宋夢星，夏敏，楊雅雯，馬占龍

作者單位 南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院放射科，南京 210029

0 引言

心肌纖維化（myocardial fibrosis, MF）是由細胞外基質蛋白的過度沉積引起的心肌細胞間質的擴張及擴大，是多種心臟疾病的共同常見的病理生理表現(xiàn)。MF 引起心臟重塑，導致心臟收縮功能和舒張功能受損，加速心臟疾病惡化，其持續(xù)性進展可能引發(fā)心力衰竭甚至死亡等嚴重不良預后[1]。

目前，磁共振成像（magnetic resonance imaging,MRI）作為一種非侵入性檢查方法，已成為MF 定性和定量的重要影像學檢查方法[2-4]。對于心臟疾病的診斷，MRI 使用的對比劑主要是含釓對比劑（Gadolinium-based contrast agent, GBCAs），而GBCAs 具有腎毒性，用于急性腎損傷及慢性腎臟病患者可引起神經(jīng)系統(tǒng)異常聚集，嚴重影響了對腎功能不全患者的檢查；此外普通心臟MRI尚無法精準評估心肌纖維化發(fā)展過程中的重要蛋白的變化，這對于心肌纖維化治療前后動態(tài)評估具有一定的限制。而超小超順磁性氧化鐵（ultrasmall supperparamagnetic iron oxide, USPIO）納米顆粒比GBCAs具有更高的磁性能，腎毒性更低，且具有良好的生物相容性，在血管內循環(huán)時間更長，能與特定配體或抗體靶向結合，進而可以實現(xiàn)MR靶向成像，目前已經(jīng)用于多種心血管疾病的成像研究[5-8]。

轉化生長因子-β1（transforming growth factor beta-1,TGF-β1）作為膠原蛋白累積的驅動因素，通過與其受體結合后使Smads 蛋白磷酸化，誘導心肌成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，導致I型和Ⅲ型膠原纖維在心肌間質和血管周圍的過度沉積，是MF發(fā)生發(fā)展過程中最重要的因子[9-10]。目前臨床中想要獲得TGF-β1的表達尚需依賴心肌活檢，而心肌活檢為有創(chuàng)性檢查，不僅存在取樣偏差，還可能導致出血、感染、心律失常等嚴重并發(fā)癥。目前MRI 已成為評估MF 的主要方法，但利用MRI 檢測MF 中TGF-β1 表達的研究尚未見報道。因此，本研究擬以TGF-β1 為靶點，構建靶向TGF-β1 的分子探針，在體檢測MF 過程中細胞及蛋白水平的TGF-β1 表達并進行MRI，以期從分子水平到組織和器官水平精準評估心肌纖維化，為臨床治療方案的制訂提供有力的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

異丙腎上腺素（isoprenaline, ISO）購自上海麥克林生化科技有限公司；TGF-β1 抗體購自北京博奧森生物技術公司；DSPE-MPEG200、DSPE-PEG 2000-COOH 購自上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司；普魯士藍染液套裝、組織化學試劑盒DAB 顯色劑、PBS、4%多聚甲醛購自武漢賽維爾生物科技有限公司；NIKON ECLIPSE E100 正置光學顯微鏡、成像系統(tǒng)（日本尼康）。

1.2 實驗動物及分組

選取雄性清潔級SD 大鼠40 只，6 周齡，體質量220～240 g（購自北京維通利華實驗動物技術有限公司），隨機分為模型組30 只和健康對照組10 只。在溫度20 ℃～25 ℃環(huán)境中飼養(yǎng)，每天黑暗和光照交替12 h。模型組大鼠皮下注射ISO，5 mg/（kg·d），連續(xù)7 d，健康對照組不作處理。采用M 型超聲檢查，獲得左心功能參數(shù)，評估模型組大鼠MF 建模情況。本研究經(jīng)過南京醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審查批準（批準文號：IACUC-2004002-1）。

1.3 超聲心動圖檢查

隨機選取模型組與健康對照組大鼠各10只，采用乙醚吸入麻醉方式將實驗動物麻醉，充分暴露大鼠胸部，超聲心動儀選用Vevo LAB 小動物超聲影像系統(tǒng)（VisualSonics公司，加拿大），利用21 MHz線陣探頭進行掃描檢查。采用胸骨旁長軸切面，測定舒張末期室間隔厚度（end-diastolic dimension interventricular septum thickness, IVSTd）；收縮末期室間隔厚度（end-systolic dimension interventricular septum thickness, IVSTs）、舒張末期左室內徑（left ventricular end-diastolic dimension, LVEDD）、收縮末期左室內徑（left ventricular end-systolic dimension, LVESD）、舒張末期左室后壁厚度（left ventricular end-diastolic posterior wall, LVPWd）、收縮末期左室后壁厚度（left ventricular end-systolic posterior wall , LVPWs）、左室射血分數(shù)（ejection fraction, EF）、左室短軸縮短率（fractional shortening, FS）、左室質量（left ventricular mass, LV Mass）、舒張末期左室容積（left ventricular end-diastolic volume, LVEDV）、收縮末期左室容積（left ventricular end- systolic volume, LVESV），獲得左心功能參數(shù)。

1.4 USPIO-anti-TGF-β1靶向探針的合成及表征

采用化學交聯(lián)法合成TGF-β1 靶向探針（USPIO-anti-TGF-β1）（圖1，由Figdraw 繪制）。分別稱取150 mg DSPE-MPEG2000、50 mg DSPE-PEG 2000-COOH，充分溶解于三氯甲烷中；加入10 mg（以Fe計）的Fe3O4@OA納米顆粒及4 mL去離子水，混勻后在70 ℃水浴鍋中蒸發(fā)10 min，去除三氯甲烷，獲得USPIO（Fe3O4@DSPE-PEG），取1 mg（以Fe 計）USPIO 溶液，分別加入100 μL TGF-β1 抗體，同時加入100 μL 2-（N-嗎啉）乙磺酸緩沖液（0.01 M，pH＝5.5）調節(jié)溶液pH 至5.5，置于25 ℃搖床混勻吸附30 min（120 rpm）。在反應體系中加入0.5 mg EDC進行交聯(lián)，25 ℃搖床反應4.5 h（120 rpm）。反應結束后，反應液通過磁分離柱純化，以除去游離的抗體，4 ℃保存。采用透射電子顯微鏡觀察納米顆粒的形貌特征，動態(tài)光散射分析儀測定探針水和粒徑及Zeta電位，在7.0 T MRI 下掃描不同濃度的USPIO-anti-TGF-β1 靶向探針，探究其弛豫效能。

圖1 USPIO-anti-TGF-β1靶向探針合成示意圖。Fig.1 Schematic diagram of the probe synthesis USPIO-anti-TGF-β1.

1.5 各組大鼠體內MRI

將模型組大鼠隨機分為實驗組、單純對照組及空白對照組，每組各10只，所有大鼠在打藥前及打藥后均進行心臟掃描，采用7.0 T 小動物MRI 儀（Bruker PharmaScans，德國，南京醫(yī)科大學磁共振影像實驗室）進行檢測。1.5%異氟烷氣體麻醉后，將大鼠固定于掃描床內，并以1.5%異氟烷與空氣混合氣體維持麻醉狀態(tài)，接心電門控，調節(jié)大鼠的心率維持約300～340 次/min，呼吸頻率維持約35 次/min。采用大鼠頭部線圈，行T2*序列成像，主要參數(shù)如下：視野3 cm×3 cm，矩陣256×256，回波時間3.5 ms，重復時間130 ms，掃描層厚1 mm，翻轉角30°。

掃描結束后，實驗組予以USPIO-anti-TGF-β1 靶向探針尾靜脈注射，劑量為10 mg Fe/kg；單純對照組予以相同劑量單純USPIO 納米顆粒尾靜脈注射；空白對照組注射相同劑量生理鹽水。12 h后，再次掃描相同層面心臟。

MRI 圖像分析手動選擇感興趣區(qū)域，在T2*序列圖像上每個標本于室間隔及左心室隨機選擇5個感興趣區(qū)，取其平均值。采用Image J 1.53 軟件（National Institutes of Health，美國）計算心肌的MRI 圖像信號強度，相對信號強度（relative signal intensity, rSI）定義為同層面心肌信號強度/肌肉信號強度。

1.6 病理學分析

MRI 掃描完成后，將各組大鼠安樂死，固定于手術板，快速分離心肌組織，放于4%多聚甲醛中固定，用于病理切片。分別作普魯士藍染色、免疫組化和普魯士藍染色，普魯士藍染色觀察心肌組織纖維化情況，免疫組化觀察心肌組織中TGF-β1的表達情況，普魯士藍染色觀察心肌組織內鐵顆粒的沉積。應用Image J 1.53計算心肌膠原容積分數(shù)（collagen volume fraction,CVF）[式（1）]；采用Image-Pro plus 6.0（Media Cybernetics公司，美國）計算TGF-β1表達（單位面積中的平均吸光度值，作為免疫組織化學結果定量依據(jù)）。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 26.0（International Business Machines Corporation 公司，美國）統(tǒng)計軟件，采用Shapiro-Wilk和Levene檢驗對連續(xù)性數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布和方差齊性檢驗，如符合正態(tài)分布且方差齊，以±s表示，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗進行分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠MF模型建立的檢測結果

M型超聲胸骨旁長軸切面顯示：與健康對照組大鼠比較，模型組EF、FS降低，LV Mass增加，Vold減小，LVPWd增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 兩組大鼠心臟結構參數(shù)變化（n=10）Tab.1 Changes in cardiac structural parameters in the two groups of rats (n=10)

2.2 USPIO-anti-TGF-β1 靶向探針合成的鑒定結果及其表征分析

合成的USPIO-anti-TGF-β1靶向探針溶液呈棕色清澈液體，透射電子顯微鏡下顯示探針呈球形或類球形，于PBS中分布均勻，分散性良好（圖2A）；單純USPIO水動力學尺寸為（15.55±0.45） nm，USPIO-anti-TGF-β1 靶向探針水動力學尺寸為（23.01±1.75） nm，二者之間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示成功合成了探針，且USPIO-anti-TGF-β1 靶向探針的水動力學尺寸的分布較窄（圖2B），說明探針顆粒分散性較好，沒有明顯的聚集現(xiàn)象，提示探針的穩(wěn)定性較好。USPIO 的Zeta 電位為-（46.2±1.38） mV，USPIO-anti-TGF-β1 靶向探針的Zeta 電位為-（23.1±2.69） mV，二者之間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。7.0 T MR 掃描不同濃度探針，可見隨探針濃度的增加，信號逐漸減低（圖2C）；以探針濃度（mg/mL）為橫坐標（X），1/T2*為縱坐標作圖（圖2D），線性回歸方程為：Y=1.75X+0.088，R2=0.9976，該探針的T2*弛豫率為1.75/（mg·ms），表明合成探針具有良好的超順磁性。

圖2 USPIO-anti-TGF-β1 靶向探針的表征結果。2A：透射電子顯微鏡下USPIO-anti-TGF-β1的形態(tài)及分布；2B：USPIO-anti-TGF-β1的水動力學尺寸分布圖；2C：從左到右分別為濃度0、0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL的USPIO-anti-TGF-β1 MRI圖像；2D：不同濃度的USPIO-anti-TGF-β1與1/T2*關系圖。Fig.2 Characterization results of USPIO-anti-TGF- β1 probe.2A:Morphology and distribution of USPIO-anti-TGF-β1 under transmission electron microscopy; 2B: Hydrodynamic size distribution of USPIO-anti-TGF-β1; 2C: USPIO-anti-TGF-β1 MRI at concentrations of 0,0.02, 0.04, 0.06, and 0.08 mg/mL from left to right, respectively; 2D:relationship between different concentrations of USPIO-anti-TGF-β1 and 1/T2*.

2.3 實驗組和對照組大鼠體內MRI

7.0 T MR 掃描圖像（圖3）結果顯示：實驗組大鼠給藥前掃描結果顯示心肌信號尚均勻，未見明顯低信號區(qū)，rSI 為0.72±0.12，給藥12 h 后再次掃描結果顯示心內膜下心肌可見信號減低區(qū)，rSI 為0.62±0.10，二者相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；單純對照組大鼠給藥前rSI 為0.73±0.12，注射單純USPIO 12 h 后，心肌信號未見明顯減低，rSI 為0.71±0.12，差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.81）?？瞻讓φ战M兩次掃描信號無明顯變化（0.70±0.13 vs.0.73±0.13，P=0.52）。

圖3 實驗組、單純對照組、空白對照組大鼠心臟7.0 T MR 掃描圖像。3A～3C 為給藥前掃描圖像；3D～3F 為給藥后12 h 掃描圖像；3G～3I為3D～3F 放大圖像；相同類型箭頭指示心臟同一部位的信號強度變化。Fig.3 7.0 T MR images of rat hearts of experimental group, the simple control group and the blank control group.3A-3C show the images before administration; 3D-3F represent the images 12 h after administration; 3G-3I are the enlarged images of 3D-3F.Arrows of the same type indicate changes in signal intensity in the same part of the heart.

2.4 模型組與健康對照組大鼠心肌組織病理學分析結果

普魯士藍染色顯示，模型組大鼠MF 區(qū)域主要位于心內膜下，大面積纖維化組織取代正常心肌組織，可見大量藍染的纖維結締組織將心肌肌束分隔包繞（圖4A、4E）；健康對照組大鼠心肌間質膠原纖維數(shù)量少、分布規(guī)則，肌纖維排列整齊，心肌肌束形態(tài)完整（圖4C、4G）。與健康對照組大鼠心肌相比，模型組大鼠心肌CVF 明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義[（2.36±0.29）% vs.（22.51±7.78）%，P＜0.01]。

圖4 模型組與健康對照組大鼠心肌組織病理學變化及TGF-β1 表達量結果[全景掃描（4A～4D）及×200（4E～4F）]。4A、4E：模型組大鼠心肌普魯士藍染色；4B、4F：模型大鼠心肌免疫組化TGF-β1表達；4C、4G：健康對照組大鼠心肌普魯士藍染色；4D、4H：空白對照組大鼠心肌免疫組化TGF-β1表達。Fig.4 Pathological changes of myocardial tissue and TGF-β1 expression in rats in the model group and the healthy control group [Panoramic scanning (4A-4D) and ×200(4E-4F)].4A and 4E: Masson staining of rat myocardium in the model group; 4B and 4F: Immunohistochemical TGF-β1 expression in the model rat myocardium; 4C and 4G:Masson staining of rat myocardium in the healthy control group; 4D and 4H: immunohistochemical TGF-β1 expression in rat myocardium in the blank control group.

免疫組化顯示，模型組大鼠心肌組織中TGF-β1的陽性表達區(qū)主要分布于膠原纖維周圍的心肌組織及纖維化區(qū)域（圖4B、圖4F），健康對照組心肌免疫組化顯示無明顯棕黃色陽性顆粒沉積（圖4D、圖4H）。與健康對照組相比，模型組大鼠心肌組織TGF-β1 的平均吸光度值明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義（0.011±0.003 vs.0.002±0.001，P＜0.01）。

普魯士藍染色顯示，模型組中實驗組大鼠心肌中有藍色鐵顆粒沉積（圖5A），單純對照組大鼠心肌中僅有極少的鐵顆粒沉積（圖5B），空白對照組大鼠心肌中無明顯藍色鐵顆粒沉積（圖5C）。

圖5 實驗組、單純對照組及空白對照組心肌組織鐵顆粒沉積情況（×400）。5A～5C 分別為實驗組、單純對照組、空白對照組普魯士藍染色結果；箭所示為鐵顆粒沉積。Fig.5 Iron particle deposition of myocardial tissue in experimental group,simple control group and blank control group (×400).5A-5C are the results of Prussian blue staining in experimental group, simple control group and blank control group, respectively; the arrow exhibits the iron particle deposition.

3 討論

本研究構建了USPIO-anti-TGF-β1 靶向探針，通過T2*序列掃描，比較了實驗組、單純對照組及空白對照組注射USPIO-anti-TGF-β1 靶向探針前后的信號變化，結果發(fā)現(xiàn)僅實驗組大鼠心肌給藥前后的信號強度具有顯著差異，而單純對照組及空白對照組給藥前后的信號強度無明顯變化，驗證了MR靶向檢測MF大鼠模型中TGF-β1的表達可行。

3.1 以TGF-β1為靶點構建分子靶向探針

心血管疾病嚴重威脅人類健康，是全球首要死亡原因，而幾乎所有類型的心臟疾病的預后好壞都與MF 程度引起的心臟重構及心臟功能下降密切相關[11-12]。TGF-β1 作為MF 過程中最重要的因子[13]，能夠刺激成纖維細胞的激活和增殖，導致細胞外基質沉積，其表達水平往往與纖維化的嚴重程度密切相關[14]。多項研究表明，TGF-β1 與受體結合后，通過Smads、p38 MAPK 以及ERK 等信號通路誘導成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，產(chǎn)生大量的細胞基質蛋白[15-16]，導致MF。此外，TGF-β1 還可以促進心房纖維化，激發(fā)心房纖顫、遺傳性心肌病及炎癥性心肌病[17-18]。TGF-β1 作用的多樣性及心臟病變的異質性是防治MF的難點，通過TGF-β1的檢測來提高MF的防治水平，具有重要的臨床研究價值。

本研究以前期試驗為基礎[19]，選擇了通過皮下注射ISO 建立大鼠MF 模型[20-21]，通過超聲觀察到模型組大鼠的左室射血分數(shù)及左室短軸縮短率降低，左室質量和左室容積增加，說明本實驗成功建立了大鼠MF 模型，這種建模方法成功率高，并且避免了冠脈結扎的手術風險及高死亡率。

USPIO納米顆粒作為一種陰性對比劑，主要使病灶在T2加權圖像上信號減低。USPIO納米顆粒的表面化學性質可以為特定的生物醫(yī)學應用而定制，可用于MRI、光熱治療和藥物傳遞，與GBCAs相比不但腎毒性低，且具有更廣泛的應用價值[22-24]。USPIO 納米顆粒能夠穿過毛細血管屏障，被單核細胞和巨噬細胞吞噬，從而識別炎癥部位[25]。而巨噬細胞在MF中起著重要作用，如經(jīng)典活化型M1和代替活化型M2的失調可導致過度炎癥和心肌損傷[26-27]。此外，巨噬細胞還可通過分泌細胞因子、生長因子和基質細胞蛋白來促進成纖維細胞的轉化[28]。目前已有研究證實USPIO納米顆?？勺R別心肌炎、心肌梗死及動脈粥樣硬化斑塊的形成[29-31]。抗體靶向探針具有特異性強、敏感性高的特點，是靶向成像研究的主要探針合成方法。本研究在前期研究的基礎上[32]，構建了USPIO-anti-TGF-β1靶向探針，探針表征分析證實性能穩(wěn)定，為靶向TGF-β1表達，進而探索MF的檢測提供了研究基礎。

3.2 USPIO-anti-TGF-β1 可用于在體檢測MF 中TGF-β1的表達

本研究通過采集給藥前后MRI 圖像，可見模型組大鼠給藥前心肌信號尚均勻，未見明顯低信號區(qū)，提示早期纖維化定量在MRI 上敏感性較低，診斷較為困難。單純對照組大鼠注射USPIO 前后信號未見明顯降低，可能是由于模型組大鼠的心肌炎癥反應處于非活躍狀態(tài)或巨噬細胞的吞噬作用較弱[33-35]，未能被巨噬細胞大量攝取，因此通過注射單純USPIO行MRI 掃描診斷MF 存在一定的局限性。而實驗組在注射USPIO-anti-TGF-β1 探針12 h 后MRI 掃描結果顯示心內膜下心肌信號強度明顯減低，提示USPIO-anti-TGF-β1 靶向探針在此部位聚集較多。普魯士藍染色顯示實驗組大鼠心肌中藍色鐵顆粒沉積最多，進一步說明USPIO-anti-TGF-β1 靶向探針在MF 區(qū)域實現(xiàn)大量聚集，這可能是由于探針的靶向作用引起的。組織病理學結果顯示本研究所建的模型組大鼠MF區(qū)域主要位于心內膜下，且該區(qū)域TGF-β1呈明顯高表達，這與MRI 圖像上的低信號改變區(qū)一致，驗證了USPIO-anti-TGF-β1 靶向探針的靶向作用。本研究通過MRI 和病理學相結合，證實MRI 靶向TGF-β1 成像可行，為實現(xiàn)早期MF 的靶向干預提供了堅實的實驗依據(jù)。

3.3 本研究的局限性

本研究尚存在不足之處：（1）納入的樣本量較少，結果可能存在一定的偏差；（2）成像時間僅選擇注射后12 h，僅在各組之間進行了橫向對比，并未將注射靶向探針后不同時間的心肌信號改變進行縱向對比，未來將在更大樣本量的基礎上進一步探究最佳成像時間；（3）實驗組在注射靶向探針后普魯士藍染色所見鐵顆粒沉積量不及TGF-β1表達區(qū)域廣泛，TGF-β1的表達特異性需進一步驗證，通過靜脈注射靶向探針是否有其他器官或組織的攝取有待進一步研究。

4 結論

綜上所述，本研究所構建的USPIO-anti-TGF-β1靶向探針具有良好的穩(wěn)定性，可在體檢測MF 大鼠模型中TGF-β1 的表達，為臨床監(jiān)測TGF-β1 的表達及抗MF治療方案的選擇和療效評估提供了實驗依據(jù)。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無利益沖突。

作者貢獻聲明：馬占龍設計本研究的方案，對稿件重要內容進行了修改，并獲得國家自然科學基金項目的資助；宋夢星起草和撰寫稿件，獲取、分析和解釋本研究的數(shù)據(jù)；夏敏、楊雅雯參與最終病理的獲取，并獲取、分析或解釋本研究的數(shù)據(jù)，對稿件重要內容進行了修改。全體作者均同意發(fā)表最后的修改稿，同意對本研究的所有方面負責，確保本研究的準確性和誠信。