SYBR Green Ⅰ，通過結合雙鏈DNA發(fā)出綠色熒光，普遍認為如果在反應前加入到反應體系中，會抑制反應的進行，若模板DNA含量過低，有可能造成假陰性結果，所以SYBR Green Ⅰ一般于反應后加入。目前常用的染色劑類別及顯色結果見表1。

1.4.3 瓊脂糖凝膠電泳法

LAMP反應的最終產物是多種長短不一的莖環(huán)狀DNA組成的混合物，在經過瓊脂糖凝膠電泳后，會呈現典型的梯型狀條帶，所以可以通過瓊脂糖凝膠電泳后典型條帶的有無（圖2-I），判斷反應結果是否為陽性［21］。

1.4.4 儀器檢測法

目前已經有實時監(jiān)測LAMP反應過程中產生的焦磷酸鎂沉淀的儀器，通過對體系中濁度的實時檢測和記錄，實現對反應過程的實時監(jiān)控，根據濁度變化繪制擴增曲線（圖2-J），可以據此判斷反應結果［24］。

另外，還可以在LAMP反應體系中加入對反應影響較小的熒光染料，例如EvaGreen（Biotium），使用實時熒光定量PCR儀進行反應，即可得到LAMP反應的實時擴增曲線（圖2-K），據此判斷檢測結果［25］。這種方法的缺點是，所用的儀器設備價格昂貴，也無法應用于現場檢測。

1.4.5 試紙條法

將LAMP引物進行修飾，結合側流層析試紙條，即可以實現檢測結果的試紙條可視化（圖2-L）。但是試紙條價格昂貴，并且對引物進行進一步修飾的價格也很昂貴。因此，試紙條法判定反應結果在LAMP技術中使用得較少［26］。

1.5 LAMP技術的優(yōu)缺點

最主要的優(yōu)勢在于反應在等溫條件下進行，并具有以下優(yōu)點：（1）特異性強：引物設計是基于靶標基因的6個不同區(qū)域設計出特異性引物，檢測時，2對引物必須全部匹配才能夠進行擴增，從而避免了非特異擴增；（2）靈敏度高：一般情況下，LAMP技術的檢測靈敏度比PCR高10倍；（3）儀器設備簡單：一般不需要PCR儀等控溫設備，僅用能維持恒溫的設備（水浴鍋等）即可實現核酸擴增；（4）檢測效率高：通常LAMP反應在1 h內完成；（5）結果可視化：檢測結果可通過加入各種顯色劑，通過顏色改變進行結果判定。

但是也存在不足：

（1）易造成假陽性：當通過瓊脂糖凝膠電泳判定結果，或者開蓋加入熒光染料觀察結果時，極易產生氣溶膠污染，影響后續(xù)的檢測結果，使假陽性的概率變高；（2）引物要求高：靶基因選擇及引物篩選極為繁瑣；（3）不能進行后續(xù)試驗：LAMP擴增產物為不同片段大小的莖環(huán)DNA混合物，因此不能進行測序和克隆等試驗。

2 LAMP技術在農業(yè)病害檢測中的應用

2.1 真菌檢測

植物中78%～80%病害是真菌病害，真菌病害危害重、分布廣，快速檢測植物病原真菌的技術能有助于大大提高植物真菌病害的防治效率同時降低農業(yè)成本。目前關于植物真菌病害相關的LAMP檢測技術蓬勃發(fā)展，每年都有大量的真菌病害LAMP檢測技術被報道。

比較常見的是通過染色檢測法，直接于田間進行病害檢測，達到快速檢測的目的。例如針對曲霉（Aspergillus spp.）建立的特異性LAMP檢測技術，結合了便攜設備并使檢測結果可視化，一個反應最低能夠檢測到10個分生孢子的病菌［27］；針對疫霉（Phytophthora spp.）建立的特異性LAMP檢測技術，以HNB作為染色劑，并且最低能夠檢測到 1 μg/L 的病原菌DNA［28］；針對腐霉（Pythium spp.）建立的玉米莖腐病LAMP檢測技術，同樣以HNB為染色劑，且最低能檢測到10 μg/L的病原菌DNA［29］；針對小麥白粉菌（Erysiphales）建立的特異性LAMP檢測技術，以鈣黃綠素為染色劑，最低能檢測到 0.3 μg/L 的病原菌DNA［30］。這些LAMP檢測技術完成現場檢測無需分離真菌與植物的DNA，直接進行總DNA粗提后即可進行病害檢測，且檢測限可達到10-9 mg級甚至10-12 mg級，其靈敏度遠高于普通PCR方法。

但是在田間檢測時，很多植物組織提取DNA時常常帶有很多雜質，這些雜質會降低DNA質量，也有的雜質會干擾LAMP反應進程，最終會導致檢測結果不準確，這是限制LAMP檢測效率的一大難題。因此有些LAMP技術會配套合適的DNA提取方法，提高檢測結果的準確性。例如針對蘋果樹腐爛病菌的LAMP檢測技術同樣配套了田間快速DNA提取方法，能夠在田間得到純度較高的DNA，進而得到準確的檢測結果；以SYBR Green Ⅰ為染色劑，最低能夠檢測到1 mg/L的病原菌DNA，一個反應最低能檢測到10個分生孢子的病菌［11］。

2.2 細菌的檢測

針對細菌病害建立LAMP檢測技術相對簡單，因為革蘭氏陰性菌在環(huán)境溫度過高時，細菌就會死亡進而裂解，其DNA會自然暴露出來；在針對革蘭氏陽性菌建立LAMP檢測時，也需考慮DNA提取問題，為了提高方法的靈敏度，核酸仍然需要分離和純化。

目前針對不同的細菌病害，已經建立了很多對應的LAMP檢測技術。例如針對馬鈴薯黑脛病菌建立的LAMP檢測技術，以SYBR Green Ⅰ為染色劑，最低能夠檢測到10 CFU/mL 病原菌或0.1 μg/L的病原菌DNA［31］；針對瓜類細菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp. citrulli，Aac）和番茄細菌性潰瘍病菌（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis，Cmm）的環(huán)LAMP檢測技術，[JP3]以SYBR Green Ⅰ為染色劑，最低分別能夠檢測到1.72×102 fg/L[JP]的Aac和0.126 μg/L的Cmm［32］；針對獼猴桃細菌性潰瘍病建立的LAMP檢測技術，分別對獼猴桃葉片、樹皮、[JP2]花粉等樣品進行快速檢測，以SYBR Green Ⅰ為染色劑，最低能夠檢測到100 CFU/mL[JP]的獼猴桃細菌性潰瘍病病原菌［33］；針對方中達迪克氏菌建立的LAMP檢測技術，以SYBR GreenⅠ為染色劑，最低能夠檢測到0.1 μg/L的病原菌DNA，而且能夠在多種植物上進行該細菌的檢測［34］。

2.3 病毒的檢測

RNA病毒占植物病毒絕大多數，常規(guī)逆轉錄PCR需先進行逆轉錄，再進行PCR檢測。而LAMP技術可以通過在反應體系內加入逆轉錄酶，從而同步進行逆轉錄及LAMP反應，所以LAMP技術在植物病毒病害的檢測中有更廣泛的使用。最早于2003年，Fukuta等以RNA為模板，通過在反應體系中加入逆轉錄酶，使逆轉錄反應和LAMP反應同時進行，實現了對日本紅薯花葉病毒的RT-LAMP檢測技術，通過觀察焦磷酸鎂沉淀來判斷反應結果［35］。隨著各種不同染色劑的應用，RT-LAMP技術得到了更廣泛的應用，如2020年，針對馬鈴薯卷葉病毒（potato leafroll virus，PLRV）建立了RT-LAMP檢測技術，以SYBR Green Ⅰ為染色劑，最低能夠檢測到5 μg/L的病原菌DNA［36］；2021年，針對玫瑰蓮座叢病毒（rose rosette virus，RRV）建立了RRV的RT-LAMP檢測技術，以HNB為染色劑，最低能夠檢測到 1 μg/L 的病原菌DNA［37］。

2.4 線蟲的檢測

農業(yè)線蟲病害一般是土傳病害，造成多種植物的根結線蟲病。在林業(yè)上也有線蟲侵害樹體，導致樹木無法成材，進而造成經濟損失，因此建立線蟲的LAMP檢測技術在生產上有很重要的意義。LAMP檢測技術具有便捷性及高效性，能夠隨時進行土壤檢測，及時發(fā)現病害并進行防治。

2016年，魏洪巖等建立了可以檢測蘋果根結線蟲（Meloidogyne mali）的LAMP檢測技術，以SYBR Green Ⅰ為染色劑和試紙條判定檢測結果，最低能夠檢測到1/20 000條線蟲DNA［38］；2019年，張磊等建立了一種可以快速檢測M. fallax和M. chitwoodi 2種根結線蟲的LAMP檢測方法，以SYBR Green Ⅰ為染色劑，最低能夠檢測到10 μg/L的線蟲DNA［39］。

3 總結與展望

LAMP 技術最顯著的優(yōu)勢在于恒溫擴增，不用依賴于昂貴的控溫設備，而且其反應速度快（1 h以內完成反應）、特異性高、靈敏性高、反應結果判定簡單，對DNA質量要求不高，田間植物樣品中粗提的DNA即可進行反應，已經被廣泛地應用于地各個領域的病原生物檢測和監(jiān)控［40-41］。

對于LAMP技術被廣泛詬病的氣溶膠污染問題，目前已有一種比較常用的解決辦法，可以在反應體系中加入礦物油，用于控制PCR反應后的氣溶膠污染，因為其密度比水小，而且不會參與反應，加入反應體系后會浮在反應體系的最上面，從而達到封閉反應的作用［11］。因此，在加入礦物油的LAMP體系，即使反應結束后開蓋加入熒光染料，也不會造成氣溶膠污染。

LAMP技術是一種多用途的技術，在其基礎上稍加修改，就可以達到不同的檢測目的，如加入逆轉錄酶即可進行病毒檢測（reverse transcriptase loop mediated isothermal amplification，RT-LAMP），加入熒光染料即可進行實時LAMP檢測（real-time LAMP）和多套引物聯(lián)用檢測多種病害的多重LAMP檢測（multiplex LAMP）。CRISPR/Cas12a是一種RNA引導的核酸內切酶，廣泛應用于基因編輯中，能夠特異性識別DNA靶序列，并對其進行切割。Wang等通過聯(lián)用CRISPR/Cas12a和LAMP技術，設計高特異性的引物，使CRISPR/Cas12a能快速切割LAMP反應中間產物，得到單鏈DNA，并結合側流層析試紙條，可視化檢測結果，使檢測效率得到進一步提升［42］?？傊琇AMP技術用途廣泛，并可以與多種技術結合使用，可以根據科研任務的不同，設計不同的LAMP檢測體系，以達到科研目的。

農業(yè)病害檢測技術的應用，還要考慮一個很重要的因素就是價格。LAMP檢測技術相較于其他檢測技術的優(yōu)勢就是成本低廉。首先，LAMP檢測技術相較于傳統(tǒng)PCR檢測，不依賴昂貴的控溫設備，僅需恒溫水浴鍋或者保溫杯即可完成反應，大大降低了檢測成本。其次，相較于其他恒溫擴增技術，LAMP技術僅需1種Bst聚合酶，檢測體系中沒有昂貴的成分，引物中僅內引物需要將2個DNA片段連接起來，不需要添加額外的熒光基團和猝滅基團來修飾引物，相比于其他恒溫擴增技術，LAMP檢測技術單次檢測的成本更低。最后，檢測結果可以依靠加入的染色劑顏色變化判定，雖然不同的染色劑價格不同，但因為每次染色劑所用量很少，所以無論使用何種染色劑，平均單次檢測所需的成本仍然十分低廉。

檢測技術正朝著操作簡單、準確性高、能夠更廣泛應用的方向發(fā)展。隨著LAMP技術的廣泛應用，有很多可以進一步使LAMP技術更廣泛應用的產品被開發(fā)出來。如最近報道了一種基于LAMP技術開發(fā)的可折疊微型檢測設備，用于檢測大米種子中的Magnaporthe oryzae和Sarocladium oryzae［23］。同時還有很多的便攜的LAMP檢測設備被發(fā)明出來，如 ESE-Quant tube scanner （Qiagen，Netherlands）和 Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR system，可以用于進行實時LAMP檢測［43］。更有一種超便攜的檢測設備（point-of-care kit for the entire test，POCKET），可以使用于LAMP檢測中，這種設備僅使用手機作為加熱源來維持LAMP反應所需的溫度，同時手機可以作為信號采集設備和結果讀取設備［44］。以上這些設備的出現，大大提升了LAMP技術的田間應用性，進一步降低了LAMP技術的使用要求，為該技術的更廣泛的應用提供了可行性。

總之，LAMP技術作為一種特異性高、靈敏性高、檢測效率高、檢測結果可視化的新型核酸擴增檢測技術，已經發(fā)展為能夠與多種新技術聯(lián)用，配合各種便攜設備，進行更簡便、更快速、更準確的田間快速檢測，LAMP技術的發(fā)展符合市場的需求，在農業(yè)病害檢測領域具有非常廣闊的應用前景。

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基金項目：遼寧省科技項目（編號：2021JH/10400034、2022JH2/101300164） 。

作者簡介：王一波（1994—），男，遼寧沈陽人，碩士，研究實習員，從事花生栽培及病害防控研究研究。E-mail：465910393@qq.com。

通信作者：王海新，研究員，從事花生栽培研究和推廣工作。E-mail：wanghaixin99@163.com。