呂娟 孫廣瀚 萬磊 李方澤 吳曙琳 熊瑛 張伊敏

*基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目（81973655）；國家自然科學(xué)基金面上項目（82274501）；2022 年湖南省教育廳科學(xué)研究項目（22C0684）

第一作者簡介：呂娟（1990-），女，主治醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治風(fēng)濕痛。

摘要：目的? 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探究“羌活-獨活”治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供參考。方法? 在TCMSP數(shù)據(jù)庫以羌活、獨活為關(guān)鍵詞分別進(jìn)行檢索，利用GeneCard、Drugbank、TDD、OMIM四個數(shù)據(jù)庫，以“rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞檢索疾病相關(guān)靶點，利用R語言包VennDiagram將預(yù)測的羌活、獨活活性靶點和收集的RA疾病相關(guān)靶點進(jìn)行分析，獲得共同靶點，將中藥、化學(xué)成分和共同靶點上傳至Cytoscape 3.6.0軟件繪制中藥-化學(xué)成分-藥物疾病共同靶點網(wǎng)絡(luò)圖，使用Metascape數(shù)據(jù)庫對共同靶點進(jìn)行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫尋找關(guān)鍵活性成分的化合物分子結(jié)構(gòu)，利用PDB數(shù)據(jù)庫尋找核心作用靶點的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。結(jié)果? KEGG通路及GO生物過程富集結(jié)果顯示，羌活、獨活可能通過癌癥通路、鈣信號通路、雌激素信號通路、PI3K-Akt 信號通路、cAMP 信號通路等信號通路治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。分子功能主要體現(xiàn)在核受體活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、肽酶活性、蛋白域特異性結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚化活性。主要通過細(xì)胞器外膜、內(nèi)吞囊泡、受體復(fù)合物、突觸后膜、膜筏等傳送物質(zhì)，進(jìn)行對類固醇激素的反應(yīng)、對藥物的反應(yīng)、調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運、凋亡信號通路的表達(dá)、血液循環(huán)、細(xì)胞對有機(jī)環(huán)狀化合物等反應(yīng)。選擇NOS3、JUN、ESR1進(jìn)行羌活-獨活中有效成分β-谷甾醇、o-乙酰二氫歐山芹酯、蛇床夫內(nèi)酯的分子對接，其中JUN與β-谷甾醇、o-乙酰二氫歐山芹酯、蛇床夫內(nèi)酯表現(xiàn)出較強(qiáng)的結(jié)合活性。結(jié)論? 基于基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探究“羌活-獨活”治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制，羌活、獨活可能通過抑制細(xì)胞增殖，雌激素作用反應(yīng)等治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。

關(guān)鍵詞：羌活；獨活；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對接

中圖分類號：R684.3??? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A??? 文章編號：1007-2349（2024）05-0060-07

安徽徽州（今黃山市）轄一府六邑，醫(yī)風(fēng)昌盛，出現(xiàn)以汪機(jī)、徐春甫、孫一奎、程鐘齡、程杏軒為代表的800余位新安醫(yī)家［1］。痹病主要癥狀是關(guān)節(jié)疼痛，包含現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》中即揭示痹病的發(fā)病與風(fēng)、寒、濕等氣候因素密切相關(guān)，而新安地域多山，山林又多濕氣，因此新安地區(qū)痹病的發(fā)病率居高，新安醫(yī)家對痹病論述也較多［2］。

羌活和獨活統(tǒng)稱“二活”，是臨床治療痹病常用藥對，都屬于傘形科植物，均能祛風(fēng)寒濕［3］，有研究表明藥對羌活與獨活能夠在不同程度上顯著性的減輕關(guān)節(jié)炎大鼠的足趾腫脹［4］。本文運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接對“羌活-獨活”治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1? 資料與方法

1.1? 中藥成分與作用靶點的篩選? 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以羌活、獨活為關(guān)鍵詞分別進(jìn)行檢索，以O(shè)B值≥30，DL值≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出具有較高生物活性及利用價值的化學(xué)成分，并利用該數(shù)據(jù)庫對篩選出的化學(xué)成分進(jìn)行靶點預(yù)測。對于TCMSP無法預(yù)測的化學(xué)成分，查閱相關(guān)文獻(xiàn)及利用PharmMapper數(shù)據(jù)庫（http：//lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/）進(jìn)行檢索補(bǔ)充，選擇可能性≥0.9的靶點蛋白。將靶點預(yù)測結(jié)果合并整理后，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫（Universal Protein，https：//www.uniprot.org/），以“reviewed”、“Homo sapiens”為篩選標(biāo)準(zhǔn)，將預(yù)測靶點的蛋白質(zhì)名稱轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)的基因名稱，獲得羌活、獨活活性成分的相關(guān)作用靶點。

1.2? RA疾病相關(guān)靶點收集? 利用GeneCard（http：//www.genecards.org/）、Drugbank（http：//go.drugbank.com/）、TDD（Therapeutic Target Database，http：/db.idrblab.net/ttd/）、OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man，http：//omim.org/）四個數(shù)據(jù)庫，以“rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞檢索疾病相關(guān)靶點。將四個數(shù)據(jù)庫得到的所有相關(guān)靶點合并、刪除重復(fù)項，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫將整合后的靶點名稱轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)的基因名稱。

1.3? 共同靶點篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建? 利用R語言包VennDiagram將預(yù)測的羌活、獨活活性靶點和收集的RA疾病相關(guān)靶點進(jìn)行分析，獲得共同靶點。將共同靶點上傳至string數(shù)據(jù)庫（http：//www.string-db.org/），物種設(shè)置為“Homo sapiens”，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并將計算得到的tsv文件導(dǎo)入Cytoscape3.6.0軟件，利用插件CytoHubba中MCC算法篩選出前10位基因并繪制相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4? 構(gòu)建中藥-化學(xué)成分-藥物疾病共同靶點網(wǎng)絡(luò)? 將中藥、化學(xué)成分和共同靶點上傳至Cytoscape 3.6.0軟件繪制中藥-化學(xué)成分-藥物疾病共同靶點網(wǎng)絡(luò)圖，并通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析得出degree值排名前三的化學(xué)成分。

1.5? 共同靶點富集分析? 使用Metascape數(shù)據(jù)庫（http：//metascape.org/）對共同靶點進(jìn)行GO（Gene Ontology）功能富集分析及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析，物種設(shè)置為“H.sapiens”，p值<0.01，最小計數(shù)為3，富集因子大于1.5，并根據(jù)富集分析結(jié)果利用R語言進(jìn)行可視化處理。

1.6? 分子對接結(jié)果驗證? 選取中藥-化學(xué)成分-共同靶點網(wǎng)絡(luò)中degree值排名前三的化學(xué)成分作為可能的關(guān)鍵化學(xué)成分，根據(jù)文獻(xiàn)及現(xiàn)代研究篩選PPI網(wǎng)絡(luò)圖中NCA算法獲得的靶點作為可能的核心作用靶點。利用TCMSP數(shù)據(jù)庫尋找關(guān)鍵活性成分的化合物分子結(jié)構(gòu)，利用PDB數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank，http：//www1.rcsb.org/）尋找核心作用靶點的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。運用AutoDock Tools 1.5.6軟件對化合物及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)處理并進(jìn)行柔性分子對接，以結(jié)合能作為對接結(jié)果的評判標(biāo)準(zhǔn)，驗證羌活、獨活治療RA可能的關(guān)鍵化學(xué)成分和核心作用靶點，使用TBtools和pymol 3.7對所得結(jié)果可視化。

2? 結(jié)果

2.1? 羌活、獨活治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

2.1.1? 羌活、獨活活性成分及靶點的獲取? 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，收集到有效化學(xué)成分羌活活性成分15個，獨活9個，共有20個，重復(fù)4個（Nodakenin 紫花前胡苷、beta-sitosterol β-谷甾醇、 Isoimperatorin 異歐前胡素、Ammidin歐前胡素），見表1、2。

2.1.2? 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點的獲取? 匯總GeneCards，Drugbank，OMIM和TTD疾病數(shù)據(jù)庫中有關(guān)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的靶點，去除重復(fù)項，得到疾病相關(guān)靶點4165個。將羌活、獨活活性成分的潛在作用靶點與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病靶點輸入Venny 2.1.0在線工具繪制韋恩圖，取其交集后獲得疾病-藥物共同靶點35個，見圖1。

2.1.3? 羌活、獨活治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點-類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點網(wǎng)絡(luò)互作圖（PPI）構(gòu)建? 通過STRING數(shù)據(jù)庫對交集靶點進(jìn)行PPI分析，共涉及35個節(jié)點和114條邊，見圖2。運用CytoNCA插件和拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，計算出BC、CC、DC、EC、LAC、NC的中位數(shù)，分別為20.190、0.436、6.000、0.078、1.667、3.583，其中均大于中位數(shù)的靶點共8個，見圖3、表4。這些靶點在PPI中起著關(guān)鍵作用，是羌活、獨活活性成分治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的核心靶點。圖2? 羌活、獨活治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點-類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點網(wǎng)絡(luò)互作圖

圖3? 羌活、獨活活性成分治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的核心靶點

2.1.4? 核心靶點的GO功能分析、KEGG通路分析? 對羌活、獨活共同靶點進(jìn)行生物富集分析，得到GO功能富集條目652條，其中，生物過程（BP）545條、細(xì)胞組成（CC）30條和分子功能（MF）50條，經(jīng)基因占比≥10%，BP選前20位后見圖4。根據(jù)Metascape數(shù)

據(jù)庫篩得到KEGG通路123條，可預(yù)測羌活、獨活的治療作用主要分布在癌癥通路、鈣信號通路、雌激素信號通路、PI3K-Akt 信號通路、cAMP 信號通路等信號通路，見圖5。

2.1.5? 羌活、獨活有效成分-類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎核心靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建? 將羌活、獨活的活性成分和其潛在作用靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件中，構(gòu)建“成分-靶點-信號”網(wǎng)絡(luò)圖及“中藥-有效成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)，見圖6、7。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果顯示，羌活、獨活中degree值排名前三的活性成分為β-谷甾醇、o-乙酰二氫歐山芹酯、蛇床夫內(nèi)酯這些活性成分可能為羌活獨活治療RA發(fā)揮療效的主要活性成分。

2.2? 分子對接分析? 選擇degree值排名前三位（≥10）的有效成分（β-谷甾醇、o-乙酰二氫歐山芹酯、蛇床夫內(nèi)酯）與NCA算法及文獻(xiàn)及現(xiàn)代研究篩選出的選擇與靶點蛋白NOS3、JUN、ESR1進(jìn)行分子對接。分子對接結(jié)果顯示，β-谷甾醇和NOS3、JUN、ESR1靶點蛋白的結(jié)合分值分別為-10，-5.18，-8.39-kcal·mol-1，o-乙酰二氫歐山芹酯和NOS3、JUN、ESR1靶點蛋白的結(jié)合分值分別為-7.00，-4.89，-7.81 kcal·mol-1，蛇床夫內(nèi)酯和NOS3、JUN、ESR1靶點蛋白的結(jié)合分值分別為-8.75，-3.74，-6.64 kcal·mol-1，表現(xiàn)出較強(qiáng)的結(jié)合活性，見圖8；通過分子對接可視化圖，說明β-谷甾醇、o-乙酰二氫歐山芹酯、蛇床夫內(nèi)酯與NOS3、JUN、ESR1 3個靶點蛋白可自發(fā)結(jié)合，借助氫鍵等分子間作用力產(chǎn)生較穩(wěn)定構(gòu)象，分子對接可視化結(jié)果見圖9。

3? 討論

羌活和獨活統(tǒng)稱“二活”，是中醫(yī)藥治療痹病常用藥對，蠲痹湯等經(jīng)典名方就包含此對藥。羌活味辛苦，性溫，歸膀胱經(jīng)、腎經(jīng)，《玉楸藥解》記載其具有治療“中風(fēng)痿痹喁斜、關(guān)節(jié)攣痛、皮膚瘙癢、癰疽疥癩諸?。?］”。主要化學(xué)成分為香豆素類、聚炔類、酚酸類、生物堿類等化合物，現(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為其具有抗炎抗菌、抗氧化、抗病毒活性、解熱和鎮(zhèn)痛等作用，主要在心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等方面有作用［6］。獨活味辛苦，性微溫，歸膀胱經(jīng)、腎經(jīng)，《藥性會元》記載其具有“治諸風(fēng)掉眩，頸項難伸，風(fēng)寒濕痹，兩足不仁，療諸風(fēng)骨節(jié)疼痛［7］”的功效。主要化學(xué)成分為香豆素類、揮發(fā)油類等化合物，現(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為其具有抗炎、抗氧化等作用［8］。羌活、獨活相配伍，有學(xué)者提出在痹病初期即用大劑量有明顯效果［9］，對于屬中醫(yī)痹病范疇的骨關(guān)節(jié)炎亦有良好效果［10］，能夠在不同程度上顯著性的減輕關(guān)節(jié)炎大鼠的足趾腫脹［4］。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果顯示，PTGS2、CASP3、NOS3、HSP90AA1、JUN、ESR1、TGFB1、NOS2是羌活-獨活治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵靶點。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以滑膜細(xì)胞增生和血管翳形成為主要病理改變的自身免疫性疾病，而現(xiàn)階段研究表明NOS3可釋放的內(nèi)皮型NO促進(jìn)血管舒張，參與血管生成［11］。治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的主要手段即抑制滑膜細(xì)胞增生，JNK通路與細(xì)胞壞死、凋亡有密切關(guān)系，賈慶運［12］即運用《醫(yī)學(xué)心悟》中蠲痹湯及有效成分紫花前胡甙、紫云英苷治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，猜想其有效的機(jī)制可能是通過抑制JNK、AP-1c-Jun的磷酸化相關(guān)。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎另一突出表現(xiàn)即女性發(fā)病率較高［13］，可能是女性體內(nèi)雌激素通過增強(qiáng)IL-17的表達(dá)參與病程［14］，有研究表明雌二醇與ESR1的靶向結(jié)合可促進(jìn)細(xì)胞增殖［15］。經(jīng)上述相關(guān)文獻(xiàn)研究，本文選擇NOS3、JUN、ESR1進(jìn)行羌活-獨活中有效成分β-谷甾醇、o-乙酰二氫歐山芹酯、蛇床夫內(nèi)酯的分子對接，其中JUN與β-谷甾醇、o-乙酰二氫歐山芹酯、蛇床夫內(nèi)酯表現(xiàn)出最強(qiáng)的結(jié)合活性。

KEGG通路及GO生物過程富集結(jié)果顯示，羌活、獨活可能通過癌癥通路、鈣信號通路、雌激素信號通路、PI3K-Akt 信號通路、cAMP 信號通路等信號通路治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。分子功能主要體現(xiàn)在核受體活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、肽酶活性、蛋白域特異性結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚化活性。主要通過細(xì)胞器外膜、內(nèi)吞囊泡、受體復(fù)合物、突觸后膜、膜筏等傳送物質(zhì)，進(jìn)行對類固醇激素的反應(yīng)、對藥物的反應(yīng)、調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運、凋亡信號通路的表達(dá)、血液循環(huán)、細(xì)胞對有機(jī)環(huán)狀化合物等反應(yīng)。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接進(jìn)一步探究作用機(jī)制。下一步將通過基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用進(jìn)行驗證。

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（收稿日期：2023-08-10）